组织工程与重建外科杂志２０１２年４月第８卷第２期
・７３－
・论著・
ｄｏｉ：１０．３９６９，ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－０３６４．２０１２．０２．００４
丹参酮¨Ａ诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡及细胞周期阻滞的实验研究
陈剐
梁奕敏李青峰
【摘要】
目的观察丹参酮ＩＩＡ对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法体外培养人瘢痕疙瘩
成纤维细胞，予含有不同浓度丹参酮ⅡＡ的培养液（分别为０恤ｅＣｍＬ、５０斗ｇ／ｍＬ、１００恤咖Ｌ和２００岫岫Ｌ）进行干预。不
同时间点以ＣＣＫ一８检测细胞增殖活力．流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期的变化。结果
不同浓度丹参酮ＩＩＡ干预
和不同时间干预．对瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖活性、早期凋亡率、细胞周期ＧＯ／Ｇ１期比例的影响，均具有统计学意义
（Ｐ固．００１）。其中２００“咖Ｌ组干预效果最明显。结论丹参酮ＩＩＡ具有抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖，诱导凋亡并阻
滞细胞周期的作用．且干预效果存在浓度依耐性及时问依耐性。【关键词】
瘫痕疙瘩
成纤维细胞丹参酮ⅡＡ细胞凋亡细胞周期
【中图分类号】Ｑ８１３．１＋１【文献标识码】Ａ【文章编号ｌ
１６７３－０３６４（２０１２）０２－００７如５
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Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０２８０，Ｃｈｉｎａ；２Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏ，ＰｌａｓｔｉｃａｎｄＲｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅＳｕｒｇｅｒｙ，ｓ虹撂动面ＮｉｎｔｈＰｅｅｒｌｅ
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【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｋｅｌｏｉｄ；Ｆｉｂｒｏｂｌ嬲ｔ；ＴａｎｓｈｉｎｅｎｅⅡＡ；Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；Ｃｅｌｌ
ｃｙｃｌｅ
瘢痕疙瘩是一种持续生长并超出原皮肤创缘的病理性瘢痕．以成纤维细胞的不断增殖及细胞外基质（特别是胶原）的过度沉积为特征．被视为人类独有的真皮成纤维细胞肿瘤Ｉ旧．现有的治疗方法效果欠佳。复发率极高ｆ删。
近来的研究认为。丹参与黄芪的混合提取物
作者单位：５１０２８０广东省广州市南方医科大学附属珠江医院整形外科（陈刚）；２０００１１上晦市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科（粱奕敏．李青峰）。
通讯作者：李青峰（Ｅ—ｍ＿ｊｌ：ｌｉｑｎｉ可＠ｙａｈ∞．ｃｏｒｎ．ｏｎ）。
（ＣＡＳＥ）可通过调节ＴＧＦ—ｌｊ／Ｓｍａｄ通路。抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、侵袭及胶原合成圈。但ＣＡＳＥ具体成分不明．而丹参酮ＩＩＡ是丹参的主要活性成分之一，具有诱导白血病ＴＨＰ一１细胞、人肝癌细胞、人宫颈癌细胞、人乳腺癌细胞和人结肠癌细胞凋亡的作用ｐ瑚。本实验尝试应用丹参酮ⅡＡ干预瘢痕疙瘩成纤维细胞．观察其对癜痕疙瘩成纤维细胞的增殖，细胞凋亡及细胞周期的影响．以期为临床治疗瘢痕疙瘩提供新的思路．
万方数据
Ｊｏｕｍａｌ０ｆＴｉｓｓｕｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＲｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅＳｕｒｇｅｒｙ，Ａｐｒｉｌ２０１２，Ｖ０１．ＳＮｏ．２
１材料与方法１。１主要试剂及仪器
丹参酮ⅡＡ（上海第一生化药业有限公司）、胎牛血清ＦＢＳ（美国ＢＤ公司）。ＤＭＥＭ高糖培养液（美国Ｇｉｂｃｏ公司）、Ｉ型胶原酶（美国Ｓｉｇｍａ公司）、ＣＣＫ一８（日本Ｄｏｊｉｎｄｏ公司）、胰蛋白酶（美国Ｄｆｆｅｏ公司）、酶联免疫检测仪（美国Ｔｈｅｒｍｏ公司）、Ａｎ．
