牛细小病毒病毒样颗粒的组装及其免疫原性评价_张越

第36卷第12期2014年12月

中国预防兽医学报

Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine

Vol. 36，No.12Dec. 2014

doi:10.3969/j.issn.1008-0589.2014.12.04

牛细小病毒病毒样颗粒的组装及其免疫原性评价

张

越，常继涛，于

力*

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/牛羊传染病研究创新团队，黑龙江哈尔滨150001)

摘要：为研究牛细小病毒(BPV)VP2衣壳蛋白自组装病毒样颗粒(VLPs)以及VLPs 的免疫原性。本研究以

BPV-1型C7-5中国分离株的基因组序列为模板扩增VP2蛋白的编码基因，将其克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV 中，利用E.coli BJ5183内同源重组将VP2基因插入腺病毒骨架质粒pAdEasy-1中，获得携带BPV VP2基因的重组腺病毒质粒(pAd-BPV-VP2)。该重组质粒经Pac Ⅰ线性化后转染Ad293细胞，获得重组腺病毒rAd-BPV-VP2，第8代时滴度为107.25TCID 50/mL。间接免疫荧光、western blot 以及电镜观察结果显示，BPV VP2蛋白可以在腺病毒系统中稳定表达，并有效组装VLPs 。将rAd-BPV-VP2肌肉注射免疫BALB/c小鼠，结果显示，针对BPV 的血清IgG 和中和(VN)抗体分别于加强免疫后2周和8周达最高水平，高峰抗体可持续至15周，VN 抗体的最高滴度可达1∶4000。此外，与对照小鼠血清相比，免疫小鼠血清中的IL-2、IL-4及IFN-γ含量显著升高(p

关键词：牛细小病毒；病毒样颗粒；免疫原性中图分类号：S852.65

文献标识码：A

文章编号：1008-0589(2014)12-0930-05

Assembly and immunogenicity of bovine

parvovirus virus-like particles

ZHANG Yue, CHANG Ji-tao, YU Li *

（Division of Livestock Infectious Disease, State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin Veterinary Research Institute,

Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150001, China)

Abstract :To evaluate the efficiency of self-assembling the VP2capsid proteins of bovine parvovirus (BPV)to virus-like particles (VLPs)and the immunogenicity of the VLPs, the BPV VP2gene was amplified using the genomic DNA of BPV-1Chinese isolate C7-5as a template and cloned into the pShuttle-CMV plasmid. Recombinant adenovirus plasmid pAd-BPV-VP2was constructed by homologous recombination with the adenoviral backbone plasmid pAdEasy-1in E.coli BJ5183cells, which was linearized by Pac I and transfected into Ad293cells for package to generate the recombinant adenovirus rAd-BPV-VP2. The titer of the rAd-BPV-VP2reached to 107.25TCID 50/mLafter eighth passages in Ad293cells, and the VP2protein of BPV was stably expressed and assembled efficiently into VLPs in rAd-BPV-VP2infected cells detected by indirect immunoflourescent assay, western blot and electronic microscopy. In addition, anti-BPV IgG and viral neutralizing (VN)antibody were induced in mice by intramuscular inoculation with rAd-BPV-VP2. The peak titers of the serum IgG and VN antibody (1∶4000) against BPV were produced at 2and 8weeks post-inoculation (p.i.),respectively, and the durations of the highest titers of IgG and VN antibody were lasted for 15weeks. Furthermore, comparing to the control serum, the level of IL-2, IL-4and IFN-γincreased significantly (p

收稿日期：2014-03-03

基金项目：国家科技计划课题(2012BAD12B03-3)

作者简介：张越(1989)，女，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，主要从事动物病毒学研究. *通信作者：E-mail ：[email protected]

第12期张越，等. 牛细小病毒病毒样颗粒的组装及其免疫原性评价931

high levels of both humoral and cellular immunoresponses against BPV infection.

Key words :bovine parvovirus; virus-like particles; immunogenicity

牛细小病毒(Bovineparvovirus ，BPV) 为细小病毒科博卡病毒属病毒，无囊膜，粒子大小约为25nm ，基因组由5515nt 的单链DNA 组成，具有3个开放阅读框(ORF)，分别是编码非结构蛋白NS1、NS2的左ORF ，编码非结构蛋白NP1的中间ORF 和编码结构蛋白VP1、VP2和VP3的右ORF [1]。病毒衣壳由60个VP1和VP2重叠组成，VP1包含了整个VP2和额外N 端作用域，但仅编码衣壳很小一部分，而VP2是病毒衣壳主要的结构蛋白，约占衣壳蛋白的80%，并且有研究表明部分细小病毒的VP2可以自我组装形成病毒样颗粒(Virus-likeparticles, VLPs) 。VLPs 是由病毒衣壳蛋白或由衣壳蛋白和囊膜蛋白自主包装形成的空衣壳结构，由于没有遗传物质，其形态和结构与天然病毒粒子相似，能够有效刺激机体产生体液和细胞免疫，因此VLPs 疫苗比传统疫苗、亚单位疫苗具有优越性[2]，并已成为预防病毒病的潜在候选疫苗。

