芦笋茎枯病菌原生质体的制备及再生

第41卷2014年第2期4月

植物保护学报

ACTA PHYTOPHYLACICA SINICA

Vol．41Apr．No．22014

芦笋茎枯病菌原生质体的制备及再生

张岳平

1

罗绍春

1

黄燕萍

1

汤泳萍

1

易克贤

2

谢丙炎

3

陈光宇

1*

（1．江西省农业科学院蔬菜花卉研究所，南昌330200；2．中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南海口571101；3．中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京100081）

为了解芦笋茎枯病菌Phomopsis asparagi 的遗传转摘要：原生质体的制备是真菌遗传转化的基础，

化体系，以芦笋茎枯病菌Pa1100为供试菌株，研究了细胞壁裂解酶、酶解时间、稳渗剂等对芦笋茎枯病菌原生质体制备的影响及稳渗剂对原生质体再生的影响。结果表明可制备芦笋茎枯病菌原生

1%崩溃酶和1．5%质体较为适宜的条件是：CM 液体培养基中培养分生孢子3d ，以1．5%裂解酶、33ħ 水浴酶解4．5h ，蜗牛酶为组合酶解液，以PBS （pH 6．98）与1mol /LMgSO 4混合液为酶解稳渗

剂。含0．6mol /L蔗糖的PDA 培养基较适合于芦笋茎枯病菌原生质体的再生。关键词：芦笋茎枯病菌；原生质体；制备；再生

Isolation and regeneration of Phomopsis asparagi protoplast

Zhang Yueping 1

Luo Shaochun 1

Huang Yanping 1

Tang Yongping 1

Yi Kexian 2

Xie Bingyan 3

Chen Guangyu 1*

（1．Institute of Vegetables and Flowers ，Jiangxi Academy of Agricultural Sciences ，Nanchang 330200，

Jiangxi Province ，China ；2．Institute of Environmental and Plant Protection ，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences ，Haikou 571101，Hainan Province ，China ；3．Institute of Vegetables and Flowers ，Chinese Academy of Agricultural Sciences ，Beijing 100081，China ）

Abstract ：Generation of fungal protoplast is an essential tool for genetic transformation system．To establish protoplast-mediated genetic transformation system of Phomopsis asparagi ，conditions for the protoplast isolation and regeneration of Pa1100mycelia ，including various enzymes ，digestion time ，and osmotic stabilizers ，were examined in this study．An efficient method for protoplast isolation and regeneration of P．asparagi was obtained．The results showed that 3-day-old mycelia cultured in liquid CM medium was adequate to protoplast isolation．The enzyme mixture of 1．5%lyase ，1%driselase and 1．5%snailase was most beneficial for digesting the mycelia．The suitable incubation time with enzyme for the maximum release of protoplasts was 4．5h in a water bath at 33ħ ．The most effective osmotic stabilizer for the protoplast release was 1mol /LMgSO 4combined with phosphate buffer （pH 6．98）．P．asparagi protoplast regeneration results showed that the potato dextrose agar medium containing 0．6mol /Lsucrose was the best medium for regeneration．

Key words ：Phomopsis asparagi ；protoplast ；isolation ；regeneration 芦笋Asparagus officinalis L．是一种具有很高营养价值的保健型蔬菜。芦笋茎枯病是由天门冬拟茎

点霉Phmopsis asparagi 引起的重要真菌病害，俗称

。目前，芦笋“癌症”中国芦笋生产面积居世界第

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（[1**********]04），国家自然科基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（201003074），

学基金（31360426），江西省自然科学基金（20132BAB214020），江西省博士后科研择优资助项目

1981年生，mail ：pals2011@126．com 男，助理研究员，研究方向为芦笋生物工程，E-作者简介：张岳平，

*通讯作者（Author for correspondence ），E-mail ：genebksh@hotmail．com ；收稿日期：2013－07－03

一，茎枯病在我国发生特别严重，近年平均感染率超过50%，常导致成片绝收，已成为制约芦笋产业发

［1－3］

。该病重点为害茎杆或嫩展的主要瓶颈之一

病斑初呈水渍状条斑，后笋，也可侵染枝梗和拟叶，

渐变成暗黑色梭条形，中部赤褐色凹陷，大量小黑点状分生孢子器散生其上，最终导致整株枯死并迅速

［4］

传染至相邻植株。该病菌主要以分生孢子器或

适宜条件下进行初侵菌丝体在田间病残体上越冬，

［2－3，5］

。目前，生产上对芦笋茎枯病尚无染和再侵染

有效的化学防治方法，因为雨水是病害传播的重要媒介，一般采用设施避雨栽培进行病害预防。国内外芦笋茎枯病相关报道较多，但大都集中在病原菌

［6－8］

，尚命名、生物学特性、寄主和生物拮抗等方面

未见芦笋茎枯病菌的原生质体制备体系相关报道。为了有效地防治该病害，需对其进行分子生物学方面的相关探讨，鉴定致病相关基因，并分析其功能和调控机理，从而深入解析其致病机制。目前，利用原生质体进行分子转化技术已成为丝状真菌转化和相

［9－11］

。尽管关分子克隆技术体系的重要组成部分

近年来有关植物丝状真菌遗传转化方面的研究已有大量报道，但由于不同种类丝状真菌细胞结构，尤其是细胞壁的结构和组成存在着明显差异，因此制备原生质体的最佳条件和体系也存在着很大差异。本研究以芦笋茎枯病菌Pa1100菌株为试验材料，研究了其原生质体制备及再生的条件，以期为该病原菌的分子致病机制研究提供重要的方法基础。