ｎｅｘｉｎ
Ｖ一兀１＇Ｃ，ＰＩ双染细胞凋亡检测试剂盒（美国
ＢＤ公司）、流式细胞仪（美国ＢＤ公司）。１．２人瘢痕疙瘩成纤维细胞培养
实验所用瘢痕疙瘩材料均来源于上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科（术前经患者同意），术后病理证实与ｌ临床诊断一致。材料来源患者均无长时间外用瘢痕药物史．不伴有肿瘤及其他严重疾病。取材后以胰酶消化法培养瘫痕疙瘩成纤维细胞【堋，第１．２代细胞用于实验。１．３实验分组
实验采用两因素析因设计分组．瘢痕疙瘩成纤维细胞以含有不同浓度丹参酮ⅡＡ的培养液进行干预，干预浓度分别为（Ｏ肛ｇ／ｍＬ、５０／ＬＬｇ／ｍＬ、１００弘ｇ／ｍＬ和２００斗ｇ／ｍｈ）。不同干预时间观察细胞增殖、凋亡及周
期变化，以０斗ｇ／ｍＬ组为对照组，５０灿ｇ／ｍＬ、１００斗ｇ／
ｍＬ和２００斗咖Ｌ为实验组。各组至少重复３次。
１．４
ＣＣＫ一８测定细胞增殖情况
取细胞浓度１．５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ的对数生长期瘢
痕疙瘩成纤维细胞接种于９６孔培养板．每孔接种１００“Ｌ，按分组进行相应干预．培养２４ｈ、４８
ｈ、７２
ｈ、９６ｈ和１２０
ｈ。按照ＣＣＫ一８试剂盒操作说明，更
换普通培养液后，每孔加入１０血的ＣＣＫ一８试剂。
孵育２ｈ，酶联免疫检测仪在４５０ｎｍ波长处测定其光吸收值，吸光值间接反映活细胞数量。根据公式求出增殖抑制率（ＩＲ）。
啡塑号黑筹畿≯堕ｘ１００％
对照组平均ＯＤ位
１．５细胞凋亡检测
上述浓度细胞悬液接种于６孔培养板．每孔接种ｌｍＬ，分别培养２４
ｈ、７２ｈ和１２０
ｈ后．按照Ａｎ．
ｎｅｘｉｎ
Ｖ—ｎＴＣ／ＰＩ双染细胞凋亡检测专用试剂盒的
操作说明书操作，收集细胞，ＰＢＳ洗涤２次，加入
ＡｎｎｅｘｉｎＶ—ＦＩＴＣ试剂５斗Ｌ，１ＸＡｎｎｅｘｉｎＶＢｌａｎｄｉｎｇ
Ｂｕｆｆｅｒ
６０仙Ｌ孵育１０ｍｉｎ后。加入ＰＩ试剂５“Ｌ及
ｌｘＡｎｎｅｘｉｎＶＢｌａｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ１２０
ｐ．Ｌ，混匀。流式细
胞仪检测．分析ＡｎｎｅｘｉｎＶ阳性且ＰＩ阴性细胞所占
万方数据
百分比．即细胞早期凋亡率。根据公式求出早期凋亡增加百分比。
早期凋亡增加辜＝蔓塑堕塑兰等：言；蓦器萼产ｘ１００％
对照组平均凋亡率
１．６细胞周期检测
上述浓度细胞悬液接种于９０ｌｎｎｌ培养皿．每皿接种３ｍＬ。培养２４ｈ、７２ｈ和１２０ｈ后收集细胞。
７０％乙醇固定，４℃保存过夜，ＰＢＳ洗涤．加入２０血
ＲＮａｓｅ，３７ｏＣ孵育３０ｒａｉｎ后，暗处加ＰＩ染液．冰浴
３０
ｍｉｎ，染色后以３００目筛网过滤。调整细胞浓度为ｌｘｌ０９
ｅｅｌｌｓ／ｍＬ，流式细胞仪检测分析．记录每例细胞
样品的Ｇ０／Ｇｌ期、Ｇ２／Ｍ期、Ｓ期细胞百分比。根据公式计算Ｇ０，Ｇ１期细胞增加百分比。
ＧＯ／Ｇ１期细胞增加率＝！！掣ｘ１００％
１－７数据处理及统计学分析方法
用ＳＰＳＳ１３．０进行统计学分析．采用析因设计
方差分析。两两比较采用ＬｓＤ法．尸（０．００１为差异有统计学意义。
２结果
２．１
丹参酮ⅡＡ对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖活性的影响
各实验组瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖活性受到
不同程度抑制，其中２００“ｇ／ｍＬ组干预７２
ｈ、９６ｈ
和１２０ｈ后抑制作用十分明显．其增殖抑制率（ＩＲ）分别为１００％、７６．２９％和７１．７２％。析因设计方差分析结果显示．干预浓度对细胞活性的影响具有统计学意义（Ｐ＜ｏ．００１）．干预时间对细胞活性的影响具有统计学意义（Ｐ＜０．００１）。干预浓度和干预时间的交互作用对细胞活性的影响也有统计学意义（Ｐ＜０．００１）。采用ＬｓＤ方法两两比较．不同干预时间的细胞活性差异均有统计学意义（Ｐ＜０．００１），不同干预浓度的细胞活性差异均有统计学意义（Ｐ＜０．００１）（图１）。２．２丹参酮ⅡＡ诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的情况
各实验组瘢痕疙瘩成纤维细胞的早期凋亡率明显增高．其中２００ｔＬｒｄｍＬ组早期凋亡率增高最为明显，干预１２０ｈ后。早期凋亡率达４１．６２％。早期凋亡增加百分比达ｌ０３０．９８％。析因设计方差分析结果显示．干预浓度对早期凋亡率的影响具有统计学意义（Ｐ＜０．００１）。干预时间对早期凋亡率的影响具有统计学意义（Ｐ＜０．００１），干预浓度和干预时间的交互作用对早期凋亡率的影响也有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．００１）。
