番茄种子消毒方法及愈伤组织诱导的研究
贺静1，高瑞2
（沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁沈阳 110866）
摘要：
以Micro-tom 为材料, 研究了不同种子消毒方法番茄种子萌发的影响以及激素配比对愈伤组织诱导的影响, 结果表明:种子消毒的最好方法是采用３％的次氯酸钠灭菌３min, 发芽率最高86.25%。Micro-tom 最佳的子叶愈伤组织诱导培养基为MS+0.50mg/L IAA+1.00mg/L BA，愈伤组织诱导率分别为81.25%；子叶愈伤组织诱导最佳培养基为MS+0.50mg/L IAA+1.00mg/L BA，愈伤组织诱导率为75.50%。
关键词：番茄；子叶；茎段；愈伤组织；激素；种子消毒；培养基
番茄是世界范围内的重要经济作物，同时在植物生物学研究领域也占有重要地位。首先，由于番茄基因组较小、遗传背景较清楚、易于遗传转化，番茄成为茄科模式植物；其次，番茄具有拟南芥、烟草和水稻等模式植物所不具备的果实成熟现象，因此番茄还是果实发育生物学研究的模式植物。番茄基因组测序工作已于 2005年开始，已经测定的序列公布在
http://solgenomics.net/organism/1/genome 。2011年5月11日，深圳华大基因研究院与荷兰共同启动了“100个番茄基因组研究计划”。番茄功能基因组学研究的大幕正在拉开。
对于功能基因组学和分子生物学研究，遗传转化是必不可少的试验技术。目前番茄转化的主要方法是结合组织培养的农杆菌介导法，因此建立简便、高
效的番茄再生体系，是深入开展番茄生物学研究的重要基础。本文从培养条件、外植体选择、再生中的组织形态学变化、体细胞变异等方面，综述了番茄离体再生的研究进展。
１材料和方法
1.1 药品及试剂
IAA （吲哚乙酸），ZT （玉米素），MS 培养基，琼脂粉，蔗糖，6-BA （6-苄基腺嘌呤），无水乙醇，次氯酸钠，氯化汞（升汞）。
1.2 材料
Micro-tom
1.3 实验方案
1.3.1 无菌实生苗的获得
选取饱满大小一致新鲜的Micro-tom 番茄种子用清水浸泡备，用70%的乙醇消毒种子30s 然后用无菌水冲洗3次，再分别进行以下4个处理。Ａ：0.1%的升汞消毒５min 处理。Ｂ:3%的次氯酸钠消毒５ｍｉｎ处理。Ｃ:0.1％的升汞消毒３min 处理。Ｄ:３％的次氯酸钠消毒３min 。最后无菌水冲洗３次，种子消毒处理后接种于ＭＳ培养基上。每瓶接种3、4个在光照条件下进行培养７ｄ后统计其污染率和发芽率[3-5]
1.3.2愈伤组织的诱导
当种子萌发长出幼嫩子叶时，切取番茄子叶和茎段接种于MS 附加6-BA 1.00mg/L及不同质量浓度IAA 的愈伤组织诱导培养基中，置于黑暗条件下培养，
２０ｄ后统计其愈伤组织诱导率。
２结果与分析
2.1 影响番茄种子萌发的因素
不同消毒方法对番茄种子萌发的影响 表１可以看出，在同时消５min 时，0.1%升汞消过的番茄种子染菌率为０，但芽率也为０；３%次氯酸钠消毒的番茄种子染菌率为０，发芽率仅为33.3%。而在消3min 时，0.1%升汞消毒处理的番茄种子染菌率为０，发芽率为16.7%；３%次氯酸钠消毒处理的番茄种子染菌率为5.6%，芽率为90.4%。可见升汞虽然能完全灭菌，但却抑制了种子萌；同时，消毒时间过长也会使种子失去活性。此可可见，3%次氯酸钠消毒3min 效果最好。
