新生儿溶血病检测操作SOP
一、 产前诊断
1.夫妇血型检测（微柱凝胶检测法：ABO、Rh(D)血型定型检测卡）
1.1将红细胞稀释至1% 红细胞生理盐水悬液；
1.2撕开微胶卡的封膜，于正定管蓝A、黄B、灰D、Control微柱管反应腔中加入1% 待检 RBC生理盐水悬液各50μl；于反定管白色A、B、O、自身管分别对应加入1.0% A1、B、O型试剂红细胞和待检红细胞生理盐水悬液50μl，再分别加入待检血浆（血清）50μl； 1.3将检测卡室温反应≥10 min,取出，置离心机1000r/min 2min，1800r/min 3 min离心； 1.4取出，判定结果（凝集强度判断详见结果判定示图）。
2.孕妇抗体效价的测定（微柱凝胶检测法：抗人球蛋白检测卡）
2.1孕妇IgG(抗A/抗B)效价
2.1.1取待检血清和2-Me(二巯基乙醇)应用液各0.2ml，充分混匀，37℃水浴2小时（以充分破坏血清中的IgM类抗体）。
2.1.2取4支干净试管排于试管架上；将第一管加入50微升中和血清和1.6毫升低离子介质（原液为1:1稀释，此时稀释倍数为原液的64倍）。
2.1.3 第2－4管中分别加入400微升低离子介质；从第一管中吸出400微升的液体加入第二管，混匀，在从第二管吸出400微升加入第三管混匀，依次倍比稀释。
2.1.4取抗人球蛋白检测卡，撕去铝箔，在4管中个依次加入倍比稀释好的灭活血清50微升和1％的标准红细胞（或父亲红细胞）低离子介质(LIM)悬液50微升。 2.1.5将加好样的检测卡入生科孵育器中孵育15分钟。
2.1.6将孵育好的检测卡放入生科离心机中离心5分钟（1000r/min 2 min，1800r/min 3 min），（离心必须在加样后30分钟内进行）
2.1.7取出，判定结果（凝集强度判断详见结果判定示图） 临床参考值：孕妇IgG(抗A/抗B)效价≤64。 2.2孕妇IgG(抗D)效价测定
2.2.1 确定孕妇为RhD阴性，丈夫为RhD阳性。
2.2.2取待检血清和2-Me(二巯基乙醇)应用液各0.2ml，充分混匀，37℃水浴2小时（孕妇血清与O型RhD阳性红细胞反应盐水法为阳性需要灭活，阴性不需要灭活）。
2.2.3取4支干净试管排于试管架上；将第一管加入50微升中和血清和400毫升低离子介质（灭活血清为1:1稀释，此时稀释倍数为原液的16倍；如不灭活为8倍）。
2.2.4第2－4管中分别加入400微升低离子介质；从第一管中吸出400微升的液体加入第二管，混匀，在从第二管吸出400微升加入第三管混匀，依次倍比稀释。
2.2.5取抗人球蛋白检测卡，撕去铝箔，在4管中个依次加入倍比稀释好的血清50微升和1％的标准红细胞（或父亲红细胞）低离子介质(LIM)悬液50微升。 2.2.6将加好样的检测卡入生科孵育器中孵育15分钟。
2.2.7将孵育好的检测卡放入生科离心机中离心5分钟（1000r/min 2 min，1800r/min 3 min），（离心必须在加样后30分钟内进行）
2.2.8取出，判定结果（凝集强度判断详见结果判定示图）
临床参考值：孕妇IgG(抗D)效价≤16,其血型不合的胎儿溶血病一般较；IgG(抗D)效价≤64时，其血型不合胎儿死胎率增高。
3.孕妇不规则抗体筛查（微柱凝胶检测法：抗人球蛋白检测卡）
3.1取抗人球蛋白检测卡，撕去铝箔，在3管中个依次加入孕妇血清（血浆）50微升和1％的筛选细胞低离子介质(LIM)悬液50微升。
3.2将加好样的检测卡入生科孵育器中孵育15分钟。
3.3将孵育好的检测卡放入生科离心机中离心5分钟（1000r/min 2 min，1800r/min 3 min），（离心必须在加样后30分钟内进行）
3.4取出，判定结果（凝集强度判断详见结果判定示图）
二、新生儿溶血病血型血清学诊断（三项）
1.患儿红细胞直接抗人球蛋白试验（微柱凝胶检测法：抗人球蛋白检测卡）
1.1 取患儿血液，离心，洗涤，取压积红细胞用生理盐水配制成1％的红细胞悬液。 1.2 在抗人球蛋白检测卡上标注患儿的姓名或者编号，撕开卡上的铝箔。 1.3 将50微升1％红细胞悬液加入到相应的孔中。 1.4 离心5分钟（1000r/min 2 min，1800r/min 3 min）。 1.5取出，判定结果（凝集强度判断详见结果判定示图）。