组织工程与重建外科杂志２０１２年４月第８卷第２期
采用ＩｓＤ方法两两比较．不同干预时间的早期凋亡率差异均有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．００１）。不同干预浓度的早期凋亡率差异均有统计学意义（Ｐ＜０．００１）（图２．３）。２．３丹参酮ⅡＡ对瘢痕疙瘩成纤维细胞周期的影响
各实验组瘢痕疙瘩成纤维细胞的Ｇ０／Ｇ１期比例均不同程度增加，其中２００仙加ＩｌＬ组Ｇ０／Ｇ１期比例增加最为明显．干预１２０ｈ后．Ｇ０／Ｇ１期均值为９４】６％，增加３８．８２％。干预浓度对Ｇ０／ＧＩ期比例的影响具有统计学意义（Ｐ＜０．００１）．干预时间对Ｇ０／Ｇ１期
干预时间的交互作用对Ｇ０／Ｇ１期比例的影响也有统计学意义（Ｐ＜０．００１）。采用ＬＳＤ方法两两比较．干预时间２４ｈ与７２ｈ、１２０ｈ的Ｇ０／Ｇ１期比例差异均有显著差异（Ｐ＜０．００１）；干预７２ｈ和１２０ｈ比较．Ｇ０／ＧＩ期比例无显著差异（Ｐ－－０．０７）：２００Ｉ，ｇ／ｍＬ组与０Ｉ，ｇ／ｍＬ组、５０［ｘｇ／ｍＬ组、１００斗ｇ／ｍＬ组的ＧＯ／Ｇ１期比例差异均有统计学意义（Ｐ＜０．００１），０ｐ．．ｇ／ｍＬ组与５０峭／ｍＬ
组、Ｊ００ｔＬｇ／ｍＬ组的ＧＯ／ＧＩ期比例差异均有统计学意
义（Ｐ＜０．００１），５０斗ｇ／ｍＬ组与１００；ｚｇ／ｍＬ组的ＧｆｆＧｌ期比例的差异无统计学意义（Ｐ＝Ｏ．９３７）（图４、５）。
比例的影响具有统计学意义（Ｐｍ００１）．干预浓度和
鼠
２４ｈ¨Ｉ卅４８ｈｏｔ，＿７２ｈ¨ｌＪｈ％ｈ¨…．１２０¨ｌｆ“
Ｉ颅ｎ４Ｍ
图ｌ
ＣＣＫ一８剥定各组细胞增殖情况
ｅｘａｍｉｎｅ
围３流式细胞位刹得各组细胞早期凋亡情况
Ｆｉｇ．３
ｒｈｅｃｅｌｌｅａｄｙａｐｏｐｌｏｓｉｓｏｆ
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ｅｘａｍｌｍ，
辩一割
右下象限ＡｎｎｅｘｉｎＶ—Ｆ１Ｔｃ阳性，ＰＩ阴性．为早期鹅亡细胞：左下象限Ａ∞ｅｘｉｎｖ—ＦＩＴＣ厦Ｈ均阴性．为正常细胞：右上象限
Ａｎｎｃ嫡ｎ
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ｐｏｓｉｔｉｖｅ．ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｍｉｄｄｌｅ－ｌａｔｅａｐｏｐＩ懈ｉｓｅｅｌＩｓ
＿Ｊ
ｖ—Ｆ仃℃及ＰＩ均阳性．为中晚期凋亡细胞
ｐｏｓｉｄｖｅａｎｄＰＩｉｓ
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ｎａｇｅｔｉｖｅ，ｍｐ∞ｃｍｅａｒｌｙａｐｏｐｔｏｓｉｓｃｅｌｌｓ；Ｌｅｆｔｌｏｗｅｒ
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ｃ枷Ⅸ
ＡｎｎｅｘｉｎＶ—ｎ１℃ｓａｄＰｌａ＂ｂｏｔｈｎａｇｅｔｉｖｅ．”ｐｒｅｓｅｍｎｏｒｍａｌ
二倍体峰为（Ⅺ／Ｇ１期．四倍体峰为ｃ２珊期．平台部分代表Ｓ期
Ｄｉｐｌｏｉｄｐｅａｋ”ｐｒｅｓｅｎｔＣ４）／ＧＩ
Ｇ２／Ｍｐｈａｓｅ．１Ｉ－ｉｄｄｉｅ
ＩＩｉ小ｔｕｐｐｅｒｑｕａｄｒａｎｔ．ｗｈｅｒｅＡｎｎｅ－ＡｎＶ—ＦＩＴｔ：帅ｄＨａｍｂｏｔｈ陶２藏式翔胞忸检测千硬１２０小时后鲁姐蛔奠疆亡情况
ｐｈａｓｅ．ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ耻ｒｅｐｌ＿ｅｓｅｎｔ
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万方数据
‘７６’
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２０１２，Ｖ０１．８Ｎｏ．２
１００
一舳
曼
霎６０
妻
要柏
善
２０
０
２４ｈｏｕｒｓ
７２ｈｏｕｒｓ
１２０ｈｏｕｒｓ
干预时问
图５漉式细胞仪检调各组细胞周期Ｇ０／Ｇ１期比倒情况ｎ晷５
ｍｅｄｌｃｙｃｌｅＧＯ／ＧＩｐｌｍｓｅｍｆｉｏｏｆ曲曲ｇｒｏｕｐｂｙ
ｆｌｏｗｑｍｍ帕ｔｒｙ
ｅｌｌｌｌｌｌｉ皿ｇ
