第四讲 乳酸菌及益生菌种类的功能及具有生物活性的次生代谢产物
一、 乳酸菌及益生菌
1、 定义及分类
（1）乳酸菌
（2）益生菌
2．生物活性
3．生长特性及应用、产品开发
二、 生物活性的次生代谢产物
1、细菌素
（1） 定义及种类
（2） 特性
Nisin是正常菌群中某些种类的乳酸乳球菌合成和分泌的一种对大多数G+菌有强大杀灭作用的细菌素。Nisin对营养细胞的作用主要是在细胞膜上，它可以抑制细菌细胞壁中肽聚糖的生物合成，使细胞质膜和磷脂化合物的合成受阻，从而导致细胞内物质外泄，甚至引起细胞裂解。作为一种天然的生物性食品防腐剂和抗菌添加剂，Nisin已广泛应用于乳制品、罐头食品、高蛋白食品及饲料工业中。添加400IU/g的产品储存11天，其含菌数比对照组低4个对数期，产品的感官可接受性较高。Nisin对乳酸菌株的影响也较大，如控制适宜的添加量(一般在5-100mg/kg)，能对某些乳酸菌株有明显的抑制作用，造成菌株的活力下降、产酸受抑、生长不良，但乳酸菌总数变化不大。
nisin的研究现状
乳链菌肽是由乳酸乳球菌产生的由基因编码的多肽抗生素，含有34个氨基酸残基，分子中含有5种稀有氨基酸，即氨基丁酸（ABA）、脱氢丙氨酸(DHA)、β-甲基脱氢丙氨酸（DHB）、羊毛硫氨基酸（ ALA-S-ALA）和β-甲基羊毛硫氨基酸（ALA-ABA），它们通过硫醚键形成五个内环。
乳链菌肽的抑菌谱包括营养体和芽孢，对葡萄球菌、梭菌、芽孢杆菌和利斯特菌有强烈的抑制作用，对酵母和霉菌没有作用。迄今为止，乳链菌肽已在全世界约60多个国家和地区被用作食品防腐剂]。我国对乳链菌肽的研究始于1989年，中国科学院微生物研究所在国家自然科学基金项目和中国科学院“八五”重点科研基金项目资助下，完成了对乳链菌肽的基础研究，研究成果现已批量生产，投放市场。1992年3月29日，我国卫生部食品监督部门签发了乳链菌肽在国内的使用合格证明，同时将乳链菌肽列入1992年10月1日实施的国标GB2760-86中的增补品种，可用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品和肉制品的保藏中。乳链菌肽用于食品中的优点是安全无毒，它的LD50约为7000Kg，允许使用的最大剂量是33000IU/Kg，乳链菌肽是一种短肽，可以被体内的α-胰凝乳蛋白酶降解；不影响食品的色香味；在食品加工中可以降低杀菌温度、减少热处理时间，改变食品的营养价值、风味和结构等性状。国内外的研究者在对乳链菌肽的分子结构、分子形成过程、物理化学性质、抗菌机理和毒性等进行了广泛的研究
产nisin菌株在发酵食品中的应用
在干酪中的应用
早在1951Hirsch等研究发现nisin产生菌乳酸乳球菌乳酸亚种在Swiss型干酪中抑制厌
氧产气芽孢的形成。nisin最早应用于干酪的防腐，也是目前乳制品应用中的一个主要方面。在干酪加工的过程中，虽经过高温灭菌，但仍会有耐热性的革兰氏阳性菌孢子（如肉毒梭状菌和厌氧的梭菌芽孢）存在，乳酸链球菌肽可有效地阻止这些孢子的萌发和毒素的形成，有报道说，将nisin抗性株和nisin产生菌混合用于干酪发酵剂，可使优质产品率达90%以上，而用常规的方法仅有41%。学者们在这方面进行了大量的研究，nisin产生菌在干酪中应用的主要限制是生长缓慢和产酸率低。Exterkate等（1976）产酸率低主要原因是缺乏蛋白酶系统。是这些nisin产生菌只能利用乳中的可溶性含氮化合物。Roberts等（1992）用电穿空法将质粒pFG010引入乳酸乳球C2中使其产生nisin抗性和红霉素抗性，然后将其与nisin产生菌混合发酵，以期改变干酪的产酸度，但并未取得成功，由于这个质粒译码的抗性新陈代谢导致nisin失活。Roberts等（1992）通过筛选发酵蔗糖nisin产生菌菌株获得一株自发突变的蛋白酶阳性菌株NCDO1404，用1%的NCDO1404和0.5%JS102混合用于cheddar干酪发酵，使产酸率提高，达到干酪的酸度要求，干酪中大约700IU/g的nisin。此后，Roberts等（1993）又将用nisin产生菌制作的干酪用于巴氏杀菌的干酪酱的一种配料成份，结果低湿度在22和37℃,高湿度在22℃贮存时，延长了货架期。Berg等（1998）对Manchego干酪在成熟期间产nisin的乳酸乳球菌乳酸亚种ESI515对Listeria Innocua的抑制性进行了研究，发现成熟60天后，产nisin的发酵剂发酵干酪中L.innocua比不产nisin发酵剂酵的干酪细菌总数少约10个。Rodríguez等(2001)等通过杂交的方法获得一株nisin产生菌菌株TAB50，并将其用于抑制半硬质干酪中单核增生性李斯特菌。Maisnier-patin等（1992）也将其用于Camember干酪中。Rodríguez等（1998）将其用于Manchego干酪均证明对李斯特菌有良好抑制作用。使用产乳酸链球菌的作为发酵剂用于干酪的生产能达到抑菌的目的，其风味并未受到影响。Abdelghani等（2001）将nisin产生菌与其他乳酸菌用于Hispßânico干酪的发酵发现加入nisin产生菌与不加产nisin发酵剂的干酪的pH值没有差别，菌落总数低。每1Kg接种1.0gnisin产生菌发酵的干酪在成熟45天后，其蛋白水解度和游离氨基酸的数量分别是不加产nisin发酵剂的干酪的1.8倍和2.7倍，疏水的肽降低，3-甲基-1-丁醛、丁二酮和乙酰甲基甲醇浓度增加，干酪风味更好。
在泡菜中的应用
Harris等（1992）将nisin产生菌乳酸乳球菌NCK401和nisin抗性的Leuconostoc mesenteroides NCK293混合用于泡菜的发酵中。泡菜在最初发酵阶段是异型发酵的L占主导地位，由于L对酸敏感，随着酸度的上升，L迅速死亡，在发酵的后期是植物乳杆菌占主导。这种微生物生长顺序使泡菜具有特殊的风味和香味，然而，在大批量的生产中，泡菜的这种自然发酵主要信赖于原料的微生物种群。微生物的生长顺序受到生产条件的影响。因此，很难扩大生产并维持泡菜质量的稳定。乳酸乳球菌NCK401产生的nisin可以在初期抑制L以外的其它微生物的生长，而不影响LNCK293的生长繁殖。在混合发酵剂中100AU /ml的nisin轻微抑制植物乳杆菌ATCC14917。600AU/ml可以完全抑制株菌的发酵。由于后期的同型发酵是泡菜发酵中必不可少的，因此从实践的观点来看nisin并不是消除植物乳杆菌的生长。通过实验将乳酸乳球菌和L比例定为10:1。这种泡菜在含有2%的NaCl在20℃发酵获得了较高质量。
在酸奶中应用
与干酪相比，nisin产生菌用于酸奶的发酵的研究应用较少，只有Kalra等（1975）研究3[13]4]
了nisin产生菌与其它菌株混合发酵来阻止酸奶中酸的增加，以后他又研究了乳酸菌对nisin的敏感性，及nisin产生菌对其他普通发酵剂的影响。
nisin产生菌在干酪中的应用已取得了可喜的成功，在泡菜和酸奶的应用中也有了初步的研究。到目前为止，还未见产nisin的乳酸乳球菌用于其他发酵食品中，如果将nisin产生菌与其他nisin抗性菌株用于发酵食品中，可以抑制其它不需要的微生物的生长，减少或不必添加防腐剂，改善品质，延长保质期。国内将产nisin的菌株用于发酵食品中还未见报道。随着对nisin产生菌的特性的进一步的研究，产nisin的菌株在发酵食品中的应用必将大放异彩。
2、乳酸菌胞外多糖的研究进展
多糖是近年来兴起的一个研究热点，掀起了继蛋白质和核酸之后的又一生物大分子的研究热潮。人们之所以如此重视它，是因为它在生物体内所起的复杂且重要的生理作用。近年来，由于许多发达国家诸如美国、日本和欧洲等对多糖研究的重视，使得这方面的研究取得了不少进展，使得人们对它有了更深的了解（顾瑞霞，2000）。
多糖是高度水合的聚合物，由重复单元（由单糖组成）以糖苷键链接而成，分为同聚多糖和杂多糖，其分子上还可以带有无机分子和有机分子的取代基。多糖是一些变化多端的生物大分子，因为不但组成它们的单糖单位可以变化，而且这些单糖单位的链接方式也不定。单糖上存在一些羟基，可以形成糖苷键，这就意味着任何两个单糖就可以以多种位置相连。与之相比，任何两个氨基酸只能以两种方式链接成二肽。此外，多糖中还存在许多支链，以及无几分子和有机分子的取代基，致使其结构尤为复杂（Roberts，1995）。由此可见，复杂的多糖必定与复杂的生命现象关系密切。