BPV 感染是引起母牛生殖机能障碍和犊牛呼吸、消化器官疾患的一种接触性传染病[3]，目前研究较少。利用杆状病毒系统表达犬细小病毒和猪细小病毒VP2蛋白，结果表明其可以自主装成VLPs ，免疫后可以得到有效保护[3-4]。采用人细小病毒B19VLPs 疫苗免疫能够诱导机体产生针对人细小病毒的中和抗体[5]。因此我们于2012年在国内首次分离获得BPV ，本研究应用腺病毒系统表达BPV VP2蛋白并组装成VLPs ，为BPV 的免疫预防研究及载体开发研究奠定了基础[6-7]。

染试剂盒购自QIAGEN 公司；DNA 凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、基因组DNA 小量试剂盒购自Axygen 公司；Mouse IL-2/IL-4/IFN-γELISA Ready-SET-Go 试剂盒购自eBioscience 公司；HRP 羊标记抗鼠IgG (HRP-IgG)、荧光标记羊抗鼠IgG (FITC-IgG)购自Sigma 公司；EZ-Sep TM Mouse 1X 淋巴细胞分离液购自达科公司；引物由博仕生物科技有限公司合成；鼠源BPV VP2蛋白阳性血清、鼠源BPV 阳性血清由本实验室制备。１．３

目的基因的扩增及重组质粒的构建

采用基因

组DNA 小量试剂盒提取BPV-1型C7-5株DNA ，以其为模板，利用引物GGGTATCAAATGATATAC-3'(Sal Ⅰ(Hin d Ⅲ) 扩增VP2基因。PCR 扩增条件为：94℃5min ；94℃40s 、55℃40s 、72℃100s ，共30个循环；72℃10min 。PCR 产物及腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV 经Sal Ⅰ和Hin d Ⅲ双酶切，构建穿梭重组质粒pShuttle-CMV-BPV-VP2。经Pme Ⅰ酶切将pShuttle-CMV-BPV-VP2线性化，电转化至携带腺病毒骨架载体pAdEasy-1的E.coli BJ5183中制备重组腺病毒质粒pAd-BPV-VP2，并将其转化DH5α进行重组菌扩增。１．４

重组病毒的制备

提取的pAd-BPV-VP2，经

Pac Ⅰ酶切线性化后，利用转染试剂将其转染Ad293

细胞制备表达VP2蛋白的重组腺病毒rAd-BPV-VP2。将获得的初代病变细胞培养物反复冻融后，离心取上清液，接种Ad293细胞，连续传8代，观察细胞病变(CPE)并测定病毒滴度TCID 50。１．５

目的蛋白的间接免疫荧光（ＩＦＡ）检测

将

１

１．１

材料和方法

病毒株、菌株、载体及细胞

BPV-1型C7-5

rAd-BPV-VP2接种于单层Ad293细胞中，待出现CPE ，采用预冷的无水乙醇4℃对rAd-BPV-VP2感染的Ad293细胞固定15min ，同时将wAd 感染Ad293细胞为对照。以BPV-VP2阳性血清作为一抗，羊抗鼠FITC-IgG (1∶200) 为二抗，荧光显微镜下观察。

１．６目的蛋白的ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定收集rAd-BPV-VP2

中国分离株由本研究团队分离鉴定；牛睾丸(BT)细胞、DH5α感受态菌、腺病毒骨架载体pAdEasy-1的

E.coli BJ5183感受态菌和野生型腺病毒(wAd)由本实

验室保存；腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV 及Ad293细胞购自Stratagene 公司。１．２

主要试剂

限制性内切酶购自NEB 公司；转

932中国预防兽医学报2014年

感染的Ad293细胞，同时将wAd 感染的Ad293细胞作为对照，裂解后经SDS-PAGE 电泳后，转至NT 膜，以BPV-VP2阳性血清为一抗，羊抗鼠HRP-IgG (1:5000) 为二抗，DAB 显色进行western blot 鉴定。１．７

ＢＰＶＶＬＰｓ的电镜观察

收集rAd-BPV-VP2感

染的Ad293细胞，反复冻融3次后12000r/min4℃离心10min ，保留上清液，与BPV-VP2阳性血清，在37℃作用2h 后4℃过夜，12000r/min4℃离心30min ，经PBS 溶解沉淀，通过负染电子显微镜观察BPV VLPs 的组装情况。１．８