表１ 不同消毒方法对番茄种子无菌萌发的影响
2.2 不同激素配比对番茄愈伤组织形成的影响
2.2.1 不同激素配比对子叶愈伤组织形成的影响
从表2可以看出， Micro-Tom最佳子叶愈伤组织诱导养基是
MS+0.50mg/L IAA+1.00mg/L 6-BA,愈伤组织诱导率为（81.25%）。
表2 不同激素对番茄子叶愈伤组织诱导的影响
2.2.2 不同激素配比对茎段愈伤组织形成的影响
从表3可以看出，对Micro-Tom 番茄而言，MS+0.50mg/L IAA+1.00mg/L 6-BA 培养基愈伤组织诱导效果最好，诱导率为（75.50%）
表3 不同激素配比对番茄茎段愈伤组织诱导的影响
３结论和讨论
3.1 影响番茄种子萌发的因素
3.1.1 浸种时间
种子萌发包括三个阶段 ,首先是吸水膨胀阶段 ,然后是萌动阶段 ,最后是发
芽阶段。一般情况下 ,在做番茄组织培养实验之前最好进行浸种处理 ,这样在播种后种子发芽快 ,相对减少污染的概率。在进行浸种时 ,如果浸种时间过长 ,超过了吸水膨胀阶段 ,已经进入萌动阶段 ,那么 ,在进行种子消毒处理时 ,会因为用次氯酸钠或升汞消毒而将萌动的种子杀死 ,使种子不出芽或出芽率极低。曾做过实验 ,在番茄组织培养前 ,浸种时间超过20h ,种子发芽率极低 ,低于6h 种子发芽较正常慢 2d 左右。所以 ,在做番茄组织培养前 ,浸种时间不要超过 20h ,也不要低于 6h ,一般 15h较适宜。
3.1.2 种子消毒方式和时间
对于种子消毒常用的是用酒精和升汞溶液或者酒精和次氯酸钠溶液。曾多次用这两种方法做实验 ,结果是两种方法的消毒效果都很好。基于这样的结果 ,认为用次氯酸钠比较合适 ,主要是因为升汞对人体有危害。用次氯酸钠溶液消毒 ,如果怕消毒不彻底 ,可以事先搓一下种子 ,将种子表面的绒毛搓掉 ,这样效果更好。酒精消毒时间不要超过1min ,如果用 10 %的次氯酸钠 ,消毒 20min ,20 %的次氯酸钠 ,消毒 10min～l5min 比较合适。
3.2 番茄组织培养中应注意的问题
3.2.1 培养基的灭菌时间
培养基的灭菌时间不能过长 ,灭菌温度不能过高。一般25ml ～150ml 的培养基灭菌时间不要超过 15min ,其中250ml 培养基用 500ml 的三角瓶装 ,100ml 培养基用 250ml三角瓶装。灭菌时间过长营养元素被破坏 ,一般的植物激素或某些营养成分在温度过高时均宜分解 , 灭菌的温度切记不可太高 ,121 ℃～122 ℃即可。
3.2.2 外植体褐变
外植体的褐变是由于组织中的酚类物质经氧化后产生棕褐色的醌类物质造成的。这类物质可抑制细胞中其它酶的活性 ,影响细胞的正常代谢 ,严重时可导致组织的死亡。褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少和多酚氧化酶活性有直接关系 ,番茄是含酚类物质较多的蔬菜 ,这些酚类化合物在完整的组织和细胞中与多酚氧化酶分离存在 ,因而比较稳定。在切割外植体时 ,切口附近的细胞受到伤害 ,其分离效应被打破 ,酚类化合物外溢 ,在溢出过程中与多酚氧化酶接触 ,迅速氧化成褐色的醌类物质和水 ,醌类又与蛋白质发生聚合 ,进一步引起其它酶系统失活 ,从而导致组织代谢活动紊乱 ,生长停滞 ,最终衰老死亡。为了避免或减少褐变 ,一是要选择适宜的外植体 ,所选材料的苗龄、取材部位、材料的大小及外植体受伤害程度等均能对褐变产生影响。