NaCl 、MgSO 4，终浓度均为0．6mol /L，用于原萄糖、

生质体再生。

试剂与裂解酶：用于酶解系统的稳渗剂包括0. 7mol /LNaCl 、1mol /L山梨醇、0．6mol /L蔗糖、不同浓度的MgSO 4（用pH 6．98的10mmol /LPBS 配制），试验所用试剂均为国产分析纯。裂解酶中lyase 、driselase 购于Sigma 公司；snailase 购于北京索莱宝生物科技有限公司。1．2方法

1．2．1原生质体制备方法

菌株Pa1100在产孢培养基上25ħ 、光照12h /d培养10 14d ，收集孢子并制备成混匀的孢子悬液（1ˑ 108个/mL）。取1mL 置于100mL CM 液体培

25ħ 150r /min摇床培养3d ，养基中，收集新鲜菌丝1．2mol /LMgSO 4稳渗剂体1．0g ，无菌水洗涤2次，

洗涤3次，加入10mL 1．5%裂解酶（lyase ）+1. 5%蜗牛酶（snailase ）+1．0%崩溃酶（driselase ）的裂解酶混

33ħ 水浴酶合液（1．2mol /LMgSO 4稳渗剂配制），

解。血球计数板监测原生质体的形成数量，确定酶

解时间。用4层灭菌擦镜纸将原生质体液过滤，用山梨醇溶液（浓度为1mol /L）反复洗涤2 3次，取

5000r /min离心5min ，滤液，弃上清，用预冷山梨醇溶液重悬沉淀，离心，制备的原生质体沉淀重悬于山梨醇，置冰浴中备用。试验设3次重复，下同。1．2．2试验设置

菌龄：试验通过在CM 液体培养基中振荡培养芦笋茎枯病菌分生孢子以获得新鲜菌丝体，菌龄分2、3和4d 。别设置为1、

1．5%snailase 酶解体系：分别取1．5%lyase 、和1．0%driselase 及不同酶体系组合研究裂解酶对

芦笋茎枯病菌原生质体产量的影响。

酶解时间分析：选用经CM 液体培养基振荡培

33ħ 水浴养3d 的新鲜菌丝体进行原生质体制备，中共酶解6h ，且每隔30min 定期取样，显微镜下观

测分析原生质体生成情况。

稳渗剂分析：在酶解体系中，稳渗剂是保持生成的原生质体正常形态必需的环境条件，本试验分别1mol /L山梨醇、0．6mol /L蔗选择0．7mol /LNaCl 、

MgSO 4（用pH 6．98的10mol /LPBS 配制，糖、体积MgSO 4浓度分别设为1．0、比为MgSO 4ʒ PBS =3ʒ 1，

0．5和0．2mol /L）等不同的稳渗剂以分析其对芦笋茎枯病菌原生质体产量的影响。1．2．3原生质体再生过程

将原生质体用稳渗剂适当稀释后涂布于再生培

1材料与方法

1．1材料

供试菌株与培养基：供试菌株Pa1100，由本

2%的琼脂，实验室保存。燕麦培养基：5%燕麦片、

用于产孢。CM 液体培养基：20ˑ 硝酸盐50mL

KCl 10．4g 、MgSO 4·7H 2O 10．4g 、（NaNO 3120g 、

KH 2PO 430．4g ，微量元素混加水定容至1000mL ）、

7H 2O 2．2g 、H 3BO 31．1g 、MnCl 2·合液1mL （ZnSO 4·FeSO 4·7H 2O 0．5g 、CoCl 2·6H 2O 0．17g 、4H 2O 0．5g 、

CuSO 4·5H 2O 0．16g 、Na 2MoO 4·2H 2O 0．15g 、Na 4EDTA 5g ，加水定容至100mL ）、复合维生素液1mL （维生

维生素B 10．01g 、维素H 0．01g 、维生素B 60．01g 、

烟酸0．01g ，加生素B 20．01g 、对氨基苯甲酸0．01g 、

D-水定容至100mL ）、葡萄糖10g 、蛋白胨2g 、酵母

pH 提取物1g 、酪蛋白1g ，加水定容至1000mL ，6. 5，用于分生孢子培养并制备新鲜菌丝体。再生培

D-养基：在PDA 培养基（马铃薯200g 、葡萄糖20g 、琼脂18g 、加水定容至1000mL ）中分别加入蔗糖、葡

养基，在25ħ 下培养3 5d ，调查再生情况，对形成的菌落记数（A ）；以不含稳渗剂的PDA 培养基作对照（B ），计算再生率，再生率（%）=（A －B ）/总原生质体数ˑ 100。

1．2．4原生质体再生菌株的致病性鉴定

7

以浓度为1．0ˑ 10个/mL的原生质体再生菌

25ħ 、12h ：株分生孢子悬浮液喷雾接种芦笋嫩茎，

在单种酶作用下，酶解菌株Pa1100新鲜菌丝体时，

1．0%裂解酶解释放的原生质体产量较高，为7. 0ˑ

6106个/mL，1．5%蜗牛酶产量最少，为2．1ˑ 10/mL。当这几种裂解酶以不同的方式组合时，原生质体产量

均能不同程度地得到提高，其中以3种酶同时存在的

7

组合下效率最高，原生质体产量可达2．6ˑ 10/mL（表1）。

2．1．3酶解时间

在酶解初期，随着酶解时间的增加，原生质体不断从菌丝体中被释放，酶解1．5h 时原生质体产量

7

为0．5ˑ 10个/mL。当酶解4．5h 时新鲜菌丝体已基本被酶解完成，此时原生质体产量达最高，为2．8ˑ 107个/mL。继续延长酶解时间，原生质体产5．5h 时产量为2．0ˑ 10个/mL。说量出现下降，明，适当的酶解时间有利于芦笋茎枯病菌新鲜菌丝体的原生质体释放，但酶解时间过长则一方面酶的裂解效率会受到影响，另一方面会造成不断释放的原生质体较长时间暴露在酶解液中，原生质体膜会受到一定的破坏，从而不利于原生质体的总产量提高。