2.患儿红细胞的放散试验（微柱凝胶检测法：抗人球蛋白检测卡）
采集患儿的血液标本，按照所检抗体的不同，使用不同的方法的到放散液（具体操作见附件）。 2.1 取出试剂卡，检测前确保试剂卡及样品完全平衡至室温并标记，撕开试剂卡上的铝箔带，仅暴露试验所需使用的反应腔
2.2 将 50 µL 1% A、B、O红细胞LIM悬液加入相应的反应腔中 。 2.3 向相应的反应腔中加入 100 µL的放散液。
2.4 观察反应腔内的反应物是否混匀，如需要，轻弹微柱。 2.5 将加好样的检测卡入生科孵育器中孵育15分钟。
2.6将孵育好的检测卡放入生科离心机中离心5分钟（1000r/min 2 min，1800r/min 3 min）。 2.7取出，判定结果（凝集强度判断详见结果判定示图）
热放散法：取1ML体积的压积血用盐水至少洗涤三次，最后一次尽量取净，然后和等量或半量的生理盐水混匀，置于56℃孵育10分钟，期间摇动数次，迅速取出3500r/min离心2-3分钟，立即取上清。即热放散液。 酸放散：详细见酸放散试剂盒说明书。 结果判读
3. 游离抗体试验（微柱凝胶检测法：抗人球蛋白检测卡）。
游离试验是新生儿出生后7天内，辅助诊断新生儿溶血病的试验。单纯游离试验阳性，不能诊断IgG抗体已经致敏新生儿红细胞。
3.1 取出试剂卡，使用前确保试剂卡完全平衡到室温。 3.2 分别向反应柱内加入50ul 1%A、B、O红细胞LIM悬液。
3.3 最后向反应柱内加入100 ul婴儿血清或血浆。注，加样时，枪头请勿触碰微柱管壁。 3.4 观察柱中的反应物各组分是否混匀，必要时轻弹几下微柱充分，使反应物混匀。 3.5 将加好样的检测卡入生科孵育器中孵育15分钟。
3.6将孵育好的检测卡放入生科离心机中离心5分钟（1000r/min 2 min，1800r/min 3 min）。 2.7取出，判定结果（凝集强度判断详见结果判定示图）。 结果判读
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新生儿溶血病检测操作SOP
一、 产前诊断
1.夫妇血型检测（微柱凝胶检测法：ABO、Rh(D)血型定型检测卡）
1.1将红细胞稀释至1% 红细胞生理盐水悬液；
1.2撕开微胶卡的封膜，于正定管蓝A、黄B、灰D、Control微柱管反应腔中加入1% 待检 RBC生理盐水悬液各50μl；于反定管白色A、B、O、自身管分别对应加入1.0% A1、B、O型试剂红细胞和待检红细胞生理盐水悬液50μl，再分别加入待检血浆（血清）50μl； 1.3将检测卡室温反应≥10 min,取出，置离心机1000r/min 2min，1800r/min 3 min离心； 1.4取出，判定结果（凝集强度判断详见结果判定示图）。
2.孕妇抗体效价的测定（微柱凝胶检测法：抗人球蛋白检测卡）
2.1孕妇IgG(抗A/抗B)效价
2.1.1取待检血清和2-Me(二巯基乙醇)应用液各0.2ml，充分混匀，37℃水浴2小时（以充分破坏血清中的IgM类抗体）。
2.1.2取4支干净试管排于试管架上；将第一管加入50微升中和血清和1.6毫升低离子介质（原液为1:1稀释，此时稀释倍数为原液的64倍）。
2.1.3 第2－4管中分别加入400微升低离子介质；从第一管中吸出400微升的液体加入第二管，混匀，在从第二管吸出400微升加入第三管混匀，依次倍比稀释。
2.1.4取抗人球蛋白检测卡，撕去铝箔，在4管中个依次加入倍比稀释好的灭活血清50微升和1％的标准红细胞（或父亲红细胞）低离子介质(LIM)悬液50微升。 2.1.5将加好样的检测卡入生科孵育器中孵育15分钟。
2.1.6将孵育好的检测卡放入生科离心机中离心5分钟（1000r/min 2 min，1800r/min 3 min），（离心必须在加样后30分钟内进行）
2.1.7取出，判定结果（凝集强度判断详见结果判定示图） 临床参考值：孕妇IgG(抗A/抗B)效价≤64。 2.2孕妇IgG(抗D)效价测定
2.2.1 确定孕妇为RhD阴性，丈夫为RhD阳性。
2.2.2取待检血清和2-Me(二巯基乙醇)应用液各0.2ml，充分混匀，37℃水浴2小时（孕妇血清与O型RhD阳性红细胞反应盐水法为阳性需要灭活，阴性不需要灭活）。