一般幼龄材料接种后褐变很轻 ,随着苗龄增长 ,褐变逐渐加重 ,试验发现苗龄较长的子叶和高度分化的真叶容易褐变。试验观察一般选 7d～9d 苗龄的番茄子叶较为适宜 ,此时期的番茄苗子叶已经展平 ,真叶刚刚有 0. 5cm 左右。二是所切的外植体大小也很重要 ,过小易发生褐变。子叶的大小应该不小于 0. 5cm ×0. 5cm ,小于 0. 5cm ×0. 5cm 的子叶褐变严重 ,一般 1cm ×1cm 比较合适。如果切下胚轴 ,长度应是 0. 5cm ～0. 7cm。外植体的受伤害程度直接影响褐变 ,切割时应尽可能减少伤口面积 ,尽量使切口平整。实验发现 , 用刀切割和用剪刀铰的效果都很好 ,但建议用剪刀。因为如果对经验不太丰富的操作人员来说 ,用刀切 ,有时不能一次就完全切下 ,要中间停顿一下或反复" 拉锯" 式切割 ,这样很容易使切口受伤 ,将来外植体产生褐变。另外 ,通过多次连续转移培养也可减少褐化的发生。
3.2.3 污染
番茄组织培养中的污染主要细菌性污染和真菌性污染。细菌性污染的症状是培养材料附近出现粘液状和发酵泡沫状物体 ,或在材料附近的培养基中出现混浊和云雾状痕迹。一般在播种后种子还没发芽前或者是在接种后 1d～2d 即可发现。如果是在播种后在种子周围出现细菌污染 ,一般是种子消毒不彻底 ,解决的办法是延长用 70 %的酒精和 10 %的次氯酸钠的消毒时间。如果是接种后在外植体周围出现细菌污染 ,可能是镊子带菌或操作台及操作人员的手末消毒干净。解决的办法是待超净台开启 15min 后用 70 %的酒精擦洗台面 ,再将镊子蘸取酒精后烧红做到彻底消毒 ,接种时镊子接完一瓶就要消毒一次 ,操作过程中要经常用 75 %的酒精擦洗手部 ,同时尽量不要频繁出入无菌室。真菌性污染主要指霉菌引起的污染 ,一般接种后 3d～8d 才可发现。多数是因为接种室内的空气不洁净 ,超净工作台的过滤装置失效 ,操作不慎等原因引起的 ,此类污染可通过完善操作、培养环境、严格操作程序来克服。如果接种后发现真菌大面积污染 ,原因可能是接种室的孢子过多或超净台的滤布不洁。解决办法是 :更换或清洗滤布 ,用甲醛熏蒸接种室。
3.2.4 玻璃化
玻璃化现象是指在培养过程中材料呈半透明状, 组织结构发育畸形的现象, 又称过度水化。玻璃化的苗由于组织畸形, 分化能力降低, 不易成活, 因此不宜用作继代和移栽的材料。玻璃化虽是组织培养中经常发生的现象, 但迄今为止, 对于玻璃化的成因尚无定论。目前人们认为玻璃苗的形成可能有以下几方面的原因: 一是培养条件对玻璃化的影响很大。例如: 培养基的成分、光照、温度、湿度及透气性。二是玻璃苗的叶绿素含量很低, 因此其光合作用减弱, 物质合成能力下降, 导致发育不良而发生畸形。三是玻璃苗苯丙氨酸解氨酶活性降低, 而这种酶
是植物木质素和纤维素合成途径的关键酶之一, 因而导致粗纤维的含量下降, 细胞壁膨压下降, 水势降低, 细胞吸水过多造成发育不良而发生畸形。解决的办法是:适当提高培养基中蔗糖以及Ca 2+、 Mn2+等离子的浓度; 在长期继代培养中逐步降低细胞分裂素的用量; 在培养过程中控制好温度、湿度, 温度不要过高、湿度不要过大; 适当提高培养基中琼脂的浓度; 适当降低培养基中氨态氮的含量, 提高硝态氮的含量; 改善培养容器的通风换气条件, 选用通气好的封口膜封口。
参考文献：