生物界中，动物、植物和微生物都是多糖的丰富来源。微生物的胞外多糖尤为重要。微生物多糖包括某些细菌、真菌和蓝藻类产生的多糖，主要以三种形式存在：
粘附在细胞表面上 ；分泌到培养基中 ;构成细胞的成分 。
微生物多糖，因其安全无毒、理化性质独特等优良性质而倍受关注 。微生物多糖包括胞内多糖、胞壁多糖和胞外多糖 。胞外多糖是由微生物大量产生的多糖 ，易与菌体分离 ，可通过深层发酵实现工业化生产 。据Ｄ.Ｅ.Ｅveleigh统计 ，已经发现 49属 76种微生物产生胞外多糖 ,但真正有应用价值并已进行或接近工业化生产的仅十几种 。
近几年 ,随着对微生物多糖研究的深入 ,世界上微生物多糖的产量和年增长量均在 1 0 %以上 。而一些新型多糖年增长量在3 0 %以上 。到目前为止 ,已大量投产的微生物胞外多糖主要有黄原胶 (Xanthangum)、结冷胶 (Gellangum)、小核菌葡聚糖 (Scleeroglucan)、短梗霉多糖 (Pullulan)、热凝多糖 (Curdlan)等 。微生物多糖具有植物多糖不具备的优良性质 ，它们生产周期短 ，不受季节、地域和病虫害条件限制 ，具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景 。
目前 ,许多微生物多糖已作为胶凝剂、成膜剂、保鲜剂、乳化剂等 。广泛应用于食品、制药、石油、化工等多个领域 。据估计 ，全世界微生物多糖年加工业产值可达 50～ 1 0 0亿美元（魏培莲，2002）。
近年来，人们越来越关注乳酸菌产生的胞外多糖，因为乳酸菌是公认的有益菌，所以它们产生的胞外多糖也具有GRAS（普遍认为是安全的）地位（De Vuysthe 和Degeest 1999）。用能产生胞外多糖的乳酸菌发酵乳，即使只产生少量的胞外多糖（60－400mg/L），也可使发酵物具有粘稠的质地（Cerning 1990）。此外，胞外多糖还可以改善发酵乳的质地，使其质地象奶油一样光滑细腻（Macura 和Townsley 1984），并且还能减少酸奶的乳清析出和胶体
断裂，从而成为酸奶稳定剂的替代品。一些报道还称乳酸菌胞外多糖具有优良的生物学特性，如免疫活性（Oda et al. 1984）。综上所述，乳酸菌胞外多糖具有很广阔的发展前景。
有关乳酸菌胞外多糖的物化特性及生物合成，研究者进行了深入探索，本文综述了这些方面的研究进展。
乳酸菌胞外多糖的组成和结构
乳酸菌胞外多糖是一个广义的概念，细分为荚膜多糖（包围在菌体周围）和黏质多糖（释放都培养基质中的胞外多糖）。目前研究的分泌胞外多糖的乳酸菌大多来源于乳制品，例如酸奶及发酵剂、开菲尔粒，也有源于发酵肉的（Van Den Berg et al. 1995）。常见分泌胞外多糖的乳酸菌有：德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lb.bulgaricus）、嗜热链球菌（S.thermophilus）、干酪乳杆菌干酪亚种（Lb.casei ssp. casei）、马乳酒样乳杆菌（Lb.kefiranofaciens）、嗜酸乳杆菌（Lb.acidophilus）、清酒乳杆菌（Lb.sake0-1）、乳酸乳球菌乳脂亚种（Lc.lactis ssp.cremoris）、乳酸乳球菌（Lc.lactis）和肠膜明串珠菌（Leuc.mesenteroides）。
乳酸菌分泌的胞外多糖的特性与其结构和组成有很大的相关性。目前，研究者普遍认为由乳酸菌分泌的多糖是中性异型多糖（即分泌到细胞壁或培养介质中的多糖）；分子量在0.5×106到2×106之间，研究显示纯胞外多糖的溶液的黏度主要取决于其平均分子量（Van den Berg et al. ,1995）。
对各种乳酸菌分泌的胞外多糖的单糖组成研究表明，大多是由摩尔比例不同的葡萄糖和半乳糖组成（Cerning et al. 1990,1995），除此之外，还有鼠李糖（Cerning et al. 1986,1988；Nakajime et al. 1990,1992；Gruter et al. 1993；Grobben et al. 1995），甘露糖（Petit et al. 1991），果糖（Manca de Nadra et al. 1985），阿拉伯糖和棉子糖（Cerning et al. 1988,1992），或者糖的衍生物，诸如N-乙酰半乳糖胺（Doco et al. 1990；Petit et al. 1991）和N-乙酰葡萄糖胺（Cerning et al. 1994）。Ariga et al.（1992）分离出来一个完全不同的胞外多糖，由S.thermophilus OR901产生，由L-鼠李糖和D-半乳糖以1.00:1.47比例组成；Lact.casei CG11产生的杂多糖组成主要是葡萄糖（约占75%）和鼠李糖（约占15%）（Kojic et al. 1992），此外还有数量很少的半乳糖和甘露糖（Cerning et al. 1992）。目前尚待明确的是EPS的单糖组成是不是胞外多糖溶液和发酵乳饮品的流动学特性的影响因素。许多研究者还发现同一菌属的不同亚种分泌的胞外多糖差异很大。即使同一菌株，其培养条件不同，也会分泌不同的胞外多糖，所产生的胞外多糖的差异在于分子量的不同和单糖摩尔比例的不同，其组成的单糖大致不变。
直到目前为止，可以推定的是，胞外多糖的功能特性受其结构的影响（Sutherland ,1994）。研究显示胞外多糖是由分支的重复单元组成，含有α-和β-链接。在1989到1990年间，Doco et al.首次报道了由三株S.thermophilus分泌的胞外多糖的结构，发现它是由D－半乳糖、D－葡萄糖和2－乙酰胺－2－脱氧－D－半乳糖以摩尔比2：1：1组成，其四糖重复单元的结构如下：
→3）－β-D－Galp－(1→3)－β-D－Glup－(1→3)－α-D－Galp NAC－(1→
6
↑
α-D－Galp 1
Lemoine(1995)研究了S.thermophilusSFi12产生的胞外多糖结构，表明其含有一个六糖结构的重复单元，如下：
→2-α-L-Rhap-(1→2)-α-D-Galp-(1→3)-α-D-Glup-(1→3)-α-D-Galp-(1→3)- α-L-Rhap-(1→
4
↑
β-D-Galp 1
乳酸菌分泌的胞外多糖的功能性与其结构的关系密切，研究者大都认为以键β-(1→2)为主链的葡聚糖，半乳糖和甘露糖具有一定的抑制肿瘤的活性，而β-(1→3)为主链的葡聚糖，含有(1→6)支链的多糖，有的有抗肿瘤的活性，有的没有抗肿瘤的活性或者活性不高。（顾瑞霞，2000）目前，乳酸菌胞外多糖的结构与功能性之间的关系仍然处于模糊状态，需要进一步的研究。
乳酸菌胞外多糖的生物合成
在许多情况下，细菌胞外多糖在毒性中起重要作用，由此驱动了有关细菌胞外多糖的生物合成的研究（Roberts 1995）。因此，G（-）致病菌如大肠杆菌、沙门氏菌和流行热嗜血杆菌等中的胞外多糖的生物合成就相对地明确。在这些G（-）致病菌中，基本重复单元首先在细胞膜上形成，接着二磷酸核糖前体被传送到异戊二烯脂载体上（Sutherland 2001）。一旦这些重复单元聚集，那么脂连中间体就被位移穿过细胞膜，在细胞外聚合，形成胞外多糖，它既可以荚膜的形式共价结合到细胞表面，又可被释放到培养基质中作黏质。
对乳酸菌合成胞外多糖所涉及的基因的研究，及与G（-）致病菌同源性的比较，都明确显示了这些菌合成胞外多糖的细胞机制与G（-）致病菌系统类似，都需要脂连中间体。Stingele 等（1999）研究表明Streptococcous thermophilusSFi6中胞外多糖的生物合成需要一个脂载体，组成多糖的基本重复单元的单糖汇集在这个脂载体上。第一步由1－磷酸半乳糖苷转移酶催化，将磷酸半乳糖连到磷酸脂载体上，随后其它三个糖苷转移酶催化，依次将N-乙酰半乳糖胺、葡萄糖和一个分支的半乳糖部分连到上面。依次而论，乳酸菌胞外多糖的合成是一个耗能的过程，涉及许多酶，产生核糖前体，一个1-磷酸糖苷转移酶转移第一个糖基团，连到磷酸化的脂载体上，一个和更多的转移酶依次催化添加新的糖基，以增加重复单元，其它的酶参与eps基因调控，膜转位和聚合/确定链长度的功能（Lamothe 等2002）。