瘢痕疙瘩是常见疾病，也是临床的治疗难点．其Ｉ型胶原及纤维粘连蛋白过度表达且胶原多肽的降的刺激反应敏感：瘢痕疙瘩成纤维细胞增生及凋亡常成纤维细胞［ｉｓ－１９］。常用的瘢痕疙瘩治疗方法中．５一的原理之一也是增加瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡率本实验中，我们发现丹参酮ⅡＡ干预体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞后．实验组较对照组早期凋因素析因设计方差分析显示．不同浓度丹参酮ⅡＡＩ上ｇ／ｍＬ组干预ｗｄ，ｎＬ组干预７２ｈ后．细胞增殖抑制率最
万方数据
高（１００％）；随后干预至９６ｈ和１２０ｈ后．细胞增殖抑制率降低，分别为７６．２９％和７１，７２％．考虑增殖抑制率的这种下降趋势是由于干预至９６ｈ和１２０
ｈ
后．出现接触抑制所致。
曾有研究将丹参酮ⅡＡ应用于兔耳增生性瘢痕模型中．发现丹参酮ⅡＡ对兔耳增生性瘢痕有明显的抑制作用洲。另据报道。丹参酮ⅡＡ具有抑制胆管来源成纤维细胞增殖及胶原的分泌．并诱导ＭＭＰ－９ｍＲＮＡ的表达而促进胶原降解．抑制胆道瘢痕形成
的作用ｉｒａ］。由此可见，丹参酮ⅡＡ对瘢痕疙瘩和增生性瘢痕均有一定的抑制作用。有研究发现．在瘢痕疙瘩成纤维细胞中。凋亡抑制基因Ｂｃｌ一２异常高表达阑，凋亡诱导基因Ｐ５３表达异常［２７１．信号转导和转录激活蛋白３（ＳＴＡＴ３）过度表达并且磷酸化闭．而丹参酮ⅡＡ已被证实可通过下调Ｂｃｌ一２。激活Ｐ５３．抑制ＳＴＡＴ３，激活Ｃａｓｐａｓｅ一３等多种途径，诱导多种肿瘤细胞的凋亡ｕｔ２９－３１１。因此，考虑丹参酮ⅡＡ可能也是通过下调Ｂｃｌ一２．激活Ｐ５３。抑制ＳＴＡＴ３．激活Ｃａｓ．ｐａｓｅ一３等途径对瘢痕疙瘩成纤维细胞产生干预作用，其具体机制尚有待于迸一步的研究探讨。
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３讨论
难治性和高复发率与瘢痕疙瘩的发病机制密切相关。瘢痕疙瘩成纤维细胞与正常成纤维细胞相比，其解降低，导致细胞外基质过度沉积；ＶＥＧＦ、ＴＧＦ—Ｂ１、ＴＧＦ—Ｂ２等生长因子及ＰＤＧＦ—ａ受体等生长因子受体过度表达，同时瘢痕疙瘩成纤维细胞对生长因子失衡．瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡率要明显低于正氟尿嘧啶注射的治疗原理为诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡和阻滞细胞周期ｉ羽．类固醇注射和放射治疗旧。因此．寻找瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡缺陷机制．并有效诱导其凋亡．对瘢痕疙瘩的治疗具有重要意义１２１－２３１。
亡率明显升高．ＧＯ／Ｇ１期细胞比例明显升高。经两个干预和不同时间干预．对瘢痕疙瘩成纤维细胞的影响均具有统计学意义。高浓度的２００效果最明显．提示丹参酮ⅡＡ对抑制体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖活性、诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期等方面．均呈现干预浓度及干预时间的依耐性。ＣＣＫ一８检测瘢痕疙瘩成纤维细胞活性时发现，２００
组织ｔ程与重建补科杂志２０１２年４月第８卷第２斟
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（收稿日期：２０１２年ｔ月２０日；修回日期：２０１２年３月１日
《组织工程与重建外科》杂志２０１２年征稿、征订通知
《组织工程与重建外科》杂志ｆＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｉｓｓｕｅＥｎｇｉｎｅｅｆｉｎｇ
ａｎｄＲｅｃｏｎ栅ｃ６ｖｅＳｎｒｇｅｒｙ）是由上海交通大学主管、上海变通大
学医学院附属第九人民医院主办的综合性医学学术期刊．国内统一连续出版物号：ｃＮ３１—１９４６Ｐａ，标准刊号：玛ＳＮ１６７３—０３６４。
本刊由中国工程院院士张涤生教授担任名誉主编．中华医学会整形外科分会主任委员、中国生物医学工程学会组织＿亡程分会主任委员曹谊林教授担任主编。本刊是组织工程学和整形莺建外科的专、ｋ学术期刊．报道组织工程及其相关领域、美容外科、颅面外科．眼科、ＥＩ腔颁面外科．四肢显微外科、骨科的临床厦基础研究成果，并及时舟绍整形重建外科重大进展、新技术和新动态．力求科学性、实用性。本编辑部诚征上述相关研究领域文章，欢迎各位专家、学者孵稿。欢迎广大医务人员、科研工作者，相关研究院所、医院母书馆、高等院校图书馆订旧。
本刊创刊于２００５年２月，已成为中国科技论文统计源期刊（中国科技棱心期刊）、中国学术期刊综合评价数据库（ｃＡＪＣＥＤ）统计搋期刊、中国期刊全文数据库（ＣＪＦＤ）全文收录期刊、万肯数据一教字化期刊群收录期刊、中文科技期刊数据库