2．1．4稳渗剂类型

不同稳渗剂对原生质体的生成作用不同，用PBS 配制的1．0mol /LMgSO 4是Pa1100菌株释放原生质体较好的稳渗剂，产量为2．5ˑ 10/mL；其次是

6

1．0mol /L山梨醇，为9．1ˑ 10个/mL（表2）。低浓当度的MgSO 4不利于菌丝体充分释放原生质体，MgSO 4浓度降到0．2mol /L时原生质体显著下降。

77

12h 光照培养，7 10d 内检查症状反应，以原菌株Pa1100为对照。1．3数据分析

数据统计采用Excel 2007软件分析，利用SPSS13．0软件中One-Way ANOVA 方法进行方差分LSD 法进行多重比较。析，

2结果与分析

2．1原生质体的制备2．1．1菌龄

试验表明，培养3d 的新鲜菌丝体产生的原生质体相对最多，当菌龄增加时，获得的原生质体产量反而下降。说明不同菌龄对酶解作用过程中原生质体的产量影响明显，分生孢子培养时间过短，菌丝体过于幼嫩，酶解后形成的原生质体在释放后更易破裂；菌丝培养时间过长，菌丝细胞壁成分和结构改变，老化增厚，较难被成功酶解，造成原生质体产量减少。2．1．2裂解酶

芦笋茎枯病菌原生质体的产量受不同的裂解酶种类作用较大，且复合酶组合酶解效率高于单种酶。

表1不同裂解酶组合对芦笋茎枯病菌新鲜菌丝体原生质体产量的影响

Table 1Influences of different commercial enzyme combinations on the released protoplast of fresh mycelia

of Phomopsis asparagi Pa1100

裂解酶Enzyme 1．5%裂解酶1．5%Lyase 1．5%蜗牛酶1．5%Snailase 1．0%崩溃酶1．0%Driselase 1．5%裂解酶+1．5%蜗牛酶1．5%Lyase +1．5%Snailase 1．5%裂解酶+1．0%崩溃酶1．5%Lyase +1．0%Driselase 1．5%蜗牛酶+1．0%崩溃酶1．5%Snailase +1．0%Driselase

1．5%裂解酶+1．5%蜗牛酶+1．0%崩溃酶1．5%Lyase +1．5%Snailase +1．0%Driselase

不同小写字母分别表示经LSD 法检验差异显著（P ＜0．05）。Data in the table are mean ʃ SD．Different 表中数据为平均数ʃ 标准误，

lowercase letters indicate significant difference at P ＜0．05level by LSD test．

26．0ʃ 0．1a 12．5ʃ 0．4b

6

原生质体产量Protoplast （ˑ 10/mL）

3．8ʃ 0．2d 2．1ʃ 0．1d 7．0ʃ 0．5c 7．5ʃ 0．2c 15．6ʃ 0．7b

表2不同稳渗剂对芦笋茎枯病菌原生质体产量的影响

Table 2Influences of different osmotic stabilizers on the released protoplast of fresh mycelia of Phomopsis asparagi Pa1100

稳渗剂Osmotic stabilizer 0．7mol /L氯化钠0．7mol /LNaCl 1．0mol /L山梨醇1．0mol /LSorbital 0．6mol /L蔗糖0．6mol /LSucrose 1．0mol /L硫酸镁1．0mol /LMgSO 40．5mol /L硫酸镁0．5mol /LMgSO 40．2mol /L硫酸镁0．2mol /LMgSO 4

lowercase letters indicate significant difference at P ＜0．05level by LSD test．

6

原生质体产量Protoplast （ˑ 10/mL）

5．7ʃ 0．5c 9．1ʃ 0．1b 6．8ʃ 0．3c 25．0ʃ 0．6a 5．2ʃ 0．1c 0．6ʃ 0．0d

不同小写字母分别表示经LSD 法检验差异显著（P ＜0．05）。Data in the table are mean ʃ SD．Different 表中数据为平均数ʃ 标准误，

2．1．5原生质体的形态观测

芦笋茎枯病菌原生质体的形态呈圆形，相对比

较规则，释放后原生质体的体积具有较为明显的变化，初释放时体积较小，随着在等渗液中时间的延长，体积有加大的趋势，部分原生质体出现较大的液泡。原生质体直径大小为4．0 11．0μm ，平均约为7．0μm （图1）

。

图1芦笋茎枯病菌原生质体形态

Fig．1Protoplast morphology of Phomopsis asparagi Pa1100

2．2原生质体的再生

2．2．1稳渗剂对原生质体再生的影响

0．6mol /L的蔗糖作为稳渗剂时，菌株原生质体0．7mol /LNaCl 作为稳渗的再生率最高，为24．0%，剂时再生率较低（图2）。

2．2．2酶解时间对原生质体再生的影响

4．5h 时酶解3 5h 原生质体再生率差别不大，最高，为22．0%，酶解时间过长不利于原生质体的再生（图2）。这说明裂解酶对生成的原生质体质膜系统具有一定的破坏作用，原生质体的再生效率受到酶解时间长短的影响。

2．3原生质体再生菌株的致病性鉴定

芦笋茎枯病菌原生质体再生菌株在OA

产孢培

图2不同稳渗剂和酶解时间对原生质体再生的影响Fig．2Influences of different osmotic stabilizers and

digestion time on regeneration of protoplast

养基上培养获得的分生孢子与原菌株Pa1100分生

孢子的形态学特征经比较，无明显差异。进一步利用分生孢子进行了致病接种分析，当分别以1．0ˑ 107浓度的再生菌株和原菌株分生孢子喷雾接种感病芦笋品种后，再生菌株与原菌株表现出相同的致病力和致病症状，表明原生质体再生菌株的致病力并没有发生改变。