G（-）和G（＋）菌合成胞外多糖所涉及的各种酶之间存在同源氨基酸，表明它们经历相似的机制，但这种假设仍有待实验验证。有关乳酸菌胞外多糖的生物合成的知识仍十分欠缺，仍有待进一步的研究。
影响乳酸菌胞外多糖合成的因素
产EPS乳酸菌诸如S.thermophilus和Lb.bulgaricus等分泌胞外多糖的量不高，这就为进一步研究胞外多糖与乳蛋白、黏度、流变特性之间关系以及其功能性设置了障碍。对此，国内外的许多研究者对乳酸菌分泌胞外多糖的影响因素进行了大量研究工作。乳酸菌分泌胞外多糖的能力受培养条件（温度、PH值和培养基）的影响很大。大多数产黏菌在所有生长条件都能分泌胞外多糖，但是分泌量最高却是在确定培养介质中，在特定的生长时期产生的（Cowie ,O.N. 1993）。所有促进或减弱生长的因素都影响着胞外多糖前体的胞外浓度，从而影响胞外多糖的合成，在生长期改变糖的性质和浓度均能使胞外多糖的性质或数量或者二者兼而有之发生变化。许多研究者指出，用一个化学确定的培养介质，含有确定的碳源、矿物质、氨基酸、维生素和核酸，可以更好地研究影响乳酸菌生长和分泌胞外多糖所需要的营养因子，代谢途径和胞外多糖的生物合成，并且对研究如何提高产黏菌分泌胞外多糖的数量和质量以及控制胞外多糖的生物合成尤为重要。
有关增产因子对胞外多糖产量的影响存在许多矛盾之处。Garcia-Garibay（1991）研究表明，当向培养Lb.bulgaricus的脱脂乳培养液中添加水解酪蛋白时，可以促进菌的生长和提高胞外多糖的产量，而Schellhaass（1983）研究指出，对于嗜热和嗜温的产黏菌来说，其生长和胞外多糖的分泌均与生长介质中存在的酪蛋白和乳清蛋白无关，可是Cerning（1986）发现酪蛋白能刺激Lb.bulgaricus分泌胞外多糖，但不能促进菌体生长，也有报道说Lb.bulgaricus在乳和乳超滤液中分泌数量相同的胞外多糖，当向超滤液中添加葡萄糖或蔗糖时可以促进菌体分泌胞外多糖。
培养介质的PH值和温度均影响胞外多糖的合成（Garcia-Garibay and Marshall 1991）。
有关温度对产黏乳酸菌分泌胞外多糖的影响的研究报道也相互矛盾。一些研究者发现温度在最适生长温度范围内可以获得较大量的胞外多糖，，而另外一些研究者发现低于最适生长温度可以产生较多的胞外多糖。对于PH值对产黏菌分泌胞外多糖的影响的研究很少。Mozzi et al.测得Lc.caseiCRL87分泌胞外多糖的最大量（488mg/L）和最多细胞数的PH值条件是保持在PH6.0。此外，在发酵中控制PH值产生的胞外多糖的量要比不控制PH值高3倍。
近年来，随着生物技术的发展，有关产黏乳酸菌分泌胞外多糖的代谢途径和所涉及的酶已有不少报道，对此国内研究甚少。A.Escalante et al.（1998）研究表明产黏菌和不产黏菌之间的差别在于代谢途径中的焦磷酸化酶和差向异构酶在胞外多糖的合成中的作用不同。学术报道上存在的偏差有许多原因，例如，检测胞外多糖的方法不同；采用不同的生长介质、条件和检测时间；缺乏PH值控制；存在许多不同的胞外多糖产量的表达方式（毫克EPS、mgEPS/l、mgEPS/CFU）。Fredrik Levander et al.（2002）归纳了S.thermophilus分泌胞外多糖的代谢途径，假设乳酸菌低产胞外多糖的状况可由改变影响前体核苷酸糖合成的中心代谢中的酶量来提高，并通过实验证明了这种方法是可行的。在考虑用基因的方法来提高乳酸菌胞外多糖的产量时，必须承认的是EPS是一个耗能的过程，而乳酸菌仅有几条分解代谢途径能产生能量。因为大多数的嗜热乳酸菌的EPS产量和生长相关，所以在努力显著提高EPS产量的同时应采取新的办法提高菌体的生物数量（Degeest 等2001a）。
乳酸菌分泌胞外多糖的生理作用
产生胞外多糖的高能消耗和表观构造引起了人们对乳酸菌产生胞外多糖的作用的兴趣。已知细胞表面的多糖具有致病、共生、形成黏质和抗压的作用（Robert,1995；De Vuyst 等，2001）。不过，乳酸菌胞外多糖的生理功能仍不清楚。显然，乳酸菌合成胞外多糖并非为了储存能量，因为大多数的乳酸菌都不能分解代谢它们产的胞外多糖（Cerning 1990）。
胞外多糖有在低湿环境中保护菌体的作用，由此Petersen（2001）调查了胞外多糖对嗜热链球菌在冷冻和冻干时的耐受影响，结果显示，经过冷冻或冻干之后，产生荚膜多糖的嗜热链球菌MR-1C的菌数高于普通菌株，但差别并不十分显著。用产黏质多糖的嗜热链球菌和其普通菌株做了相似的实验，得出结论：对于耐受冷冻或冻干的能力，菌株的不同要比胞外多糖存在与否更为重要（Petersen 2001）。
在全世界乳品工业中，致病性噬菌体是引起发酵失败的最重要原因（Moineau 1999）。人们认为胞外多糖具有保护菌体抵抗不良环境的作用，厚厚的一层荚膜多糖已经被证实有保证菌体免受噬菌体感染的的作用（Kang 和Cottrell，1979）。可是，胞外多糖在乳酸菌受噬菌体感染的过程中所起的作用仍然不清楚。
一些研究表明胞外多糖有保护乳酸菌免受噬菌体感染的作用（Vedamuthu 和Neville，1986；Moineau 等，1996；De Vuyst 和Degeest，1999）。Looijesteijn等（2001）证实，与细胞相连的胞外多糖提供乳球菌属的许多菌株微弱的保护作用，抵抗噬菌体的感染。Forde和Firzaerald（1999a）也证实与一些乳球菌株松散相连的胞外多糖可以轻微抑制噬菌体的吸附。后一种作用可能是由于胞外多糖阻碍了噬菌体与菌体细胞表面的噬菌体接收器之间的作用（Forde和Firzaerald ，1999a）。Lamothe 等（2002）实验证明保加利亚乳杆菌Lfi5具有噬菌体低敏感性。
综合有关乳酸菌胞外多糖的报道得出，胞外多糖的单糖组成对噬菌体的敏感性无影响。目前仍需要弄清楚的是，有乳酸菌产生的胞外多糖的结构是否与菌体对噬菌体敏感性或非敏感性有关系。不过，目前清楚的是生产者不能仅仅依靠胞外多糖来保护发酵剂菌种免受噬菌体的感染。
乳酸菌胞外多糖的遗传不稳定性
由乳酸菌产生的EPS在基因水平上的不稳定性及其本身粘质特性的不稳定性一直以来都是乳品工业中的广为人知的问题（Cerning ,1990）。即使在最适生长温度，其产粘特性也
会在传代几次之后消失，并且出现培养期延长（Cerning ,1990；Macura et al. ,1984）。因此，必须定期地从发酵剂中从新筛选产EPS的菌株，以保存其特性，用做工业菌株（Stingele,等 1996）。嗜温乳酸菌（例如L.lactis subsp. Cremoris和Lactococcus lactis subsp. lactis）产EPS的特性都常与质粒相关，遗传的不稳定性可用质粒的丢失来解释（Macura er al. ,1984；Vedamuhu,等 ,1986;Vescovo等,1989;Von Wright 等1987）。另一方面，嗜热的乳酸菌产生EPS却与质粒无关，因为这些菌中不含质粒（Cerning ,1990；Vedamuhu,等 ,1986）。由此推断，嗜热乳酸菌的EPS生物合成所需的基因似乎位于染色体上，遗传的不稳定性可能是由于遗传因素多变，或者将其概括为染色体组的不稳定性，其中包括染色体的缺失或重组。这两种现象均在德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌中观察到（Germond et al. ,1993;Roussel et al.,1994）。
乳酸菌胞外多糖的应用
在乳制品中使用胞外多糖或产胞外多糖的发酵剂，可以提高产品的黏度、稳定性和附水性的作用（Sutherland I. W. ,1998）， 并且对发酵乳制品的口感、质地和口味接受度起积极的作用（Duboc 和Mollet，2001）。在许多年以前，欧洲的乳品生产者就已经采用产胞外多糖的乳酸菌生产各种有特色的发酵乳（Cerning ，1995）。乳品生产者也已经利用产胞外多糖的发酵菌株来控制酸奶的乳清析出和胶体断裂，这种发酵剂在禁止向天然酸奶中添加植物或动物源的稳定剂的国家，应用更为广泛（Cerning ，1995）。应用产胞外多糖的嗜热链球菌生产低脂干酪，可以改善干酪的质地和功能（Perry et al., 1995）。随着对乳酸菌胞外多糖的更深入的探索，其应用范围会越来越广泛。
3．共轭亚油酸（CLA）高产菌株选育