（全文版）收录期刊。
车刊双月刊．大１６开．卯页，铜版纸彩色印刷，每期定价；ｓ００元，全年６册４８００元。订阅可向本刊编辑部办理（请通过邮局汇孰）。联系方式：上海第九人民医院《组织工程与重建外科杂志》编辑部；地址；上癣市制造局路６３９号ｌ号楼１９１３室；邮政编码：２０００１ｌ；电话：（啦１）２３２７１６９９—５６０２；传真：（０２】）５３０７８０２５；Ｅ－ｍａｉｌ：ｚａｇｃｅｊｗｋ＠ｙａｈｃｏｃｏｍ．ｃｎ。
《组织工程与重建外科）杂志编辑部
万方数据
组织工程与重建外科杂志２０１２年４月第８卷第２期
・７３－
・论著・
ｄｏｉ：１０．３９６９，ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－０３６４．２０１２．０２．００４
丹参酮¨Ａ诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡及细胞周期阻滞的实验研究
陈剐
梁奕敏李青峰
【摘要】
目的观察丹参酮ＩＩＡ对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法体外培养人瘢痕疙瘩
成纤维细胞，予含有不同浓度丹参酮ⅡＡ的培养液（分别为０恤ｅＣｍＬ、５０斗ｇ／ｍＬ、１００恤咖Ｌ和２００岫岫Ｌ）进行干预。不
同时间点以ＣＣＫ一８检测细胞增殖活力．流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期的变化。结果
不同浓度丹参酮ＩＩＡ干预
和不同时间干预．对瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖活性、早期凋亡率、细胞周期ＧＯ／Ｇ１期比例的影响，均具有统计学意义
（Ｐ固．００１）。其中２００“咖Ｌ组干预效果最明显。结论丹参酮ＩＩＡ具有抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖，诱导凋亡并阻
滞细胞周期的作用．且干预效果存在浓度依耐性及时问依耐性。【关键词】
瘫痕疙瘩
成纤维细胞丹参酮ⅡＡ细胞凋亡细胞周期
【中图分类号】Ｑ８１３．１＋１【文献标识码】Ａ【文章编号ｌ
１６７３－０３６４（２０１２）０２－００７如５
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Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｚｈｕｊｉ口ａｇＨｏｓｐｉｔａｌ，ＳｏｕｔｈｅｒｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓ呖
Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０２８０，Ｃｈｉｎａ；２Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏ，ＰｌａｓｔｉｃａｎｄＲｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅＳｕｒｇｅｒｙ，ｓ虹撂动面ＮｉｎｔｈＰｅｅｒｌｅ
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ＴａｎｓｈｉｎａｎｅＩＩＡｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ（Ｐ（ｏ，００１），ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｉｎ
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ａｎｄ
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ｃｅｌｌｃｙｃｌｅｏｆｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｋｅｌｏｉｄ．ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＴａｎｓｈｉｎｏｎｅ
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【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｋｅｌｏｉｄ；Ｆｉｂｒｏｂｌ嬲ｔ；ＴａｎｓｈｉｎｅｎｅⅡＡ；Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；Ｃｅｌｌ