3讨论

生长时间较短的新鲜菌丝体是制备真菌原生质

186植物保护学

［14］

报41卷

体的重要材料，本研究表明，由芦笋茎枯病菌的分生

孢子在CM 液体培养基中振荡培养3d 后获得的新鲜菌丝体比较适合原生质体的制备，进一步延长培养时间会造成原生质体产量下降，这与前人研究结果一致

，可能的原因是过长的培养时间导致菌丝体细胞壁成分改变，不利于裂解酶的破壁和原生

［9］质体的形成和释放。徐齐君等、卢明锋和张月［10］［11］

周礼红等报道，丝状真菌细胞壁结构复杰、

［12－13］

等的研究结果一致。此外，通过原生质体再生获

得的芦笋茎枯病菌菌株的致病力变化是后续研究的

重要基础，本研究进一步分析了再生菌株的致病力特征，结果表明，再生菌株保持了与原菌株相同的致病特征和致病力。本研究构建了芦笋茎枯病菌原生质体制备与再生体系，探明了相关因素对体系构建的影响，为进一步建立病原菌的分子转化体系、致病相关基因研究和致病机制解析提供了重要的材料基础。

参考文献（Ｒeferences）

［1］张岳平，陈光宇，罗绍春，等．芦笋重要真菌病害研究进

2012，28（31）：114－119展．中国农学通报，

［2］陈光宇．中国芦笋研究与产业发展．北京：中国农业出版

2010社，

［3］陈光宇．芦笋无公害生产技术．北京：中国农业出版社，

2005

［4］Zhang Y ，Chen G ，Luo S ，et al．Stress physiology and viru-lence characterization of Phomopsis asparagi （Sacc．）Bubákisolated from asparagus in Jiangxi Province of China．Agricul-tural Science ＆Technology ，2012，13（7）：1502－1508［5］Davis ＲD．Asparagus stem blight recorded in Australia．Aus-tralasian Plant Pathology ，2001，30：181－182

［6］Udayanga D ，Liu X ，McKenzie E H C ，et al．The genus Pho-mopsis ：biology ，applications ，species concepts and names of common phytopathogens．Fungal Diversity ，2011，50：189－225［7］刘克均，张凤如，陈永萱．芦笋茎枯病病原菌的订正．真菌

1991，10（4）：329－330学报，

［8］刘志恒，孙俊，杨红，等．芦笋茎枯病菌生物学特性的研

2008，39（3）：301－304究．沈阳农业大学学报，

［9］徐齐君，胡小平，陈婷，等．PEG 介导的棉花枯萎病菌原生

2012，24（3）：222－228质体转化体系的建立．棉花学报，

［10］卢明锋，张月杰．丝状真菌AL18的原生质体制备和再生

2012，22（3）：86－90条件的优化．生物技术，

［11］周礼红，李国琴，王正祥，等．红曲霉原生质体的制备、再

2005，27（3）：423－428生及其遗传转化系统．遗传，

［12］周益军，范永坚，王金生，等．稻瘟病菌原生质体的制备

和再生菌株的致病性．江苏农业科学，2000，16（2）：83－87

［13］张玮，燕继晔，郭霞，等．葡萄溃疡病菌原生质体的制备

2012，38（5）：27－30与再生条件的优化．植物保护，

［14］宋庆涛，张国珍，董金皋．玉米大斑病菌原生质体的制备

2003，30（2）：41－44与再生．微生物学通报，

杂，主要由几丁质、半纤维素和蛋白质等多成分构

成，单种酶只能降解其中的一种或几种成分，从而造成破壁效果较差，不利于获得较高产量的原生质体。本试验表明，单种酶中，崩溃酶裂解获得的原生质体产量最多，这可能与其是一种复合酶，内含昆布多糖

［12］

酶、木聚糖酶和纤维素酶，破壁能力强有关；蜗牛酶和裂解酶也是复合酶，但效果不及崩溃酶；当上述3种酶复合组配使用后，相同条件下原生质体产量显著增加。本试验结果还表明，除裂解酶种类外，不同酶浓度的选择也是影响原生质体制备的重要因素之一，过低浓度会造成破壁不理想从而影响产量，过高的酶液则造成浪费且对生成的原生质体不利，本试验中使用1% 1．5%的3种酶的混合使用酶解效果较好。此外，酶解4．5h 后新鲜菌丝体已基本

7

被酶解完成，原生质体产量可达2．8ˑ 10个/mL，继续酶解则会对已释放的原生质体产生一定的破坏，反而导致产量下降。稳渗剂的选择与不同菌种特性有关，合适的稳渗剂对获得高产原生质体至关

PBS 配制的1．0mol /LMgSO 4可重要，本试验表明，作为菌株Pa1100制备原生质体较理想的稳渗剂，可能的原因是过低浓度的稳渗剂造成酶解体系的渗透

压过低，不利于酶解液渗透并破坏菌丝体细胞壁，也不利于生成的原生质体保持正常形态，这充分表明在酶解体系中，稳渗剂的合理选择对芦笋茎枯病菌原生质体的形成非常重要。

原生质体的高效再生是后期深入研究其致病分子机制的必需条件，本试验明确了适合于芦笋茎枯病菌原生质体再生的酶解时间及稳渗剂种类，酶解3 5h 原生质体可获得较高的再生率，酶解时间过长不利于原生质体的再生；以0．6mol /L的蔗糖作为稳渗剂时，菌株原生质体的再生率最高。相对于无机盐，山梨醇和蔗糖等作为稳渗剂时可获得较高