番茄种子消毒方法及愈伤组织诱导的研究
贺静1，高瑞2
（沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁沈阳 110866）
摘要：
以Micro-tom 为材料, 研究了不同种子消毒方法番茄种子萌发的影响以及激素配比对愈伤组织诱导的影响, 结果表明:种子消毒的最好方法是采用３％的次氯酸钠灭菌３min, 发芽率最高86.25%。Micro-tom 最佳的子叶愈伤组织诱导培养基为MS+0.50mg/L IAA+1.00mg/L BA，愈伤组织诱导率分别为81.25%；子叶愈伤组织诱导最佳培养基为MS+0.50mg/L IAA+1.00mg/L BA，愈伤组织诱导率为75.50%。
关键词：番茄；子叶；茎段；愈伤组织；激素；种子消毒；培养基
番茄是世界范围内的重要经济作物，同时在植物生物学研究领域也占有重要地位。首先，由于番茄基因组较小、遗传背景较清楚、易于遗传转化，番茄成为茄科模式植物；其次，番茄具有拟南芥、烟草和水稻等模式植物所不具备的果实成熟现象，因此番茄还是果实发育生物学研究的模式植物。番茄基因组测序工作已于 2005年开始，已经测定的序列公布在
http://solgenomics.net/organism/1/genome 。2011年5月11日，深圳华大基因研究院与荷兰共同启动了“100个番茄基因组研究计划”。番茄功能基因组学研究的大幕正在拉开。
对于功能基因组学和分子生物学研究，遗传转化是必不可少的试验技术。目前番茄转化的主要方法是结合组织培养的农杆菌介导法，因此建立简便、高
效的番茄再生体系，是深入开展番茄生物学研究的重要基础。本文从培养条件、外植体选择、再生中的组织形态学变化、体细胞变异等方面，综述了番茄离体再生的研究进展。
１材料和方法
1.1 药品及试剂
IAA （吲哚乙酸），ZT （玉米素），MS 培养基，琼脂粉，蔗糖，6-BA （6-苄基腺嘌呤），无水乙醇，次氯酸钠，氯化汞（升汞）。
1.2 材料
Micro-tom
1.3 实验方案
1.3.1 无菌实生苗的获得
选取饱满大小一致新鲜的Micro-tom 番茄种子用清水浸泡备，用70%的乙醇消毒种子30s 然后用无菌水冲洗3次，再分别进行以下4个处理。Ａ：0.1%的升汞消毒５min 处理。Ｂ:3%的次氯酸钠消毒５ｍｉｎ处理。Ｃ:0.1％的升汞消毒３min 处理。Ｄ:３％的次氯酸钠消毒３min 。最后无菌水冲洗３次，种子消毒处理后接种于ＭＳ培养基上。每瓶接种3、4个在光照条件下进行培养７ｄ后统计其污染率和发芽率[3-5]
1.3.2愈伤组织的诱导
当种子萌发长出幼嫩子叶时，切取番茄子叶和茎段接种于MS 附加6-BA 1.00mg/L及不同质量浓度IAA 的愈伤组织诱导培养基中，置于黑暗条件下培养，
２０ｄ后统计其愈伤组织诱导率。
２结果与分析
2.1 影响番茄种子萌发的因素
不同消毒方法对番茄种子萌发的影响 表１可以看出，在同时消５min 时，0.1%升汞消过的番茄种子染菌率为０，但芽率也为０；３%次氯酸钠消毒的番茄种子染菌率为０，发芽率仅为33.3%。而在消3min 时，0.1%升汞消毒处理的番茄种子染菌率为０，发芽率为16.7%；３%次氯酸钠消毒处理的番茄种子染菌率为5.6%，芽率为90.4%。可见升汞虽然能完全灭菌，但却抑制了种子萌；同时，消毒时间过长也会使种子失去活性。此可可见，3%次氯酸钠消毒3min 效果最好。