共轭亚油酸（Ｃonjugated linoleic acid，ＣＬＡ）是一类在９与１１位，１０与１２位或１１与１３位碳原子处含有顺式或反式共轭双键的十八碳二烯酸，是亚油酸（９Ｚ，１２Ｚ—１８：２）的分子的几种位置与几何异构体的统称。在各种异构物中，9Z、11E—CLA和10E、12Z—CLA被认为是主要的活性形式，它是天然产物中主要的异构物，占来自反刍动物乳制品及肉制品中总CLA的73%-93%。
近几年来，由于ＣＬＡ具有一系列特有的生理功能而倍受关注，这些生理功能包括：抗癌；抗糖尿病；免疫调节，增强机体免疫力；抗动脉粥样硬化；改善体质；增加肌肉，减少脂肪，治疗肥胖；调节骨组织代谢等。随着ＣＬＡ对人体健康积极影响的生理机制被逐步阐述，ＣＬＡ作为一种新发现的营养元素，无论作为保健食品、功能食品，还是将来应用于临床，它的研究都具有重要的意义。
ＣＬＡ主要是存在于反刍动物牛和羊等的肉和奶中。这是由于在反刍动物肠道中厌氧的溶纤维丁酸弧菌亚油酸异构酶能使亚油酸转化成ＣＬＡ,主要是以ｃ-9,ｔ-11异构体形式存在。故天然的ＣＬＡ主要以反刍动物消化道的微生物代谢产物存在。Shantha等(1995年)发现，发酵乳制品中CLA含量高于原料乳，当原料乳（CLA含量4.4mg/kg）加工成酸乳制品（CLA 含量5.50mg/kg）后，其CLA含量增加。Ha等报道，干酪Whiz（CLA含量8.81mg/kg）较原料乳（CLA含量0.83mg/kg）含有更高水平的CLA。Aneja和Murthi报道，印度酸奶Dahi（CLA含量26.5mg/kg）也较原料乳（CLA 含量5.50mg/kg）含有更多的CLA。以上表明微生物发酵作用提高了乳制品中CLA含量。ＣＬＡ也少量存在于其他动物的组织、血液和体液中。植物食品也含有ＣＬＡ,但其异构体的分布状况与动物食品显著不同。特别是具有生物活性的ｃ-9,ｔ-11异构体在植物食品中的含量很少，如在一般植物油中每克仅含有0.1ｍｇ～0.7ｍｇＣＬＡ,且其中ｃ-9,ｔ-11异构体的含量少于50%。海洋食品中的ＣＬＡ含量也很少。有研究报道，每日推荐摄入量从动物实验数据推测为3.5g/人/天。由此可见，向食物中强化CLA是有必要的。
为了能够在工业上生产ＣＬＡ,微生物应该是便宜、容易培育和使用的,并且是可食用的；并且微生物生产的CLA特异性强，90%以上的CLA都是9Z，11E—CLA。这是因为乳酸菌微生物中含有亚油酸异构酶,且其作用位点是在脂肪酸的Ｃ12双键上而不是Ｃ9双键上,能把亚油酸转化为ｃ9,ｔ11ＣＬＡ,而不是ｔ10,ｃ12或ｃ10,ｃ12异构体。空气对它没有影响,而有双键在Ｃ6上的脂肪酸会抑制其活性,但有双键在Ｃ9位置上的脂肪酸可提高其活性。得到的共轭亚油酸可直接从细胞培养液中提取。
目前还没有人对CLA高产菌株的选育进行研究，鉴于CLA的生理活性和食品中较低的含量，以及微生物生产的量也很少的情况下，通过育种找出高产菌株具有非常重要的意义。本课题的研究目的就在于寻找高产CLA的菌株，使微生物生产CLA的方法达到产业化。
国内外研究现状及发展趋势
早在50多年前就已经知道了含共轭双键的脂肪酸的存在。1966年C.R.Kepler发现反刍动物乳汁中的CLA是由厌氧的瘤胃细菌如溶纤维丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）等将亚油酸转化为CLA的，溶纤维丁酸弧菌的Δ12-顺-Δ11-反异构酶能够使亚油酸和亚麻酸转化成ｃ9,ｔ11-共轭亚油酸,然而由于此法有如下局限性而无法用于工业化生产：如亚油酸不仅仅转化成CLA，还会进一步氧化；溶纤维丁酸弧菌的培养需要非常严格的厌氧条件；它还具有使CLA还原成其他化合物的还原酶等；还能使亚油酸加氢变成硬脂酸。1992年和1994年Chin et al发现老鼠肠道菌群有能力将亚油酸转化为CLA。
1998年Jiang发现常作为乳制品发酵剂的3种费氏丙酸杆菌（Propionibacterium freudenreichii）能在MRS培养基上厌氧的条件下将游离的亚油酸转化为CLA，最大量达265ug/ml。
1999年，Pariza报道了一株乳酸杆菌（Lactobacillus reuteri strain）具有一种细胞膜结合酶，它能以亚油酸为原料，合成CLA。同年，Tung Y.Lin等人选取了嗜酸乳酸杆菌、保加利亚德氏乳杆菌、德氏乳酸乳杆菌、乳酸乳球菌和嗜热链球菌等菌种，在含有亚油酸的脱脂乳中培养24小时后，发现嗜酸乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus）的CLA产量最高，达105ug/ml。
2001年，日本的科学家Ogawa等报道了嗜酸乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus）以LA为原料转化为CLA的过程不是从一个非共轭双键经一步异构化而成为一个共轭双键，而是涉及到中间产物羟基脂肪酸的合成，这是首次揭示LA到CLA的转化机制。同年，邵群等用嗜酸乳酸杆菌、干酪乳杆菌及乳酸乳球菌进行发酵，脱脂乳培养液中添加一定量的亚油酸，选出了产量最高的是嗜酸乳酸杆菌，达2.062ug/ml，并测定了最佳发酵条件。
2002年S.Kishino等人通过对大量的乳酸菌的筛选，发现植物乳杆菌（Lactobacillus
plantarum）和嗜酸乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus）即使在有氧的条件下，都可以较多的CLA。2002年Y.J.Kim等人使用葵花油对13种乳酸菌进行了筛选，发现乳酸链球菌（Lactococcus lactis subsp lactis）、干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei)、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）都可以在MRS培养基中产CLA。2002年J.S.Ham等人从健康的婴儿粪便中分离了34株产CLA的乳酸菌。
通过对国内外现状的分析，可以看出，溶纤维丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）、费氏丙酸杆菌（Propionibacterium freudenreichii）、嗜酸乳酸杆菌 （Lactobacillus acidophilus）、保加利亚德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus）、德氏乳酸乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp lactis）、乳酸链球菌（Lactococcus lactis subsp lactis）、嗜热链球菌（Streptococcus salivarius subsp thermophilus）、干酪乳杆菌 （Lactobacillus casei）、乳脂链球菌（Lactococcus lactis subsp cremoris）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、瑞士乳杆菌（ Lactobacillus helveticus）、瘤胃乳杆菌 （Lactobacillus reuteri）这些菌都可以产CLA。但其中Butyrivibrio fibrisolvens（溶纤维丁酸弧菌）和Propionibacterium freudenreichii（费氏丙酸杆菌）需要严格的厌氧环境，条件不易控制，所以本实验不采用。而其余的可以产CLA的菌株均作为本实验的出发菌株。
今后重点研究应是瘤胃CLA 产生途径与机制，优化产生CLA的菌株。在此基础上，借助现代生物技术DNA探针，鉴定与分离产生CLA的特异菌株，并研究其生长特性与培养条件，最终通过发酵工程，大规模生产特异性较高的CLA。然后，通过发酵条件的优化，为大规模生产CLA提供依据。一方面提高乳中CLA的含量，使牛奶不仅是营养品，同时是重要的保健品，提高牛奶的附加值，产生直接的经济效益；另一方面筛选出特异性产生CLA的菌株，并工业化生产，开发出预防癌症的生物制品以及潜在的减肥食品，对于改善人类的健康具有十分的重要意义。