免疫指标的检测

将36只6周龄BALB/c雌

鼠，随机分为两组。第一组通过腿部肌肉注射第8代的rAd-BPV-VP2病毒液；第二组以同种方式和剂量注射wAd 病毒液，作为阴性对照组，两组分别在一免后4周同样剂量加强免疫。免疫后每3周采用摘眼球方法进行采血，分离血清进行免疫指标检测。

ＶＰ２的制备以提取BPV-1型C7-5株DNA 为模

板，采用特异性引物对BPV VP2基因进行扩增，经琼脂凝胶电泳检测，结果显示扩增片段约为1600bp (图1) ，与预期大小一致。将VP2克隆于pShuttle-CMV 中，构建穿梭重组质粒pShuttle-CMV-BPV-VP2，经Sal Ⅰ和Hin d Ⅲ双酶切获得1600bp 和7500bp 片段，鉴定结果与预期相符(图1) 。序列分析结果显示，克隆的目的基因与BPV VP2基因相一致。表明VP2基因已正确克隆至pShuttle-CMV 载体。将穿梭重组质粒电转化E.coli BJ5183中构建重组腺病毒质粒pAd-BPV-VP2。

10000bp 7000bp 4000bp 2000bp

1000bp

1.8.1免疫鼠IgG 抗体的检测将BPV-1型C7-5

1:PCR product of BPV VP2gene; 2:The digestions of

pShuttle-CMV-BPV-VP2with Sal Ⅰand Hin d Ⅲ; M:DL10000Marker

BPV VP2基因的PCR 扩增及重组质粒pShuttle-CMV-BPV-VP2的酶切鉴定

PCR amplification of BPV VP2gene and identification of

pShuttle-CMV-BPV-VP2图1

株纯化病毒液采用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释，以2μg/mL的浓度包被酶标板，4℃包被过夜；5%脱脂乳封闭，以被检鼠血清(1∶100) 为一抗，同时设立鼠源BPV 阳性血清和BALB/c小鼠阴性血清为对照组；以HRP-IgG 抗体(1∶2500) 为二抗，通过TMB 底物显色，检测其OD 450nm 值。

Fig.1

２．２

采取固定病毒

重组腺病毒ｒＡｄ－ＢＰＶ－ＶＰ２的制备及鉴定将

1.8.2免疫鼠中和(VN)抗体的检测pAd-BPV-VP2转染Ad-293细胞后6d 出现CPE ，即获得重组腺病毒rAd-BPV-VP2。将rAd-BPV-VP2传至第8代，测定其滴度为107.25TCID 50/mL。利用鼠源BPV VP2阳性血清进行IFA 检测，结果显示，rAd-BPV-VP2感染的细胞出现明显的荧光(图2A) 。Western blot 鉴定结果显示，rAd-BPV-VP2感染细胞与VP2阳性血清发生特异性反应，表达的VP2重组蛋白大小约为64ku (图2B) 。表明BPV VP2蛋白在rAd-BPV-VP2中获得表达，并且表达的蛋白具有良好的反应原性。２．３

ＢＰＶＶＬＰｓ的鉴定

收集rAd-BPV-VP2感染

Ad293细胞的上清液，将其与鼠源BPV VP2蛋白的阳性血清进行免疫沉淀，通过负染进行电镜观察。结果显示，负染后电镜观察到VLPs ，无囊膜，大小与BPV 病毒粒子相似，约为25nm (图3) 。表明BPV VP2蛋白可以自行组装成VLPs 。２．４

ＢＰＶＶＬＰｓ免疫原性评价

稀释血清法，将被检小鼠血清(56℃灭活30min) 进行2倍倍比稀释，分别与400TCID 50的BPV-1C7-5株混合，37℃作用1h 后；再加入5×104个/孔BT 细胞悬液，培养6d 。将能够保护50%的细胞孔不出现CPE 的血清稀释度，判定为小鼠血清VN 抗体效价。

1.8.3免疫鼠细胞因子检测取免疫rAd-BPV-VP2

小鼠的脾脏，采用淋巴细胞分离液分离小鼠淋巴细胞。将纯化BPV (1mg/mL)与经洗涤后重悬小鼠淋巴细胞混合，8μL/孔加入96孔板培养36h ，按照Mouse IL-2/IL-4/IFN-γELISA Ready-SET-Go 试剂盒检测细胞因子IL-2/IL-4/IFN-γ。