［11］

的原生质体再生率，这与周礼红等和宋庆涛

（责任编辑：高峰）

第41卷2014年第2期4月

植物保护学报

ACTA PHYTOPHYLACICA SINICA

Vol．41Apr．No．22014

芦笋茎枯病菌原生质体的制备及再生

张岳平

1

罗绍春

1

黄燕萍

1

汤泳萍

1

易克贤

2

谢丙炎

3

陈光宇

1*

（1．江西省农业科学院蔬菜花卉研究所，南昌330200；2．中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南海口571101；3．中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京100081）

为了解芦笋茎枯病菌Phomopsis asparagi 的遗传转摘要：原生质体的制备是真菌遗传转化的基础，

化体系，以芦笋茎枯病菌Pa1100为供试菌株，研究了细胞壁裂解酶、酶解时间、稳渗剂等对芦笋茎枯病菌原生质体制备的影响及稳渗剂对原生质体再生的影响。结果表明可制备芦笋茎枯病菌原生

1%崩溃酶和1．5%质体较为适宜的条件是：CM 液体培养基中培养分生孢子3d ，以1．5%裂解酶、33ħ 水浴酶解4．5h ，蜗牛酶为组合酶解液，以PBS （pH 6．98）与1mol /LMgSO 4混合液为酶解稳渗

剂。含0．6mol /L蔗糖的PDA 培养基较适合于芦笋茎枯病菌原生质体的再生。关键词：芦笋茎枯病菌；原生质体；制备；再生

Isolation and regeneration of Phomopsis asparagi protoplast

Zhang Yueping 1

Luo Shaochun 1

Huang Yanping 1

Tang Yongping 1

Yi Kexian 2

Xie Bingyan 3

Chen Guangyu 1*

（1．Institute of Vegetables and Flowers ，Jiangxi Academy of Agricultural Sciences ，Nanchang 330200，

Jiangxi Province ，China ；2．Institute of Environmental and Plant Protection ，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences ，Haikou 571101，Hainan Province ，China ；3．Institute of Vegetables and Flowers ，Chinese Academy of Agricultural Sciences ，Beijing 100081，China ）

Abstract ：Generation of fungal protoplast is an essential tool for genetic transformation system．To establish protoplast-mediated genetic transformation system of Phomopsis asparagi ，conditions for the protoplast isolation and regeneration of Pa1100mycelia ，including various enzymes ，digestion time ，and osmotic stabilizers ，were examined in this study．An efficient method for protoplast isolation and regeneration of P．asparagi was obtained．The results showed that 3-day-old mycelia cultured in liquid CM medium was adequate to protoplast isolation．The enzyme mixture of 1．5%lyase ，1%driselase and 1．5%snailase was most beneficial for digesting the mycelia．The suitable incubation time with enzyme for the maximum release of protoplasts was 4．5h in a water bath at 33ħ ．The most effective osmotic stabilizer for the protoplast release was 1mol /LMgSO 4combined with phosphate buffer （pH 6．98）．P．asparagi protoplast regeneration results showed that the potato dextrose agar medium containing 0．6mol /Lsucrose was the best medium for regeneration．

Key words ：Phomopsis asparagi ；protoplast ；isolation ；regeneration 芦笋Asparagus officinalis L．是一种具有很高营养价值的保健型蔬菜。芦笋茎枯病是由天门冬拟茎

点霉Phmopsis asparagi 引起的重要真菌病害，俗称

。目前，芦笋“癌症”中国芦笋生产面积居世界第

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（[1**********]04），国家自然科基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（201003074），

学基金（31360426），江西省自然科学基金（20132BAB214020），江西省博士后科研择优资助项目

1981年生，mail ：pals2011@126．com 男，助理研究员，研究方向为芦笋生物工程，E-作者简介：张岳平，

*通讯作者（Author for correspondence ），E-mail ：genebksh@hotmail．com ；收稿日期：2013－07－03

一，茎枯病在我国发生特别严重，近年平均感染率超过50%，常导致成片绝收，已成为制约芦笋产业发

［1－3］

。该病重点为害茎杆或嫩展的主要瓶颈之一

病斑初呈水渍状条斑，后笋，也可侵染枝梗和拟叶，

渐变成暗黑色梭条形，中部赤褐色凹陷，大量小黑点状分生孢子器散生其上，最终导致整株枯死并迅速

［4］

传染至相邻植株。该病菌主要以分生孢子器或

适宜条件下进行初侵菌丝体在田间病残体上越冬，

［2－3，5］

。目前，生产上对芦笋茎枯病尚无染和再侵染

有效的化学防治方法，因为雨水是病害传播的重要媒介，一般采用设施避雨栽培进行病害预防。国内外芦笋茎枯病相关报道较多，但大都集中在病原菌

［6－8］

，尚命名、生物学特性、寄主和生物拮抗等方面

未见芦笋茎枯病菌的原生质体制备体系相关报道。为了有效地防治该病害，需对其进行分子生物学方面的相关探讨，鉴定致病相关基因，并分析其功能和调控机理，从而深入解析其致病机制。目前，利用原生质体进行分子转化技术已成为丝状真菌转化和相

［9－11］

。尽管关分子克隆技术体系的重要组成部分

近年来有关植物丝状真菌遗传转化方面的研究已有大量报道，但由于不同种类丝状真菌细胞结构，尤其是细胞壁的结构和组成存在着明显差异，因此制备原生质体的最佳条件和体系也存在着很大差异。本研究以芦笋茎枯病菌Pa1100菌株为试验材料，研究了其原生质体制备及再生的条件，以期为该病原菌的分子致病机制研究提供重要的方法基础。