表１ 不同消毒方法对番茄种子无菌萌发的影响
2.2 不同激素配比对番茄愈伤组织形成的影响
2.2.1 不同激素配比对子叶愈伤组织形成的影响
从表2可以看出， Micro-Tom最佳子叶愈伤组织诱导养基是
MS+0.50mg/L IAA+1.00mg/L 6-BA,愈伤组织诱导率为（81.25%）。
表2 不同激素对番茄子叶愈伤组织诱导的影响
2.2.2 不同激素配比对茎段愈伤组织形成的影响
从表3可以看出，对Micro-Tom 番茄而言，MS+0.50mg/L IAA+1.00mg/L 6-BA 培养基愈伤组织诱导效果最好，诱导率为（75.50%）
表3 不同激素配比对番茄茎段愈伤组织诱导的影响
３结论和讨论
3.1 影响番茄种子萌发的因素
3.1.1 浸种时间
种子萌发包括三个阶段 ,首先是吸水膨胀阶段 ,然后是萌动阶段 ,最后是发
芽阶段。一般情况下 ,在做番茄组织培养实验之前最好进行浸种处理 ,这样在播种后种子发芽快 ,相对减少污染的概率。在进行浸种时 ,如果浸种时间过长 ,超过了吸水膨胀阶段 ,已经进入萌动阶段 ,那么 ,在进行种子消毒处理时 ,会因为用次氯酸钠或升汞消毒而将萌动的种子杀死 ,使种子不出芽或出芽率极低。曾做过实验 ,在番茄组织培养前 ,浸种时间超过20h ,种子发芽率极低 ,低于6h 种子发芽较正常慢 2d 左右。所以 ,在做番茄组织培养前 ,浸种时间不要超过 20h ,也不要低于 6h ,一般 15h较适宜。
3.1.2 种子消毒方式和时间
对于种子消毒常用的是用酒精和升汞溶液或者酒精和次氯酸钠溶液。曾多次用这两种方法做实验 ,结果是两种方法的消毒效果都很好。基于这样的结果 ,认为用次氯酸钠比较合适 ,主要是因为升汞对人体有危害。用次氯酸钠溶液消毒 ,如果怕消毒不彻底 ,可以事先搓一下种子 ,将种子表面的绒毛搓掉 ,这样效果更好。酒精消毒时间不要超过1min ,如果用 10 %的次氯酸钠 ,消毒 20min ,20 %的次氯酸钠 ,消毒 10min～l5min 比较合适。
3.2 番茄组织培养中应注意的问题
3.2.1 培养基的灭菌时间
培养基的灭菌时间不能过长 ,灭菌温度不能过高。一般25ml ～150ml 的培养基灭菌时间不要超过 15min ,其中250ml 培养基用 500ml 的三角瓶装 ,100ml 培养基用 250ml三角瓶装。灭菌时间过长营养元素被破坏 ,一般的植物激素或某些营养成分在温度过高时均宜分解 , 灭菌的温度切记不可太高 ,121 ℃～122 ℃即可。
3.2.2 外植体褐变
外植体的褐变是由于组织中的酚类物质经氧化后产生棕褐色的醌类物质造成的。这类物质可抑制细胞中其它酶的活性 ,影响细胞的正常代谢 ,严重时可导致组织的死亡。褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少和多酚氧化酶活性有直接关系 ,番茄是含酚类物质较多的蔬菜 ,这些酚类化合物在完整的组织和细胞中与多酚氧化酶分离存在 ,因而比较稳定。在切割外植体时 ,切口附近的细胞受到伤害 ,其分离效应被打破 ,酚类化合物外溢 ,在溢出过程中与多酚氧化酶接触 ,迅速氧化成褐色的醌类物质和水 ,醌类又与蛋白质发生聚合 ,进一步引起其它酶系统失活 ,从而导致组织代谢活动紊乱 ,生长停滞 ,最终衰老死亡。为了避免或减少褐变 ,一是要选择适宜的外植体 ,所选材料的苗龄、取材部位、材料的大小及外植体受伤害程度等均能对褐变产生影响。