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瘢痕疙瘩是一种持续生长并超出原皮肤创缘的病理性瘢痕．以成纤维细胞的不断增殖及细胞外基质（特别是胶原）的过度沉积为特征．被视为人类独有的真皮成纤维细胞肿瘤Ｉ旧．现有的治疗方法效果欠佳。复发率极高ｆ删。
近来的研究认为。丹参与黄芪的混合提取物
作者单位：５１０２８０广东省广州市南方医科大学附属珠江医院整形外科（陈刚）；２０００１１上晦市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科（粱奕敏．李青峰）。
通讯作者：李青峰（Ｅ—ｍ＿ｊｌ：ｌｉｑｎｉ可＠ｙａｈ∞．ｃｏｒｎ．ｏｎ）。
（ＣＡＳＥ）可通过调节ＴＧＦ—ｌｊ／Ｓｍａｄ通路。抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、侵袭及胶原合成圈。但ＣＡＳＥ具体成分不明．而丹参酮ＩＩＡ是丹参的主要活性成分之一，具有诱导白血病ＴＨＰ一１细胞、人肝癌细胞、人宫颈癌细胞、人乳腺癌细胞和人结肠癌细胞凋亡的作用ｐ瑚。本实验尝试应用丹参酮ⅡＡ干预瘢痕疙瘩成纤维细胞．观察其对癜痕疙瘩成纤维细胞的增殖，细胞凋亡及细胞周期的影响．以期为临床治疗瘢痕疙瘩提供新的思路．
万方数据
Ｊｏｕｍａｌ０ｆＴｉｓｓｕｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＲｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅＳｕｒｇｅｒｙ，Ａｐｒｉｌ２０１２，Ｖ０１．ＳＮｏ．２
１材料与方法１。１主要试剂及仪器
丹参酮ⅡＡ（上海第一生化药业有限公司）、胎牛血清ＦＢＳ（美国ＢＤ公司）。ＤＭＥＭ高糖培养液（美国Ｇｉｂｃｏ公司）、Ｉ型胶原酶（美国Ｓｉｇｍａ公司）、ＣＣＫ一８（日本Ｄｏｊｉｎｄｏ公司）、胰蛋白酶（美国Ｄｆｆｅｏ公司）、酶联免疫检测仪（美国Ｔｈｅｒｍｏ公司）、Ａｎ．
ｎｅｘｉｎ
Ｖ一兀１＇Ｃ，ＰＩ双染细胞凋亡检测试剂盒（美国
ＢＤ公司）、流式细胞仪（美国ＢＤ公司）。１．２人瘢痕疙瘩成纤维细胞培养
实验所用瘢痕疙瘩材料均来源于上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科（术前经患者同意），术后病理证实与ｌ临床诊断一致。材料来源患者均无长时间外用瘢痕药物史．不伴有肿瘤及其他严重疾病。取材后以胰酶消化法培养瘫痕疙瘩成纤维细胞【堋，第１．２代细胞用于实验。１．３实验分组
实验采用两因素析因设计分组．瘢痕疙瘩成纤维细胞以含有不同浓度丹参酮ⅡＡ的培养液进行干预，干预浓度分别为（Ｏ肛ｇ／ｍＬ、５０／ＬＬｇ／ｍＬ、１００弘ｇ／ｍＬ和２００斗ｇ／ｍｈ）。不同干预时间观察细胞增殖、凋亡及周
期变化，以０斗ｇ／ｍＬ组为对照组，５０灿ｇ／ｍＬ、１００斗ｇ／
ｍＬ和２００斗咖Ｌ为实验组。各组至少重复３次。
１．４
ＣＣＫ一８测定细胞增殖情况
取细胞浓度１．５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ的对数生长期瘢
痕疙瘩成纤维细胞接种于９６孔培养板．每孔接种１００“Ｌ，按分组进行相应干预．培养２４ｈ、４８
ｈ、７２
ｈ、９６ｈ和１２０
ｈ。按照ＣＣＫ一８试剂盒操作说明，更
换普通培养液后，每孔加入１０血的ＣＣＫ一８试剂。
孵育２ｈ，酶联免疫检测仪在４５０ｎｍ波长处测定其光吸收值，吸光值间接反映活细胞数量。根据公式求出增殖抑制率（ＩＲ）。
啡塑号黑筹畿≯堕ｘ１００％
对照组平均ＯＤ位
１．５细胞凋亡检测
上述浓度细胞悬液接种于６孔培养板．每孔接种ｌｍＬ，分别培养２４
ｈ、７２ｈ和１２０
ｈ后．按照Ａｎ．
ｎｅｘｉｎ
Ｖ—ｎＴＣ／ＰＩ双染细胞凋亡检测专用试剂盒的
操作说明书操作，收集细胞，ＰＢＳ洗涤２次，加入
ＡｎｎｅｘｉｎＶ—ＦＩＴＣ试剂５斗Ｌ，１ＸＡｎｎｅｘｉｎＶＢｌａｎｄｉｎｇ
Ｂｕｆｆｅｒ
６０仙Ｌ孵育１０ｍｉｎ后。加入ＰＩ试剂５“Ｌ及
ｌｘＡｎｎｅｘｉｎＶＢｌａｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ１２０
ｐ．Ｌ，混匀。流式细
胞仪检测．分析ＡｎｎｅｘｉｎＶ阳性且ＰＩ阴性细胞所占
万方数据
百分比．即细胞早期凋亡率。根据公式求出早期凋亡增加百分比。
早期凋亡增加辜＝蔓塑堕塑兰等：言；蓦器萼产ｘ１００％
对照组平均凋亡率
１．６细胞周期检测
上述浓度细胞悬液接种于９０ｌｎｎｌ培养皿．每皿接种３ｍＬ。培养２４ｈ、７２ｈ和１２０ｈ后收集细胞。