第四讲 乳酸菌及益生菌种类的功能及具有生物活性的次生代谢产物
一、 乳酸菌及益生菌
1、 定义及分类
（1）乳酸菌
（2）益生菌
2．生物活性
3．生长特性及应用、产品开发
二、 生物活性的次生代谢产物
1、细菌素
（1） 定义及种类
（2） 特性
Nisin是正常菌群中某些种类的乳酸乳球菌合成和分泌的一种对大多数G+菌有强大杀灭作用的细菌素。Nisin对营养细胞的作用主要是在细胞膜上，它可以抑制细菌细胞壁中肽聚糖的生物合成，使细胞质膜和磷脂化合物的合成受阻，从而导致细胞内物质外泄，甚至引起细胞裂解。作为一种天然的生物性食品防腐剂和抗菌添加剂，Nisin已广泛应用于乳制品、罐头食品、高蛋白食品及饲料工业中。添加400IU/g的产品储存11天，其含菌数比对照组低4个对数期，产品的感官可接受性较高。Nisin对乳酸菌株的影响也较大，如控制适宜的添加量(一般在5-100mg/kg)，能对某些乳酸菌株有明显的抑制作用，造成菌株的活力下降、产酸受抑、生长不良，但乳酸菌总数变化不大。
nisin的研究现状
乳链菌肽是由乳酸乳球菌产生的由基因编码的多肽抗生素，含有34个氨基酸残基，分子中含有5种稀有氨基酸，即氨基丁酸（ABA）、脱氢丙氨酸(DHA)、β-甲基脱氢丙氨酸（DHB）、羊毛硫氨基酸（ ALA-S-ALA）和β-甲基羊毛硫氨基酸（ALA-ABA），它们通过硫醚键形成五个内环。
乳链菌肽的抑菌谱包括营养体和芽孢，对葡萄球菌、梭菌、芽孢杆菌和利斯特菌有强烈的抑制作用，对酵母和霉菌没有作用。迄今为止，乳链菌肽已在全世界约60多个国家和地区被用作食品防腐剂]。我国对乳链菌肽的研究始于1989年，中国科学院微生物研究所在国家自然科学基金项目和中国科学院“八五”重点科研基金项目资助下，完成了对乳链菌肽的基础研究，研究成果现已批量生产，投放市场。1992年3月29日，我国卫生部食品监督部门签发了乳链菌肽在国内的使用合格证明，同时将乳链菌肽列入1992年10月1日实施的国标GB2760-86中的增补品种，可用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品和肉制品的保藏中。乳链菌肽用于食品中的优点是安全无毒，它的LD50约为7000Kg，允许使用的最大剂量是33000IU/Kg，乳链菌肽是一种短肽，可以被体内的α-胰凝乳蛋白酶降解；不影响食品的色香味；在食品加工中可以降低杀菌温度、减少热处理时间，改变食品的营养价值、风味和结构等性状。国内外的研究者在对乳链菌肽的分子结构、分子形成过程、物理化学性质、抗菌机理和毒性等进行了广泛的研究
产nisin菌株在发酵食品中的应用
在干酪中的应用
早在1951Hirsch等研究发现nisin产生菌乳酸乳球菌乳酸亚种在Swiss型干酪中抑制厌
氧产气芽孢的形成。nisin最早应用于干酪的防腐，也是目前乳制品应用中的一个主要方面。在干酪加工的过程中，虽经过高温灭菌，但仍会有耐热性的革兰氏阳性菌孢子（如肉毒梭状菌和厌氧的梭菌芽孢）存在，乳酸链球菌肽可有效地阻止这些孢子的萌发和毒素的形成，有报道说，将nisin抗性株和nisin产生菌混合用于干酪发酵剂，可使优质产品率达90%以上，而用常规的方法仅有41%。学者们在这方面进行了大量的研究，nisin产生菌在干酪中应用的主要限制是生长缓慢和产酸率低。Exterkate等（1976）产酸率低主要原因是缺乏蛋白酶系统。是这些nisin产生菌只能利用乳中的可溶性含氮化合物。Roberts等（1992）用电穿空法将质粒pFG010引入乳酸乳球C2中使其产生nisin抗性和红霉素抗性，然后将其与nisin产生菌混合发酵，以期改变干酪的产酸度，但并未取得成功，由于这个质粒译码的抗性新陈代谢导致nisin失活。Roberts等（1992）通过筛选发酵蔗糖nisin产生菌菌株获得一株自发突变的蛋白酶阳性菌株NCDO1404，用1%的NCDO1404和0.5%JS102混合用于cheddar干酪发酵，使产酸率提高，达到干酪的酸度要求，干酪中大约700IU/g的nisin。此后，Roberts等（1993）又将用nisin产生菌制作的干酪用于巴氏杀菌的干酪酱的一种配料成份，结果低湿度在22和37℃,高湿度在22℃贮存时，延长了货架期。Berg等（1998）对Manchego干酪在成熟期间产nisin的乳酸乳球菌乳酸亚种ESI515对Listeria Innocua的抑制性进行了研究，发现成熟60天后，产nisin的发酵剂发酵干酪中L.innocua比不产nisin发酵剂酵的干酪细菌总数少约10个。Rodríguez等(2001)等通过杂交的方法获得一株nisin产生菌菌株TAB50，并将其用于抑制半硬质干酪中单核增生性李斯特菌。Maisnier-patin等（1992）也将其用于Camember干酪中。Rodríguez等（1998）将其用于Manchego干酪均证明对李斯特菌有良好抑制作用。使用产乳酸链球菌的作为发酵剂用于干酪的生产能达到抑菌的目的，其风味并未受到影响。Abdelghani等（2001）将nisin产生菌与其他乳酸菌用于Hispßânico干酪的发酵发现加入nisin产生菌与不加产nisin发酵剂的干酪的pH值没有差别，菌落总数低。每1Kg接种1.0gnisin产生菌发酵的干酪在成熟45天后，其蛋白水解度和游离氨基酸的数量分别是不加产nisin发酵剂的干酪的1.8倍和2.7倍，疏水的肽降低，3-甲基-1-丁醛、丁二酮和乙酰甲基甲醇浓度增加，干酪风味更好。
在泡菜中的应用
Harris等（1992）将nisin产生菌乳酸乳球菌NCK401和nisin抗性的Leuconostoc mesenteroides NCK293混合用于泡菜的发酵中。泡菜在最初发酵阶段是异型发酵的L占主导地位，由于L对酸敏感，随着酸度的上升，L迅速死亡，在发酵的后期是植物乳杆菌占主导。这种微生物生长顺序使泡菜具有特殊的风味和香味，然而，在大批量的生产中，泡菜的这种自然发酵主要信赖于原料的微生物种群。微生物的生长顺序受到生产条件的影响。因此，很难扩大生产并维持泡菜质量的稳定。乳酸乳球菌NCK401产生的nisin可以在初期抑制L以外的其它微生物的生长，而不影响LNCK293的生长繁殖。在混合发酵剂中100AU /ml的nisin轻微抑制植物乳杆菌ATCC14917。600AU/ml可以完全抑制株菌的发酵。由于后期的同型发酵是泡菜发酵中必不可少的，因此从实践的观点来看nisin并不是消除植物乳杆菌的生长。通过实验将乳酸乳球菌和L比例定为10:1。这种泡菜在含有2%的NaCl在20℃发酵获得了较高质量。
在酸奶中应用
与干酪相比，nisin产生菌用于酸奶的发酵的研究应用较少，只有Kalra等（1975）研究3[13]4]
了nisin产生菌与其它菌株混合发酵来阻止酸奶中酸的增加，以后他又研究了乳酸菌对nisin的敏感性，及nisin产生菌对其他普通发酵剂的影响。
nisin产生菌在干酪中的应用已取得了可喜的成功，在泡菜和酸奶的应用中也有了初步的研究。到目前为止，还未见产nisin的乳酸乳球菌用于其他发酵食品中，如果将nisin产生菌与其他nisin抗性菌株用于发酵食品中，可以抑制其它不需要的微生物的生长，减少或不必添加防腐剂，改善品质，延长保质期。国内将产nisin的菌株用于发酵食品中还未见报道。随着对nisin产生菌的特性的进一步的研究，产nisin的菌株在发酵食品中的应用必将大放异彩。
2、乳酸菌胞外多糖的研究进展
多糖是近年来兴起的一个研究热点，掀起了继蛋白质和核酸之后的又一生物大分子的研究热潮。人们之所以如此重视它，是因为它在生物体内所起的复杂且重要的生理作用。近年来，由于许多发达国家诸如美国、日本和欧洲等对多糖研究的重视，使得这方面的研究取得了不少进展，使得人们对它有了更深的了解（顾瑞霞，2000）。
多糖是高度水合的聚合物，由重复单元（由单糖组成）以糖苷键链接而成，分为同聚多糖和杂多糖，其分子上还可以带有无机分子和有机分子的取代基。多糖是一些变化多端的生物大分子，因为不但组成它们的单糖单位可以变化，而且这些单糖单位的链接方式也不定。单糖上存在一些羟基，可以形成糖苷键，这就意味着任何两个单糖就可以以多种位置相连。与之相比，任何两个氨基酸只能以两种方式链接成二肽。此外，多糖中还存在许多支链，以及无几分子和有机分子的取代基，致使其结构尤为复杂（Roberts，1995）。由此可见，复杂的多糖必定与复杂的生命现象关系密切。