２

２．１

结果

ＢＰＶＶＰ２基因的扩增及重组质粒ｐＡｄ－ＢＰＶ－

第12期张越，等. 牛细小病毒病毒样颗粒的组装及其免疫原性评价933

2.4.1免疫鼠IgG 抗体的检测利用间接ELISA 方

法对血清样品中BPV 特异性抗体进行检测，结果显示，rAd-BPV-VP2组在二免后血清IgG 抗体水平显著升高，并且在二免后2周达到高峰，15周时抗体水平有所下降，但仍能维持较高水平；wAd 组未检测到OD 450nm 值的变化(图4A) 。表明rAd-BPV-VP2在小鼠体内可以诱导机体产生抗BPV 抗体。

A 12M

B 130ku 100ku 70ku 55ku

1:Ad293cells infected with rAd-BPV-VP2;

2:Ad293cells infected with wAd; M:Protein Marker 图2

重组腺病毒rAd-BPV-VP2的IFA (A)和

western blot (B)鉴定

Identification of the rAd-BPV-VP2by IFA (A)

and western blot (B)

40ku

2.4.2免疫鼠VN 的检测采用固定病毒稀释血清

Fig.2

的中和试验方法，对小鼠血清中抗BPV 的VN 抗体进行检测，结果显示，rAd-BPV-VP2组在首免后3周产生VN 抗体，在二免后9周达到峰值，效价高达1∶4000以上，在15周时VN 抗体开始下降，但效价仍能达到1∶1700；wAd 组未检测VN 抗体(图4B) 。

2.4.3免疫鼠细胞因子检测为了初步评价BPV

VLP 诱导细胞免疫情况，分别对免疫rAd-BPV-VP2和wAd 后15周的3只小鼠，利用Mouse IL-2/IL-4/IFN-γELISA Ready-SET-Go 试剂盒进行IL-2、IL-4及IFN-γ细胞因子含量的检测。结果显示，rAd-BPV-VP2组的IL-2、IL-4及IFN-γ细胞因子含量均显著高于wAd 组(p

200nm

图3BPV VLPs 的形态学观察

Morphology of BPV VLPs under transmission electron

microscope (Bar=200nm)

Fig.3

1.0

0.5

2nd immunization

0.0

B P V V N a n t i b o d y t i t e r

1.5O D 450n m v a l u e

rAd-BPV-VP2wAd

[**************]20

rAd-BPV-VP2wAd

2nd immunization 6

03691215

Weeks after initialimmunization Weeks after initialimmunization

A:Antibody titers detected by indirect ELISA; B:Virus neutralization test

图4免疫小鼠血清中BPV 抗体(A)和VN 抗体(B)的检测

Detection of serum antibody(A)and VN antibody(B)against BPV in immunized mice

40I L -4(p g /m L )

I F N γ(p g /m L )

3020

*:p

100

rAd-BPV-VP2wAd

[1**********]

*:p

rAd-BPV-VP2wAd

Fig.41000I L -2(p g /m L )

[1**********]00

*:p

Fig.5

图5免疫小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2、IL-4以及IFN-γ细胞因子的检测

Detection of IL-2, IL-4and IFN-γcytokines secreted in splenocytes of immunized mice

934中国预防兽医学报2014年

３讨论参考文献：

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(本文编辑：任安琦)

BPV 为细小病毒科博卡病毒属的成员之一，是在分离感染消化道疾病牛群病原体和血清学调查中较为常见并且发病率高、与牛其他呼吸及消化器官共同感染、在犊牛中更易发病的病毒[7]。可能由于病毒感染后症状较温和，目前研究BPV 的逐渐减少。BPV 的主要衣壳蛋白VP2和次要衣壳VP1、VP3存在中和表位。本实验室将BPV C7-5中国分离株与BPV 1型比对，同源性高达为98.5%[8]，本研究利用腺病毒表达系统表达VP2，通过电镜观察到的VLPs 与BPV 大小相似，表明VP2在真核表达体系中可以自我装配并形成VLPs ，将重组腺病毒免疫BALB/c雌鼠，检测产生的中和抗体效价、细胞因子的含量显著高于对照组，表明重组病毒能够模拟天然病毒，诱导机体产生良好的体液免疫与细胞免疫反应。

目前，已有研究表明细小病毒VP2蛋白自组装形成VLPs 可作为疫苗载体，具有表达量大、理化特性稳定及免疫原性良好等独特优势，如人细小病毒、犬细小病毒及猪细小病毒的VLPs 均能够有效展示外源表位，重组VLPs 免疫动物均能产生针对细小病毒及外源表位的免疫反应[9-11]。从此推测，BPV 可以作为理想的疫苗载体进行开发研究，本研究结果为进行表位展示及多价疫苗载体进行开发研究奠定基础。