一般幼龄材料接种后褐变很轻 ,随着苗龄增长 ,褐变逐渐加重 ,试验发现苗龄较长的子叶和高度分化的真叶容易褐变。试验观察一般选 7d～9d 苗龄的番茄子叶较为适宜 ,此时期的番茄苗子叶已经展平 ,真叶刚刚有 0. 5cm 左右。二是所切的外植体大小也很重要 ,过小易发生褐变。子叶的大小应该不小于 0. 5cm ×0. 5cm ,小于 0. 5cm ×0. 5cm 的子叶褐变严重 ,一般 1cm ×1cm 比较合适。如果切下胚轴 ,长度应是 0. 5cm ～0. 7cm。外植体的受伤害程度直接影响褐变 ,切割时应尽可能减少伤口面积 ,尽量使切口平整。实验发现 , 用刀切割和用剪刀铰的效果都很好 ,但建议用剪刀。因为如果对经验不太丰富的操作人员来说 ,用刀切 ,有时不能一次就完全切下 ,要中间停顿一下或反复" 拉锯" 式切割 ,这样很容易使切口受伤 ,将来外植体产生褐变。另外 ,通过多次连续转移培养也可减少褐化的发生。
3.2.3 污染
番茄组织培养中的污染主要细菌性污染和真菌性污染。细菌性污染的症状是培养材料附近出现粘液状和发酵泡沫状物体 ,或在材料附近的培养基中出现混浊和云雾状痕迹。一般在播种后种子还没发芽前或者是在接种后 1d～2d 即可发现。如果是在播种后在种子周围出现细菌污染 ,一般是种子消毒不彻底 ,解决的办法是延长用 70 %的酒精和 10 %的次氯酸钠的消毒时间。如果是接种后在外植体周围出现细菌污染 ,可能是镊子带菌或操作台及操作人员的手末消毒干净。解决的办法是待超净台开启 15min 后用 70 %的酒精擦洗台面 ,再将镊子蘸取酒精后烧红做到彻底消毒 ,接种时镊子接完一瓶就要消毒一次 ,操作过程中要经常用 75 %的酒精擦洗手部 ,同时尽量不要频繁出入无菌室。真菌性污染主要指霉菌引起的污染 ,一般接种后 3d～8d 才可发现。多数是因为接种室内的空气不洁净 ,超净工作台的过滤装置失效 ,操作不慎等原因引起的 ,此类污染可通过完善操作、培养环境、严格操作程序来克服。如果接种后发现真菌大面积污染 ,原因可能是接种室的孢子过多或超净台的滤布不洁。解决办法是 :更换或清洗滤布 ,用甲醛熏蒸接种室。
3.2.4 玻璃化
玻璃化现象是指在培养过程中材料呈半透明状, 组织结构发育畸形的现象, 又称过度水化。玻璃化的苗由于组织畸形, 分化能力降低, 不易成活, 因此不宜用作继代和移栽的材料。玻璃化虽是组织培养中经常发生的现象, 但迄今为止, 对于玻璃化的成因尚无定论。目前人们认为玻璃苗的形成可能有以下几方面的原因: 一是培养条件对玻璃化的影响很大。例如: 培养基的成分、光照、温度、湿度及透气性。二是玻璃苗的叶绿素含量很低, 因此其光合作用减弱, 物质合成能力下降, 导致发育不良而发生畸形。三是玻璃苗苯丙氨酸解氨酶活性降低, 而这种酶
是植物木质素和纤维素合成途径的关键酶之一, 因而导致粗纤维的含量下降, 细胞壁膨压下降, 水势降低, 细胞吸水过多造成发育不良而发生畸形。解决的办法是:适当提高培养基中蔗糖以及Ca 2+、 Mn2+等离子的浓度; 在长期继代培养中逐步降低细胞分裂素的用量; 在培养过程中控制好温度、湿度, 温度不要过高、湿度不要过大; 适当提高培养基中琼脂的浓度; 适当降低培养基中氨态氮的含量, 提高硝态氮的含量; 改善培养容器的通风换气条件, 选用通气好的封口膜封口。
参考文献：