生物界中，动物、植物和微生物都是多糖的丰富来源。微生物的胞外多糖尤为重要。微生物多糖包括某些细菌、真菌和蓝藻类产生的多糖，主要以三种形式存在：
粘附在细胞表面上 ；分泌到培养基中 ;构成细胞的成分 。
微生物多糖，因其安全无毒、理化性质独特等优良性质而倍受关注 。微生物多糖包括胞内多糖、胞壁多糖和胞外多糖 。胞外多糖是由微生物大量产生的多糖 ，易与菌体分离 ，可通过深层发酵实现工业化生产 。据Ｄ.Ｅ.Ｅveleigh统计 ，已经发现 49属 76种微生物产生胞外多糖 ,但真正有应用价值并已进行或接近工业化生产的仅十几种 。
近几年 ,随着对微生物多糖研究的深入 ,世界上微生物多糖的产量和年增长量均在 1 0 %以上 。而一些新型多糖年增长量在3 0 %以上 。到目前为止 ,已大量投产的微生物胞外多糖主要有黄原胶 (Xanthangum)、结冷胶 (Gellangum)、小核菌葡聚糖 (Scleeroglucan)、短梗霉多糖 (Pullulan)、热凝多糖 (Curdlan)等 。微生物多糖具有植物多糖不具备的优良性质 ，它们生产周期短 ，不受季节、地域和病虫害条件限制 ，具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景 。
目前 ,许多微生物多糖已作为胶凝剂、成膜剂、保鲜剂、乳化剂等 。广泛应用于食品、制药、石油、化工等多个领域 。据估计 ，全世界微生物多糖年加工业产值可达 50～ 1 0 0亿美元（魏培莲，2002）。
近年来，人们越来越关注乳酸菌产生的胞外多糖，因为乳酸菌是公认的有益菌，所以它们产生的胞外多糖也具有GRAS（普遍认为是安全的）地位（De Vuysthe 和Degeest 1999）。用能产生胞外多糖的乳酸菌发酵乳，即使只产生少量的胞外多糖（60－400mg/L），也可使发酵物具有粘稠的质地（Cerning 1990）。此外，胞外多糖还可以改善发酵乳的质地，使其质地象奶油一样光滑细腻（Macura 和Townsley 1984），并且还能减少酸奶的乳清析出和胶体
断裂，从而成为酸奶稳定剂的替代品。一些报道还称乳酸菌胞外多糖具有优良的生物学特性，如免疫活性（Oda et al. 1984）。综上所述，乳酸菌胞外多糖具有很广阔的发展前景。
有关乳酸菌胞外多糖的物化特性及生物合成，研究者进行了深入探索，本文综述了这些方面的研究进展。
乳酸菌胞外多糖的组成和结构
乳酸菌胞外多糖是一个广义的概念，细分为荚膜多糖（包围在菌体周围）和黏质多糖（释放都培养基质中的胞外多糖）。目前研究的分泌胞外多糖的乳酸菌大多来源于乳制品，例如酸奶及发酵剂、开菲尔粒，也有源于发酵肉的（Van Den Berg et al. 1995）。常见分泌胞外多糖的乳酸菌有：德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lb.bulgaricus）、嗜热链球菌（S.thermophilus）、干酪乳杆菌干酪亚种（Lb.casei ssp. casei）、马乳酒样乳杆菌（Lb.kefiranofaciens）、嗜酸乳杆菌（Lb.acidophilus）、清酒乳杆菌（Lb.sake0-1）、乳酸乳球菌乳脂亚种（Lc.lactis ssp.cremoris）、乳酸乳球菌（Lc.lactis）和肠膜明串珠菌（Leuc.mesenteroides）。
乳酸菌分泌的胞外多糖的特性与其结构和组成有很大的相关性。目前，研究者普遍认为由乳酸菌分泌的多糖是中性异型多糖（即分泌到细胞壁或培养介质中的多糖）；分子量在0.5×106到2×106之间，研究显示纯胞外多糖的溶液的黏度主要取决于其平均分子量（Van den Berg et al. ,1995）。
对各种乳酸菌分泌的胞外多糖的单糖组成研究表明，大多是由摩尔比例不同的葡萄糖和半乳糖组成（Cerning et al. 1990,1995），除此之外，还有鼠李糖（Cerning et al. 1986,1988；Nakajime et al. 1990,1992；Gruter et al. 1993；Grobben et al. 1995），甘露糖（Petit et al. 1991），果糖（Manca de Nadra et al. 1985），阿拉伯糖和棉子糖（Cerning et al. 1988,1992），或者糖的衍生物，诸如N-乙酰半乳糖胺（Doco et al. 1990；Petit et al. 1991）和N-乙酰葡萄糖胺（Cerning et al. 1994）。Ariga et al.（1992）分离出来一个完全不同的胞外多糖，由S.thermophilus OR901产生，由L-鼠李糖和D-半乳糖以1.00:1.47比例组成；Lact.casei CG11产生的杂多糖组成主要是葡萄糖（约占75%）和鼠李糖（约占15%）（Kojic et al. 1992），此外还有数量很少的半乳糖和甘露糖（Cerning et al. 1992）。目前尚待明确的是EPS的单糖组成是不是胞外多糖溶液和发酵乳饮品的流动学特性的影响因素。许多研究者还发现同一菌属的不同亚种分泌的胞外多糖差异很大。即使同一菌株，其培养条件不同，也会分泌不同的胞外多糖，所产生的胞外多糖的差异在于分子量的不同和单糖摩尔比例的不同，其组成的单糖大致不变。
直到目前为止，可以推定的是，胞外多糖的功能特性受其结构的影响（Sutherland ,1994）。研究显示胞外多糖是由分支的重复单元组成，含有α-和β-链接。在1989到1990年间，Doco et al.首次报道了由三株S.thermophilus分泌的胞外多糖的结构，发现它是由D－半乳糖、D－葡萄糖和2－乙酰胺－2－脱氧－D－半乳糖以摩尔比2：1：1组成，其四糖重复单元的结构如下：
→3）－β-D－Galp－(1→3)－β-D－Glup－(1→3)－α-D－Galp NAC－(1→
6
↑
α-D－Galp 1
Lemoine(1995)研究了S.thermophilusSFi12产生的胞外多糖结构，表明其含有一个六糖结构的重复单元，如下：
→2-α-L-Rhap-(1→2)-α-D-Galp-(1→3)-α-D-Glup-(1→3)-α-D-Galp-(1→3)- α-L-Rhap-(1→
4
↑
β-D-Galp 1
乳酸菌分泌的胞外多糖的功能性与其结构的关系密切，研究者大都认为以键β-(1→2)为主链的葡聚糖，半乳糖和甘露糖具有一定的抑制肿瘤的活性，而β-(1→3)为主链的葡聚糖，含有(1→6)支链的多糖，有的有抗肿瘤的活性，有的没有抗肿瘤的活性或者活性不高。（顾瑞霞，2000）目前，乳酸菌胞外多糖的结构与功能性之间的关系仍然处于模糊状态，需要进一步的研究。
乳酸菌胞外多糖的生物合成
在许多情况下，细菌胞外多糖在毒性中起重要作用，由此驱动了有关细菌胞外多糖的生物合成的研究（Roberts 1995）。因此，G（-）致病菌如大肠杆菌、沙门氏菌和流行热嗜血杆菌等中的胞外多糖的生物合成就相对地明确。在这些G（-）致病菌中，基本重复单元首先在细胞膜上形成，接着二磷酸核糖前体被传送到异戊二烯脂载体上（Sutherland 2001）。一旦这些重复单元聚集，那么脂连中间体就被位移穿过细胞膜，在细胞外聚合，形成胞外多糖，它既可以荚膜的形式共价结合到细胞表面，又可被释放到培养基质中作黏质。
对乳酸菌合成胞外多糖所涉及的基因的研究，及与G（-）致病菌同源性的比较，都明确显示了这些菌合成胞外多糖的细胞机制与G（-）致病菌系统类似，都需要脂连中间体。Stingele 等（1999）研究表明Streptococcous thermophilusSFi6中胞外多糖的生物合成需要一个脂载体，组成多糖的基本重复单元的单糖汇集在这个脂载体上。第一步由1－磷酸半乳糖苷转移酶催化，将磷酸半乳糖连到磷酸脂载体上，随后其它三个糖苷转移酶催化，依次将N-乙酰半乳糖胺、葡萄糖和一个分支的半乳糖部分连到上面。依次而论，乳酸菌胞外多糖的合成是一个耗能的过程，涉及许多酶，产生核糖前体，一个1-磷酸糖苷转移酶转移第一个糖基团，连到磷酸化的脂载体上，一个和更多的转移酶依次催化添加新的糖基，以增加重复单元，其它的酶参与eps基因调控，膜转位和聚合/确定链长度的功能（Lamothe 等2002）。