NaCl 、MgSO 4，终浓度均为0．6mol /L，用于原萄糖、

生质体再生。

试剂与裂解酶：用于酶解系统的稳渗剂包括0. 7mol /LNaCl 、1mol /L山梨醇、0．6mol /L蔗糖、不同浓度的MgSO 4（用pH 6．98的10mmol /LPBS 配制），试验所用试剂均为国产分析纯。裂解酶中lyase 、driselase 购于Sigma 公司；snailase 购于北京索莱宝生物科技有限公司。1．2方法

1．2．1原生质体制备方法

菌株Pa1100在产孢培养基上25ħ 、光照12h /d培养10 14d ，收集孢子并制备成混匀的孢子悬液（1ˑ 108个/mL）。取1mL 置于100mL CM 液体培

25ħ 150r /min摇床培养3d ，养基中，收集新鲜菌丝1．2mol /LMgSO 4稳渗剂体1．0g ，无菌水洗涤2次，

洗涤3次，加入10mL 1．5%裂解酶（lyase ）+1. 5%蜗牛酶（snailase ）+1．0%崩溃酶（driselase ）的裂解酶混

33ħ 水浴酶合液（1．2mol /LMgSO 4稳渗剂配制），

解。血球计数板监测原生质体的形成数量，确定酶

解时间。用4层灭菌擦镜纸将原生质体液过滤，用山梨醇溶液（浓度为1mol /L）反复洗涤2 3次，取

5000r /min离心5min ，滤液，弃上清，用预冷山梨醇溶液重悬沉淀，离心，制备的原生质体沉淀重悬于山梨醇，置冰浴中备用。试验设3次重复，下同。1．2．2试验设置

菌龄：试验通过在CM 液体培养基中振荡培养芦笋茎枯病菌分生孢子以获得新鲜菌丝体，菌龄分2、3和4d 。别设置为1、

1．5%snailase 酶解体系：分别取1．5%lyase 、和1．0%driselase 及不同酶体系组合研究裂解酶对

芦笋茎枯病菌原生质体产量的影响。

酶解时间分析：选用经CM 液体培养基振荡培

33ħ 水浴养3d 的新鲜菌丝体进行原生质体制备，中共酶解6h ，且每隔30min 定期取样，显微镜下观

测分析原生质体生成情况。

稳渗剂分析：在酶解体系中，稳渗剂是保持生成的原生质体正常形态必需的环境条件，本试验分别1mol /L山梨醇、0．6mol /L蔗选择0．7mol /LNaCl 、

MgSO 4（用pH 6．98的10mol /LPBS 配制，糖、体积MgSO 4浓度分别设为1．0、比为MgSO 4ʒ PBS =3ʒ 1，

0．5和0．2mol /L）等不同的稳渗剂以分析其对芦笋茎枯病菌原生质体产量的影响。1．2．3原生质体再生过程

将原生质体用稳渗剂适当稀释后涂布于再生培

1材料与方法

1．1材料

供试菌株与培养基：供试菌株Pa1100，由本

2%的琼脂，实验室保存。燕麦培养基：5%燕麦片、

用于产孢。CM 液体培养基：20ˑ 硝酸盐50mL

KCl 10．4g 、MgSO 4·7H 2O 10．4g 、（NaNO 3120g 、

KH 2PO 430．4g ，微量元素混加水定容至1000mL ）、

7H 2O 2．2g 、H 3BO 31．1g 、MnCl 2·合液1mL （ZnSO 4·FeSO 4·7H 2O 0．5g 、CoCl 2·6H 2O 0．17g 、4H 2O 0．5g 、

CuSO 4·5H 2O 0．16g 、Na 2MoO 4·2H 2O 0．15g 、Na 4EDTA 5g ，加水定容至100mL ）、复合维生素液1mL （维生

维生素B 10．01g 、维素H 0．01g 、维生素B 60．01g 、

烟酸0．01g ，加生素B 20．01g 、对氨基苯甲酸0．01g 、

D-水定容至100mL ）、葡萄糖10g 、蛋白胨2g 、酵母

pH 提取物1g 、酪蛋白1g ，加水定容至1000mL ，6. 5，用于分生孢子培养并制备新鲜菌丝体。再生培

D-养基：在PDA 培养基（马铃薯200g 、葡萄糖20g 、琼脂18g 、加水定容至1000mL ）中分别加入蔗糖、葡

养基，在25ħ 下培养3 5d ，调查再生情况，对形成的菌落记数（A ）；以不含稳渗剂的PDA 培养基作对照（B ），计算再生率，再生率（%）=（A －B ）/总原生质体数ˑ 100。

1．2．4原生质体再生菌株的致病性鉴定

7

以浓度为1．0ˑ 10个/mL的原生质体再生菌

25ħ 、12h ：株分生孢子悬浮液喷雾接种芦笋嫩茎，

在单种酶作用下，酶解菌株Pa1100新鲜菌丝体时，

1．0%裂解酶解释放的原生质体产量较高，为7. 0ˑ

6106个/mL，1．5%蜗牛酶产量最少，为2．1ˑ 10/mL。当这几种裂解酶以不同的方式组合时，原生质体产量

均能不同程度地得到提高，其中以3种酶同时存在的

7

组合下效率最高，原生质体产量可达2．6ˑ 10/mL（表1）。

2．1．3酶解时间

在酶解初期，随着酶解时间的增加，原生质体不断从菌丝体中被释放，酶解1．5h 时原生质体产量

7

为0．5ˑ 10个/mL。当酶解4．5h 时新鲜菌丝体已基本被酶解完成，此时原生质体产量达最高，为2．8ˑ 107个/mL。继续延长酶解时间，原生质体产5．5h 时产量为2．0ˑ 10个/mL。说量出现下降，明，适当的酶解时间有利于芦笋茎枯病菌新鲜菌丝体的原生质体释放，但酶解时间过长则一方面酶的裂解效率会受到影响，另一方面会造成不断释放的原生质体较长时间暴露在酶解液中，原生质体膜会受到一定的破坏，从而不利于原生质体的总产量提高。