７０％乙醇固定，４℃保存过夜，ＰＢＳ洗涤．加入２０血
ＲＮａｓｅ，３７ｏＣ孵育３０ｒａｉｎ后，暗处加ＰＩ染液．冰浴
３０
ｍｉｎ，染色后以３００目筛网过滤。调整细胞浓度为ｌｘｌ０９
ｅｅｌｌｓ／ｍＬ，流式细胞仪检测分析．记录每例细胞
样品的Ｇ０／Ｇｌ期、Ｇ２／Ｍ期、Ｓ期细胞百分比。根据公式计算Ｇ０，Ｇ１期细胞增加百分比。
ＧＯ／Ｇ１期细胞增加率＝！！掣ｘ１００％
１－７数据处理及统计学分析方法
用ＳＰＳＳ１３．０进行统计学分析．采用析因设计
方差分析。两两比较采用ＬｓＤ法．尸（０．００１为差异有统计学意义。
２结果
２．１
丹参酮ⅡＡ对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖活性的影响
各实验组瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖活性受到
不同程度抑制，其中２００“ｇ／ｍＬ组干预７２
ｈ、９６ｈ
和１２０ｈ后抑制作用十分明显．其增殖抑制率（ＩＲ）分别为１００％、７６．２９％和７１．７２％。析因设计方差分析结果显示．干预浓度对细胞活性的影响具有统计学意义（Ｐ＜ｏ．００１）．干预时间对细胞活性的影响具有统计学意义（Ｐ＜０．００１）。干预浓度和干预时间的交互作用对细胞活性的影响也有统计学意义（Ｐ＜０．００１）。采用ＬｓＤ方法两两比较．不同干预时间的细胞活性差异均有统计学意义（Ｐ＜０．００１），不同干预浓度的细胞活性差异均有统计学意义（Ｐ＜０．００１）（图１）。２．２丹参酮ⅡＡ诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的情况
各实验组瘢痕疙瘩成纤维细胞的早期凋亡率明显增高．其中２００ｔＬｒｄｍＬ组早期凋亡率增高最为明显，干预１２０ｈ后。早期凋亡率达４１．６２％。早期凋亡增加百分比达ｌ０３０．９８％。析因设计方差分析结果显示．干预浓度对早期凋亡率的影响具有统计学意义（Ｐ＜０．００１）。干预时间对早期凋亡率的影响具有统计学意义（Ｐ＜０．００１），干预浓度和干预时间的交互作用对早期凋亡率的影响也有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．００１）。
组织工程与重建外科杂志２０１２年４月第８卷第２期
采用ＩｓＤ方法两两比较．不同干预时间的早期凋亡率差异均有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．００１）。不同干预浓度的早期凋亡率差异均有统计学意义（Ｐ＜０．００１）（图２．３）。２．３丹参酮ⅡＡ对瘢痕疙瘩成纤维细胞周期的影响
各实验组瘢痕疙瘩成纤维细胞的Ｇ０／Ｇ１期比例均不同程度增加，其中２００仙加ＩｌＬ组Ｇ０／Ｇ１期比例增加最为明显．干预１２０ｈ后．Ｇ０／Ｇ１期均值为９４】６％，增加３８．８２％。干预浓度对Ｇ０／ＧＩ期比例的影响具有统计学意义（Ｐ＜０．００１）．干预时间对Ｇ０／Ｇ１期
干预时间的交互作用对Ｇ０／Ｇ１期比例的影响也有统计学意义（Ｐ＜０．００１）。采用ＬＳＤ方法两两比较．干预时间２４ｈ与７２ｈ、１２０ｈ的Ｇ０／Ｇ１期比例差异均有显著差异（Ｐ＜０．００１）；干预７２ｈ和１２０ｈ比较．Ｇ０／ＧＩ期比例无显著差异（Ｐ－－０．０７）：２００Ｉ，ｇ／ｍＬ组与０Ｉ，ｇ／ｍＬ组、５０［ｘｇ／ｍＬ组、１００斗ｇ／ｍＬ组的ＧＯ／Ｇ１期比例差异均有统计学意义（Ｐ＜０．００１），０ｐ．．ｇ／ｍＬ组与５０峭／ｍＬ
组、Ｊ００ｔＬｇ／ｍＬ组的ＧＯ／ＧＩ期比例差异均有统计学意
义（Ｐ＜０．００１），５０斗ｇ／ｍＬ组与１００；ｚｇ／ｍＬ组的ＧｆｆＧｌ期比例的差异无统计学意义（Ｐ＝Ｏ．９３７）（图４、５）。
比例的影响具有统计学意义（Ｐｍ００１）．干预浓度和
鼠
２４ｈ¨Ｉ卅４８ｈｏｔ，＿７２ｈ¨ｌＪｈ％ｈ¨…．１２０¨ｌｆ“
Ｉ颅ｎ４Ｍ
图ｌ
ＣＣＫ一８剥定各组细胞增殖情况
ｅｘａｍｉｎｅ
围３流式细胞位刹得各组细胞早期凋亡情况
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瘢痕疙瘩是常见疾病，也是临床的治疗难点．其Ｉ型胶原及纤维粘连蛋白过度表达且胶原多肽的降的刺激反应敏感：瘢痕疙瘩成纤维细胞增生及凋亡常成纤维细胞［ｉｓ－１９］。常用的瘢痕疙瘩治疗方法中．５一的原理之一也是增加瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡率本实验中，我们发现丹参酮ⅡＡ干预体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞后．实验组较对照组早期凋因素析因设计方差分析显示．不同浓度丹参酮ⅡＡＩ上ｇ／ｍＬ组干预ｗｄ，ｎＬ组干预７２ｈ后．细胞增殖抑制率最