G（-）和G（＋）菌合成胞外多糖所涉及的各种酶之间存在同源氨基酸，表明它们经历相似的机制，但这种假设仍有待实验验证。有关乳酸菌胞外多糖的生物合成的知识仍十分欠缺，仍有待进一步的研究。
影响乳酸菌胞外多糖合成的因素
产EPS乳酸菌诸如S.thermophilus和Lb.bulgaricus等分泌胞外多糖的量不高，这就为进一步研究胞外多糖与乳蛋白、黏度、流变特性之间关系以及其功能性设置了障碍。对此，国内外的许多研究者对乳酸菌分泌胞外多糖的影响因素进行了大量研究工作。乳酸菌分泌胞外多糖的能力受培养条件（温度、PH值和培养基）的影响很大。大多数产黏菌在所有生长条件都能分泌胞外多糖，但是分泌量最高却是在确定培养介质中，在特定的生长时期产生的（Cowie ,O.N. 1993）。所有促进或减弱生长的因素都影响着胞外多糖前体的胞外浓度，从而影响胞外多糖的合成，在生长期改变糖的性质和浓度均能使胞外多糖的性质或数量或者二者兼而有之发生变化。许多研究者指出，用一个化学确定的培养介质，含有确定的碳源、矿物质、氨基酸、维生素和核酸，可以更好地研究影响乳酸菌生长和分泌胞外多糖所需要的营养因子，代谢途径和胞外多糖的生物合成，并且对研究如何提高产黏菌分泌胞外多糖的数量和质量以及控制胞外多糖的生物合成尤为重要。
有关增产因子对胞外多糖产量的影响存在许多矛盾之处。Garcia-Garibay（1991）研究表明，当向培养Lb.bulgaricus的脱脂乳培养液中添加水解酪蛋白时，可以促进菌的生长和提高胞外多糖的产量，而Schellhaass（1983）研究指出，对于嗜热和嗜温的产黏菌来说，其生长和胞外多糖的分泌均与生长介质中存在的酪蛋白和乳清蛋白无关，可是Cerning（1986）发现酪蛋白能刺激Lb.bulgaricus分泌胞外多糖，但不能促进菌体生长，也有报道说Lb.bulgaricus在乳和乳超滤液中分泌数量相同的胞外多糖，当向超滤液中添加葡萄糖或蔗糖时可以促进菌体分泌胞外多糖。
培养介质的PH值和温度均影响胞外多糖的合成（Garcia-Garibay and Marshall 1991）。
有关温度对产黏乳酸菌分泌胞外多糖的影响的研究报道也相互矛盾。一些研究者发现温度在最适生长温度范围内可以获得较大量的胞外多糖，，而另外一些研究者发现低于最适生长温度可以产生较多的胞外多糖。对于PH值对产黏菌分泌胞外多糖的影响的研究很少。Mozzi et al.测得Lc.caseiCRL87分泌胞外多糖的最大量（488mg/L）和最多细胞数的PH值条件是保持在PH6.0。此外，在发酵中控制PH值产生的胞外多糖的量要比不控制PH值高3倍。
近年来，随着生物技术的发展，有关产黏乳酸菌分泌胞外多糖的代谢途径和所涉及的酶已有不少报道，对此国内研究甚少。A.Escalante et al.（1998）研究表明产黏菌和不产黏菌之间的差别在于代谢途径中的焦磷酸化酶和差向异构酶在胞外多糖的合成中的作用不同。学术报道上存在的偏差有许多原因，例如，检测胞外多糖的方法不同；采用不同的生长介质、条件和检测时间；缺乏PH值控制；存在许多不同的胞外多糖产量的表达方式（毫克EPS、mgEPS/l、mgEPS/CFU）。Fredrik Levander et al.（2002）归纳了S.thermophilus分泌胞外多糖的代谢途径，假设乳酸菌低产胞外多糖的状况可由改变影响前体核苷酸糖合成的中心代谢中的酶量来提高，并通过实验证明了这种方法是可行的。在考虑用基因的方法来提高乳酸菌胞外多糖的产量时，必须承认的是EPS是一个耗能的过程，而乳酸菌仅有几条分解代谢途径能产生能量。因为大多数的嗜热乳酸菌的EPS产量和生长相关，所以在努力显著提高EPS产量的同时应采取新的办法提高菌体的生物数量（Degeest 等2001a）。
乳酸菌分泌胞外多糖的生理作用
产生胞外多糖的高能消耗和表观构造引起了人们对乳酸菌产生胞外多糖的作用的兴趣。已知细胞表面的多糖具有致病、共生、形成黏质和抗压的作用（Robert,1995；De Vuyst 等，2001）。不过，乳酸菌胞外多糖的生理功能仍不清楚。显然，乳酸菌合成胞外多糖并非为了储存能量，因为大多数的乳酸菌都不能分解代谢它们产的胞外多糖（Cerning 1990）。
胞外多糖有在低湿环境中保护菌体的作用，由此Petersen（2001）调查了胞外多糖对嗜热链球菌在冷冻和冻干时的耐受影响，结果显示，经过冷冻或冻干之后，产生荚膜多糖的嗜热链球菌MR-1C的菌数高于普通菌株，但差别并不十分显著。用产黏质多糖的嗜热链球菌和其普通菌株做了相似的实验，得出结论：对于耐受冷冻或冻干的能力，菌株的不同要比胞外多糖存在与否更为重要（Petersen 2001）。
在全世界乳品工业中，致病性噬菌体是引起发酵失败的最重要原因（Moineau 1999）。人们认为胞外多糖具有保护菌体抵抗不良环境的作用，厚厚的一层荚膜多糖已经被证实有保证菌体免受噬菌体感染的的作用（Kang 和Cottrell，1979）。可是，胞外多糖在乳酸菌受噬菌体感染的过程中所起的作用仍然不清楚。
一些研究表明胞外多糖有保护乳酸菌免受噬菌体感染的作用（Vedamuthu 和Neville，1986；Moineau 等，1996；De Vuyst 和Degeest，1999）。Looijesteijn等（2001）证实，与细胞相连的胞外多糖提供乳球菌属的许多菌株微弱的保护作用，抵抗噬菌体的感染。Forde和Firzaerald（1999a）也证实与一些乳球菌株松散相连的胞外多糖可以轻微抑制噬菌体的吸附。后一种作用可能是由于胞外多糖阻碍了噬菌体与菌体细胞表面的噬菌体接收器之间的作用（Forde和Firzaerald ，1999a）。Lamothe 等（2002）实验证明保加利亚乳杆菌Lfi5具有噬菌体低敏感性。
综合有关乳酸菌胞外多糖的报道得出，胞外多糖的单糖组成对噬菌体的敏感性无影响。目前仍需要弄清楚的是，有乳酸菌产生的胞外多糖的结构是否与菌体对噬菌体敏感性或非敏感性有关系。不过，目前清楚的是生产者不能仅仅依靠胞外多糖来保护发酵剂菌种免受噬菌体的感染。
乳酸菌胞外多糖的遗传不稳定性
由乳酸菌产生的EPS在基因水平上的不稳定性及其本身粘质特性的不稳定性一直以来都是乳品工业中的广为人知的问题（Cerning ,1990）。即使在最适生长温度，其产粘特性也
会在传代几次之后消失，并且出现培养期延长（Cerning ,1990；Macura et al. ,1984）。因此，必须定期地从发酵剂中从新筛选产EPS的菌株，以保存其特性，用做工业菌株（Stingele,等 1996）。嗜温乳酸菌（例如L.lactis subsp. Cremoris和Lactococcus lactis subsp. lactis）产EPS的特性都常与质粒相关，遗传的不稳定性可用质粒的丢失来解释（Macura er al. ,1984；Vedamuhu,等 ,1986;Vescovo等,1989;Von Wright 等1987）。另一方面，嗜热的乳酸菌产生EPS却与质粒无关，因为这些菌中不含质粒（Cerning ,1990；Vedamuhu,等 ,1986）。由此推断，嗜热乳酸菌的EPS生物合成所需的基因似乎位于染色体上，遗传的不稳定性可能是由于遗传因素多变，或者将其概括为染色体组的不稳定性，其中包括染色体的缺失或重组。这两种现象均在德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌中观察到（Germond et al. ,1993;Roussel et al.,1994）。
乳酸菌胞外多糖的应用
在乳制品中使用胞外多糖或产胞外多糖的发酵剂，可以提高产品的黏度、稳定性和附水性的作用（Sutherland I. W. ,1998）， 并且对发酵乳制品的口感、质地和口味接受度起积极的作用（Duboc 和Mollet，2001）。在许多年以前，欧洲的乳品生产者就已经采用产胞外多糖的乳酸菌生产各种有特色的发酵乳（Cerning ，1995）。乳品生产者也已经利用产胞外多糖的发酵菌株来控制酸奶的乳清析出和胶体断裂，这种发酵剂在禁止向天然酸奶中添加植物或动物源的稳定剂的国家，应用更为广泛（Cerning ，1995）。应用产胞外多糖的嗜热链球菌生产低脂干酪，可以改善干酪的质地和功能（Perry et al., 1995）。随着对乳酸菌胞外多糖的更深入的探索，其应用范围会越来越广泛。
3．共轭亚油酸（CLA）高产菌株选育