2．1．4稳渗剂类型

不同稳渗剂对原生质体的生成作用不同，用PBS 配制的1．0mol /LMgSO 4是Pa1100菌株释放原生质体较好的稳渗剂，产量为2．5ˑ 10/mL；其次是

6

1．0mol /L山梨醇，为9．1ˑ 10个/mL（表2）。低浓当度的MgSO 4不利于菌丝体充分释放原生质体，MgSO 4浓度降到0．2mol /L时原生质体显著下降。

77

12h 光照培养，7 10d 内检查症状反应，以原菌株Pa1100为对照。1．3数据分析

数据统计采用Excel 2007软件分析，利用SPSS13．0软件中One-Way ANOVA 方法进行方差分LSD 法进行多重比较。析，

2结果与分析

2．1原生质体的制备2．1．1菌龄

试验表明，培养3d 的新鲜菌丝体产生的原生质体相对最多，当菌龄增加时，获得的原生质体产量反而下降。说明不同菌龄对酶解作用过程中原生质体的产量影响明显，分生孢子培养时间过短，菌丝体过于幼嫩，酶解后形成的原生质体在释放后更易破裂；菌丝培养时间过长，菌丝细胞壁成分和结构改变，老化增厚，较难被成功酶解，造成原生质体产量减少。2．1．2裂解酶

芦笋茎枯病菌原生质体的产量受不同的裂解酶种类作用较大，且复合酶组合酶解效率高于单种酶。

表1不同裂解酶组合对芦笋茎枯病菌新鲜菌丝体原生质体产量的影响

Table 1Influences of different commercial enzyme combinations on the released protoplast of fresh mycelia

of Phomopsis asparagi Pa1100

裂解酶Enzyme 1．5%裂解酶1．5%Lyase 1．5%蜗牛酶1．5%Snailase 1．0%崩溃酶1．0%Driselase 1．5%裂解酶+1．5%蜗牛酶1．5%Lyase +1．5%Snailase 1．5%裂解酶+1．0%崩溃酶1．5%Lyase +1．0%Driselase 1．5%蜗牛酶+1．0%崩溃酶1．5%Snailase +1．0%Driselase

1．5%裂解酶+1．5%蜗牛酶+1．0%崩溃酶1．5%Lyase +1．5%Snailase +1．0%Driselase

不同小写字母分别表示经LSD 法检验差异显著（P ＜0．05）。Data in the table are mean ʃ SD．Different 表中数据为平均数ʃ 标准误，

lowercase letters indicate significant difference at P ＜0．05level by LSD test．

26．0ʃ 0．1a 12．5ʃ 0．4b

6

原生质体产量Protoplast （ˑ 10/mL）

3．8ʃ 0．2d 2．1ʃ 0．1d 7．0ʃ 0．5c 7．5ʃ 0．2c 15．6ʃ 0．7b

表2不同稳渗剂对芦笋茎枯病菌原生质体产量的影响

Table 2Influences of different osmotic stabilizers on the released protoplast of fresh mycelia of Phomopsis asparagi Pa1100

稳渗剂Osmotic stabilizer 0．7mol /L氯化钠0．7mol /LNaCl 1．0mol /L山梨醇1．0mol /LSorbital 0．6mol /L蔗糖0．6mol /LSucrose 1．0mol /L硫酸镁1．0mol /LMgSO 40．5mol /L硫酸镁0．5mol /LMgSO 40．2mol /L硫酸镁0．2mol /LMgSO 4

lowercase letters indicate significant difference at P ＜0．05level by LSD test．

6

原生质体产量Protoplast （ˑ 10/mL）

5．7ʃ 0．5c 9．1ʃ 0．1b 6．8ʃ 0．3c 25．0ʃ 0．6a 5．2ʃ 0．1c 0．6ʃ 0．0d

不同小写字母分别表示经LSD 法检验差异显著（P ＜0．05）。Data in the table are mean ʃ SD．Different 表中数据为平均数ʃ 标准误，

2．1．5原生质体的形态观测

芦笋茎枯病菌原生质体的形态呈圆形，相对比

较规则，释放后原生质体的体积具有较为明显的变化，初释放时体积较小，随着在等渗液中时间的延长，体积有加大的趋势，部分原生质体出现较大的液泡。原生质体直径大小为4．0 11．0μm ，平均约为7．0μm （图1）

。

图1芦笋茎枯病菌原生质体形态

Fig．1Protoplast morphology of Phomopsis asparagi Pa1100

2．2原生质体的再生

2．2．1稳渗剂对原生质体再生的影响

0．6mol /L的蔗糖作为稳渗剂时，菌株原生质体0．7mol /LNaCl 作为稳渗的再生率最高，为24．0%，剂时再生率较低（图2）。

2．2．2酶解时间对原生质体再生的影响

4．5h 时酶解3 5h 原生质体再生率差别不大，最高，为22．0%，酶解时间过长不利于原生质体的再生（图2）。这说明裂解酶对生成的原生质体质膜系统具有一定的破坏作用，原生质体的再生效率受到酶解时间长短的影响。

2．3原生质体再生菌株的致病性鉴定

芦笋茎枯病菌原生质体再生菌株在OA

产孢培

图2不同稳渗剂和酶解时间对原生质体再生的影响Fig．2Influences of different osmotic stabilizers and

digestion time on regeneration of protoplast

养基上培养获得的分生孢子与原菌株Pa1100分生

孢子的形态学特征经比较，无明显差异。进一步利用分生孢子进行了致病接种分析，当分别以1．0ˑ 107浓度的再生菌株和原菌株分生孢子喷雾接种感病芦笋品种后，再生菌株与原菌株表现出相同的致病力和致病症状，表明原生质体再生菌株的致病力并没有发生改变。