2.2.3取4支干净试管排于试管架上；将第一管加入50微升中和血清和400毫升低离子介质（灭活血清为1:1稀释，此时稀释倍数为原液的16倍；如不灭活为8倍）。
2.2.4第2－4管中分别加入400微升低离子介质；从第一管中吸出400微升的液体加入第二管，混匀，在从第二管吸出400微升加入第三管混匀，依次倍比稀释。
2.2.5取抗人球蛋白检测卡，撕去铝箔，在4管中个依次加入倍比稀释好的血清50微升和1％的标准红细胞（或父亲红细胞）低离子介质(LIM)悬液50微升。 2.2.6将加好样的检测卡入生科孵育器中孵育15分钟。
2.2.7将孵育好的检测卡放入生科离心机中离心5分钟（1000r/min 2 min，1800r/min 3 min），（离心必须在加样后30分钟内进行）
2.2.8取出，判定结果（凝集强度判断详见结果判定示图）
临床参考值：孕妇IgG(抗D)效价≤16,其血型不合的胎儿溶血病一般较；IgG(抗D)效价≤64时，其血型不合胎儿死胎率增高。
3.孕妇不规则抗体筛查（微柱凝胶检测法：抗人球蛋白检测卡）
3.1取抗人球蛋白检测卡，撕去铝箔，在3管中个依次加入孕妇血清（血浆）50微升和1％的筛选细胞低离子介质(LIM)悬液50微升。
3.2将加好样的检测卡入生科孵育器中孵育15分钟。
3.3将孵育好的检测卡放入生科离心机中离心5分钟（1000r/min 2 min，1800r/min 3 min），（离心必须在加样后30分钟内进行）
3.4取出，判定结果（凝集强度判断详见结果判定示图）
二、新生儿溶血病血型血清学诊断（三项）
1.患儿红细胞直接抗人球蛋白试验（微柱凝胶检测法：抗人球蛋白检测卡）
1.1 取患儿血液，离心，洗涤，取压积红细胞用生理盐水配制成1％的红细胞悬液。 1.2 在抗人球蛋白检测卡上标注患儿的姓名或者编号，撕开卡上的铝箔。 1.3 将50微升1％红细胞悬液加入到相应的孔中。 1.4 离心5分钟（1000r/min 2 min，1800r/min 3 min）。 1.5取出，判定结果（凝集强度判断详见结果判定示图）。
2.患儿红细胞的放散试验（微柱凝胶检测法：抗人球蛋白检测卡）
采集患儿的血液标本，按照所检抗体的不同，使用不同的方法的到放散液（具体操作见附件）。 2.1 取出试剂卡，检测前确保试剂卡及样品完全平衡至室温并标记，撕开试剂卡上的铝箔带，仅暴露试验所需使用的反应腔
2.2 将 50 µL 1% A、B、O红细胞LIM悬液加入相应的反应腔中 。 2.3 向相应的反应腔中加入 100 µL的放散液。
2.4 观察反应腔内的反应物是否混匀，如需要，轻弹微柱。 2.5 将加好样的检测卡入生科孵育器中孵育15分钟。
2.6将孵育好的检测卡放入生科离心机中离心5分钟（1000r/min 2 min，1800r/min 3 min）。 2.7取出，判定结果（凝集强度判断详见结果判定示图）
热放散法：取1ML体积的压积血用盐水至少洗涤三次，最后一次尽量取净，然后和等量或半量的生理盐水混匀，置于56℃孵育10分钟，期间摇动数次，迅速取出3500r/min离心2-3分钟，立即取上清。即热放散液。 酸放散：详细见酸放散试剂盒说明书。 结果判读
3. 游离抗体试验（微柱凝胶检测法：抗人球蛋白检测卡）。
游离试验是新生儿出生后7天内，辅助诊断新生儿溶血病的试验。单纯游离试验阳性，不能诊断IgG抗体已经致敏新生儿红细胞。
3.1 取出试剂卡，使用前确保试剂卡完全平衡到室温。 3.2 分别向反应柱内加入50ul 1%A、B、O红细胞LIM悬液。
3.3 最后向反应柱内加入100 ul婴儿血清或血浆。注，加样时，枪头请勿触碰微柱管壁。 3.4 观察柱中的反应物各组分是否混匀，必要时轻弹几下微柱充分，使反应物混匀。 3.5 将加好样的检测卡入生科孵育器中孵育15分钟。
3.6将孵育好的检测卡放入生科离心机中离心5分钟（1000r/min 2 min，1800r/min 3 min）。 2.7取出，判定结果（凝集强度判断详见结果判定示图）。 结果判读
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