万方数据
高（１００％）；随后干预至９６ｈ和１２０ｈ后．细胞增殖抑制率降低，分别为７６．２９％和７１，７２％．考虑增殖抑制率的这种下降趋势是由于干预至９６ｈ和１２０
ｈ
后．出现接触抑制所致。
曾有研究将丹参酮ⅡＡ应用于兔耳增生性瘢痕模型中．发现丹参酮ⅡＡ对兔耳增生性瘢痕有明显的抑制作用洲。另据报道。丹参酮ⅡＡ具有抑制胆管来源成纤维细胞增殖及胶原的分泌．并诱导ＭＭＰ－９ｍＲＮＡ的表达而促进胶原降解．抑制胆道瘢痕形成
的作用ｉｒａ］。由此可见，丹参酮ⅡＡ对瘢痕疙瘩和增生性瘢痕均有一定的抑制作用。有研究发现．在瘢痕疙瘩成纤维细胞中。凋亡抑制基因Ｂｃｌ一２异常高表达阑，凋亡诱导基因Ｐ５３表达异常［２７１．信号转导和转录激活蛋白３（ＳＴＡＴ３）过度表达并且磷酸化闭．而丹参酮ⅡＡ已被证实可通过下调Ｂｃｌ一２。激活Ｐ５３．抑制ＳＴＡＴ３，激活Ｃａｓｐａｓｅ一３等多种途径，诱导多种肿瘤细胞的凋亡ｕｔ２９－３１１。因此，考虑丹参酮ⅡＡ可能也是通过下调Ｂｃｌ一２．激活Ｐ５３。抑制ＳＴＡＴ３．激活Ｃａｓ．ｐａｓｅ一３等途径对瘢痕疙瘩成纤维细胞产生干预作用，其具体机制尚有待于迸一步的研究探讨。
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３讨论
难治性和高复发率与瘢痕疙瘩的发病机制密切相关。瘢痕疙瘩成纤维细胞与正常成纤维细胞相比，其解降低，导致细胞外基质过度沉积；ＶＥＧＦ、ＴＧＦ—Ｂ１、ＴＧＦ—Ｂ２等生长因子及ＰＤＧＦ—ａ受体等生长因子受体过度表达，同时瘢痕疙瘩成纤维细胞对生长因子失衡．瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡率要明显低于正氟尿嘧啶注射的治疗原理为诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡和阻滞细胞周期ｉ羽．类固醇注射和放射治疗旧。因此．寻找瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡缺陷机制．并有效诱导其凋亡．对瘢痕疙瘩的治疗具有重要意义１２１－２３１。
亡率明显升高．ＧＯ／Ｇ１期细胞比例明显升高。经两个干预和不同时间干预．对瘢痕疙瘩成纤维细胞的影响均具有统计学意义。高浓度的２００效果最明显．提示丹参酮ⅡＡ对抑制体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖活性、诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期等方面．均呈现干预浓度及干预时间的依耐性。ＣＣＫ一８检测瘢痕疙瘩成纤维细胞活性时发现，２００
组织ｔ程与重建补科杂志２０１２年４月第８卷第２斟
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澍［Ｊ１中国临廉靡复．如０２触２１：３３５ｓ一３３５９
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５Ｌ
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（收稿日期：２０１２年ｔ月２０日；修回日期：２０１２年３月１日
《组织工程与重建外科》杂志２０１２年征稿、征订通知
《组织工程与重建外科》杂志ｆＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｉｓｓｕｅＥｎｇｉｎｅｅｆｉｎｇ
ａｎｄＲｅｃｏｎ栅ｃ６ｖｅＳｎｒｇｅｒｙ）是由上海交通大学主管、上海变通大
学医学院附属第九人民医院主办的综合性医学学术期刊．国内统一连续出版物号：ｃＮ３１—１９４６Ｐａ，标准刊号：玛ＳＮ１６７３—０３６４。
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车刊双月刊．大１６开．卯页，铜版纸彩色印刷，每期定价；ｓ００元，全年６册４８００元。订阅可向本刊编辑部办理（请通过邮局汇孰）。联系方式：上海第九人民医院《组织工程与重建外科杂志》编辑部；地址；上癣市制造局路６３９号ｌ号楼１９１３室；邮政编码：２０００１ｌ；电话：（啦１）２３２７１６９９—５６０２；传真：（０２】）５３０７８０２５；Ｅ－ｍａｉｌ：ｚａｇｃｅｊｗｋ＠ｙａｈｃｏｃｏｍ．ｃｎ。
《组织工程与重建外科）杂志编辑部
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