3讨论

生长时间较短的新鲜菌丝体是制备真菌原生质

186植物保护学

［14］

报41卷

体的重要材料，本研究表明，由芦笋茎枯病菌的分生

孢子在CM 液体培养基中振荡培养3d 后获得的新鲜菌丝体比较适合原生质体的制备，进一步延长培养时间会造成原生质体产量下降，这与前人研究结果一致

，可能的原因是过长的培养时间导致菌丝体细胞壁成分改变，不利于裂解酶的破壁和原生

［9］质体的形成和释放。徐齐君等、卢明锋和张月［10］［11］

周礼红等报道，丝状真菌细胞壁结构复杰、

［12－13］

等的研究结果一致。此外，通过原生质体再生获

得的芦笋茎枯病菌菌株的致病力变化是后续研究的

重要基础，本研究进一步分析了再生菌株的致病力特征，结果表明，再生菌株保持了与原菌株相同的致病特征和致病力。本研究构建了芦笋茎枯病菌原生质体制备与再生体系，探明了相关因素对体系构建的影响，为进一步建立病原菌的分子转化体系、致病相关基因研究和致病机制解析提供了重要的材料基础。

参考文献（Ｒeferences）

［1］张岳平，陈光宇，罗绍春，等．芦笋重要真菌病害研究进

2012，28（31）：114－119展．中国农学通报，

［2］陈光宇．中国芦笋研究与产业发展．北京：中国农业出版

2010社，

［3］陈光宇．芦笋无公害生产技术．北京：中国农业出版社，

2005

［4］Zhang Y ，Chen G ，Luo S ，et al．Stress physiology and viru-lence characterization of Phomopsis asparagi （Sacc．）Bubákisolated from asparagus in Jiangxi Province of China．Agricul-tural Science ＆Technology ，2012，13（7）：1502－1508［5］Davis ＲD．Asparagus stem blight recorded in Australia．Aus-tralasian Plant Pathology ，2001，30：181－182

［6］Udayanga D ，Liu X ，McKenzie E H C ，et al．The genus Pho-mopsis ：biology ，applications ，species concepts and names of common phytopathogens．Fungal Diversity ，2011，50：189－225［7］刘克均，张凤如，陈永萱．芦笋茎枯病病原菌的订正．真菌

1991，10（4）：329－330学报，

［8］刘志恒，孙俊，杨红，等．芦笋茎枯病菌生物学特性的研

2008，39（3）：301－304究．沈阳农业大学学报，

［9］徐齐君，胡小平，陈婷，等．PEG 介导的棉花枯萎病菌原生

2012，24（3）：222－228质体转化体系的建立．棉花学报，

［10］卢明锋，张月杰．丝状真菌AL18的原生质体制备和再生

2012，22（3）：86－90条件的优化．生物技术，

［11］周礼红，李国琴，王正祥，等．红曲霉原生质体的制备、再

2005，27（3）：423－428生及其遗传转化系统．遗传，

［12］周益军，范永坚，王金生，等．稻瘟病菌原生质体的制备

和再生菌株的致病性．江苏农业科学，2000，16（2）：83－87

［13］张玮，燕继晔，郭霞，等．葡萄溃疡病菌原生质体的制备

2012，38（5）：27－30与再生条件的优化．植物保护，

［14］宋庆涛，张国珍，董金皋．玉米大斑病菌原生质体的制备

2003，30（2）：41－44与再生．微生物学通报，

杂，主要由几丁质、半纤维素和蛋白质等多成分构

成，单种酶只能降解其中的一种或几种成分，从而造成破壁效果较差，不利于获得较高产量的原生质体。本试验表明，单种酶中，崩溃酶裂解获得的原生质体产量最多，这可能与其是一种复合酶，内含昆布多糖

［12］

酶、木聚糖酶和纤维素酶，破壁能力强有关；蜗牛酶和裂解酶也是复合酶，但效果不及崩溃酶；当上述3种酶复合组配使用后，相同条件下原生质体产量显著增加。本试验结果还表明，除裂解酶种类外，不同酶浓度的选择也是影响原生质体制备的重要因素之一，过低浓度会造成破壁不理想从而影响产量，过高的酶液则造成浪费且对生成的原生质体不利，本试验中使用1% 1．5%的3种酶的混合使用酶解效果较好。此外，酶解4．5h 后新鲜菌丝体已基本

7

被酶解完成，原生质体产量可达2．8ˑ 10个/mL，继续酶解则会对已释放的原生质体产生一定的破坏，反而导致产量下降。稳渗剂的选择与不同菌种特性有关，合适的稳渗剂对获得高产原生质体至关

PBS 配制的1．0mol /LMgSO 4可重要，本试验表明，作为菌株Pa1100制备原生质体较理想的稳渗剂，可能的原因是过低浓度的稳渗剂造成酶解体系的渗透

压过低，不利于酶解液渗透并破坏菌丝体细胞壁，也不利于生成的原生质体保持正常形态，这充分表明在酶解体系中，稳渗剂的合理选择对芦笋茎枯病菌原生质体的形成非常重要。

原生质体的高效再生是后期深入研究其致病分子机制的必需条件，本试验明确了适合于芦笋茎枯病菌原生质体再生的酶解时间及稳渗剂种类，酶解3 5h 原生质体可获得较高的再生率，酶解时间过长不利于原生质体的再生；以0．6mol /L的蔗糖作为稳渗剂时，菌株原生质体的再生率最高。相对于无机盐，山梨醇和蔗糖等作为稳渗剂时可获得较高

［11］

的原生质体再生率，这与周礼红等和宋庆涛

（责任编辑：高峰）