共轭亚油酸（Ｃonjugated linoleic acid，ＣＬＡ）是一类在９与１１位，１０与１２位或１１与１３位碳原子处含有顺式或反式共轭双键的十八碳二烯酸，是亚油酸（９Ｚ，１２Ｚ—１８：２）的分子的几种位置与几何异构体的统称。在各种异构物中，9Z、11E—CLA和10E、12Z—CLA被认为是主要的活性形式，它是天然产物中主要的异构物，占来自反刍动物乳制品及肉制品中总CLA的73%-93%。
近几年来，由于ＣＬＡ具有一系列特有的生理功能而倍受关注，这些生理功能包括：抗癌；抗糖尿病；免疫调节，增强机体免疫力；抗动脉粥样硬化；改善体质；增加肌肉，减少脂肪，治疗肥胖；调节骨组织代谢等。随着ＣＬＡ对人体健康积极影响的生理机制被逐步阐述，ＣＬＡ作为一种新发现的营养元素，无论作为保健食品、功能食品，还是将来应用于临床，它的研究都具有重要的意义。
ＣＬＡ主要是存在于反刍动物牛和羊等的肉和奶中。这是由于在反刍动物肠道中厌氧的溶纤维丁酸弧菌亚油酸异构酶能使亚油酸转化成ＣＬＡ,主要是以ｃ-9,ｔ-11异构体形式存在。故天然的ＣＬＡ主要以反刍动物消化道的微生物代谢产物存在。Shantha等(1995年)发现，发酵乳制品中CLA含量高于原料乳，当原料乳（CLA含量4.4mg/kg）加工成酸乳制品（CLA 含量5.50mg/kg）后，其CLA含量增加。Ha等报道，干酪Whiz（CLA含量8.81mg/kg）较原料乳（CLA含量0.83mg/kg）含有更高水平的CLA。Aneja和Murthi报道，印度酸奶Dahi（CLA含量26.5mg/kg）也较原料乳（CLA 含量5.50mg/kg）含有更多的CLA。以上表明微生物发酵作用提高了乳制品中CLA含量。ＣＬＡ也少量存在于其他动物的组织、血液和体液中。植物食品也含有ＣＬＡ,但其异构体的分布状况与动物食品显著不同。特别是具有生物活性的ｃ-9,ｔ-11异构体在植物食品中的含量很少，如在一般植物油中每克仅含有0.1ｍｇ～0.7ｍｇＣＬＡ,且其中ｃ-9,ｔ-11异构体的含量少于50%。海洋食品中的ＣＬＡ含量也很少。有研究报道，每日推荐摄入量从动物实验数据推测为3.5g/人/天。由此可见，向食物中强化CLA是有必要的。
为了能够在工业上生产ＣＬＡ,微生物应该是便宜、容易培育和使用的,并且是可食用的；并且微生物生产的CLA特异性强，90%以上的CLA都是9Z，11E—CLA。这是因为乳酸菌微生物中含有亚油酸异构酶,且其作用位点是在脂肪酸的Ｃ12双键上而不是Ｃ9双键上,能把亚油酸转化为ｃ9,ｔ11ＣＬＡ,而不是ｔ10,ｃ12或ｃ10,ｃ12异构体。空气对它没有影响,而有双键在Ｃ6上的脂肪酸会抑制其活性,但有双键在Ｃ9位置上的脂肪酸可提高其活性。得到的共轭亚油酸可直接从细胞培养液中提取。
目前还没有人对CLA高产菌株的选育进行研究，鉴于CLA的生理活性和食品中较低的含量，以及微生物生产的量也很少的情况下，通过育种找出高产菌株具有非常重要的意义。本课题的研究目的就在于寻找高产CLA的菌株，使微生物生产CLA的方法达到产业化。
国内外研究现状及发展趋势
早在50多年前就已经知道了含共轭双键的脂肪酸的存在。1966年C.R.Kepler发现反刍动物乳汁中的CLA是由厌氧的瘤胃细菌如溶纤维丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）等将亚油酸转化为CLA的，溶纤维丁酸弧菌的Δ12-顺-Δ11-反异构酶能够使亚油酸和亚麻酸转化成ｃ9,ｔ11-共轭亚油酸,然而由于此法有如下局限性而无法用于工业化生产：如亚油酸不仅仅转化成CLA，还会进一步氧化；溶纤维丁酸弧菌的培养需要非常严格的厌氧条件；它还具有使CLA还原成其他化合物的还原酶等；还能使亚油酸加氢变成硬脂酸。1992年和1994年Chin et al发现老鼠肠道菌群有能力将亚油酸转化为CLA。
1998年Jiang发现常作为乳制品发酵剂的3种费氏丙酸杆菌（Propionibacterium freudenreichii）能在MRS培养基上厌氧的条件下将游离的亚油酸转化为CLA，最大量达265ug/ml。
1999年，Pariza报道了一株乳酸杆菌（Lactobacillus reuteri strain）具有一种细胞膜结合酶，它能以亚油酸为原料，合成CLA。同年，Tung Y.Lin等人选取了嗜酸乳酸杆菌、保加利亚德氏乳杆菌、德氏乳酸乳杆菌、乳酸乳球菌和嗜热链球菌等菌种，在含有亚油酸的脱脂乳中培养24小时后，发现嗜酸乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus）的CLA产量最高，达105ug/ml。
2001年，日本的科学家Ogawa等报道了嗜酸乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus）以LA为原料转化为CLA的过程不是从一个非共轭双键经一步异构化而成为一个共轭双键，而是涉及到中间产物羟基脂肪酸的合成，这是首次揭示LA到CLA的转化机制。同年，邵群等用嗜酸乳酸杆菌、干酪乳杆菌及乳酸乳球菌进行发酵，脱脂乳培养液中添加一定量的亚油酸，选出了产量最高的是嗜酸乳酸杆菌，达2.062ug/ml，并测定了最佳发酵条件。
2002年S.Kishino等人通过对大量的乳酸菌的筛选，发现植物乳杆菌（Lactobacillus
plantarum）和嗜酸乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus）即使在有氧的条件下，都可以较多的CLA。2002年Y.J.Kim等人使用葵花油对13种乳酸菌进行了筛选，发现乳酸链球菌（Lactococcus lactis subsp lactis）、干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei)、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）都可以在MRS培养基中产CLA。2002年J.S.Ham等人从健康的婴儿粪便中分离了34株产CLA的乳酸菌。
通过对国内外现状的分析，可以看出，溶纤维丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）、费氏丙酸杆菌（Propionibacterium freudenreichii）、嗜酸乳酸杆菌 （Lactobacillus acidophilus）、保加利亚德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus）、德氏乳酸乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp lactis）、乳酸链球菌（Lactococcus lactis subsp lactis）、嗜热链球菌（Streptococcus salivarius subsp thermophilus）、干酪乳杆菌 （Lactobacillus casei）、乳脂链球菌（Lactococcus lactis subsp cremoris）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、瑞士乳杆菌（ Lactobacillus helveticus）、瘤胃乳杆菌 （Lactobacillus reuteri）这些菌都可以产CLA。但其中Butyrivibrio fibrisolvens（溶纤维丁酸弧菌）和Propionibacterium freudenreichii（费氏丙酸杆菌）需要严格的厌氧环境，条件不易控制，所以本实验不采用。而其余的可以产CLA的菌株均作为本实验的出发菌株。
今后重点研究应是瘤胃CLA 产生途径与机制，优化产生CLA的菌株。在此基础上，借助现代生物技术DNA探针，鉴定与分离产生CLA的特异菌株，并研究其生长特性与培养条件，最终通过发酵工程，大规模生产特异性较高的CLA。然后，通过发酵条件的优化，为大规模生产CLA提供依据。一方面提高乳中CLA的含量，使牛奶不仅是营养品，同时是重要的保健品，提高牛奶的附加值，产生直接的经济效益；另一方面筛选出特异性产生CLA的菌株，并工业化生产，开发出预防癌症的生物制品以及潜在的减肥食品，对于改善人类的健康具有十分的重要意义。