2012年生物化学实验B
姓 名：学 号：实验时间：实验分组：组内成员： 任课教师：实验报告
XXXX 2012年11月17日
摘要
本实验通过从小牛肠中通过刮去，离心，析出等方式提取小牛肠碱性磷酸酶，再通过SDS-聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质相对分子量，利用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量及测定酶的活性。
1. 实验部分
1.1试剂与仪器
1. 试剂：
（1）正丁醇、丙酮。
（2）1 mol/L 醋酸，1 mol/L NaOH，硫酸铵。 （3）平衡缓冲液：0.01 mol/L Tris-HCl，pH 8.0。 （4）底物缓冲液：1 mol/L 二乙醇胺-盐酸缓冲液。
（5）酶的底物溶液：用底物缓冲液配制15×10-3 mol/L 对硝基苯磷酸二钠溶液。 （6）30% 丙烯酰胺置棕色瓶。
（7）分离胶缓冲液：1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.8，已加入10% SDS。 （8）浓缩胶缓冲液：0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液，pH 6.8，已加入10% SDS。 （9）10% 过硫酸铵。
（10）TEMED （四甲基乙二胺）。
（11）上样缓冲液：称100 mg SDS、2 mg溴酚蓝、2 g甘油，加0.1 mL巯基乙醇、2 mL 0.05mol/L pH 8.0 Tris-HCl，加超纯水定容至10 mL。
（12）染色液：配置含0.1% 考马斯亮蓝R250，40%甲醇和10%冰醋酸的染色液500 mL，过滤后备用。
（13）脱色液：500 mL 10%甲醇和10%冰醋酸的脱色液1000 mL。 （14）电泳缓冲液。 2. 仪器
匀浆机、eppebdorf5型冷冻离心机、GSY —2型恒温水浴、UV762型紫外可见分光光度计。离心管，剪刀，载玻片，不锈钢盘，搪瓷盘，滤布，漏斗，分液漏斗，量筒，烧杯，移液抢，比色皿，DYY —11型电泳仪，24D 型电泳槽，制胶板，揺床，移液枪。
1.2 小牛肠碱性磷酸酶提取方法
1）取新鲜小牛肠，用剪刀剖开，用载玻片刮取小肠内粘膜，放到盘子一角。
2）将小肠粘膜液集中倒入匀浆机中，加冰冷蒸馏水，高速匀浆，重复多次。 3）缓慢加入冰冷正丁醇高速匀浆重复多次。在4℃，10000 rpm条件下离心。 4）用滤布过滤去除杂质，倒入分液漏斗中，静止分层，取下层水相，用HAc 溶液调pH 到4.9。4℃，10000 rpm，离心。
5）得到上清后放入离心管中，用NaOH 溶液调pH 至6.5，称取硫酸铵加到离心管中溶解；再加冰冷丙酮，混匀，4℃静置30 min以上。4℃，10000 rpm，离心。
6）上清液中加入冰冷丙酮，4℃放置30 min以上。4℃，10000 rpm，离心。 7）取沉淀溶于平衡缓冲液至全部溶解至冰箱保存待用。 8）底物处理：底物37℃水浴5 min。
1.3 小牛肠碱性磷酸酶酶活检测方法
1）将酶稀释10倍。
2）紫外分光光度计检测条件为405 nm 波长，测定时间60 s ，取值2 s ，记录范围0.0-1.5。3）取2个2 mL比色皿，加入上述（2）加热的底物缓冲液，校对归零。
4）将稀释10倍的酶液加到其中1个比色皿中（仪器外侧），用手堵住皿口。快速
上下倒2次，放回分光光度计中，测定酶动力学曲线
1.4 聚丙烯凝胶制备
1）装板：将垂直板型电泳的玻璃片洗净、晾干；放好胶条，用夹子夹好玻璃板，上面插上梳子，垂直放置在水平台面上备用。
2）制备分离胶：在小烧杯中按下表配制所需浓度的分离胶。
分离胶制备（浓度10%，制备量10 mL）
试剂 用量 H 2O
30% 丙烯酰胺
1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液pH 8.8
10% 过硫酸铵
TEMED
3）制备浓缩胶：在小烧杯中按下表配制所需浓度的浓缩胶。
4.1 mL 3.4 mL 2.4 mL 100 μL 10 μL
浓缩胶制备（浓度5%，制备量6 mL） 试剂 H 2O
30% 丙烯酰胺
0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液pH 6.8
10% 过硫酸铵
TEMED
4）蛋白样品处理：在1.5 mL离心管中按1：1体积比例，加样品和上样缓冲液，100 C 加热使蛋白变性。
5）浓缩胶完全聚合后，去掉夹子和胶条，拔去梳子，将凝胶玻璃板固定于电泳装置内槽上，加入电泳缓冲液，缓冲液高过玻璃板凹面。
用量 3.4 mL 1.0 mL 1.5 mL 60 μL 8 μL
1.5 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
1）玻璃试管中加入考马斯亮蓝。
2）在1.5 mL离心管中，取酶液分别稀释50、100、200倍。
3）各取100 μL 加入到5 mL考马斯亮蓝试管中，混匀，反应5 min以上。 4）紫外分光光度计检测条件：595 nm 波长。
5）取2个比色皿，加入考马斯亮蓝，分光光度计中校对归零。 6）将样品放入外侧比色皿中，读吸光值。 7）根据蛋白浓度标准曲线，计算酶蛋白浓度。
1.6 SDS-聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质相对分子量
1）用移液枪依次在泳道加样。
2）电泳：连接正、负极，待溴酚兰指示剂迁移至下沿处，停止电泳。
3）剥胶染色：电泳结束后，取出凝胶玻璃板，用水冲洗，将剥离下来的凝胶用水漂洗，转入染色缸中，加染色液，置摇床染色。
4）脱色：染色完毕，回收染色液，用水漂洗，加入脱色液，置摇床脱色，脱色至背景清晰。
5）观察测定蛋白的迁移率及条带，对照标准样品，分析蛋白样品的分子量及纯度。 6）拍照电泳结果，用于完成实验报告。
2. 结果与讨论
2.1小牛肠碱性磷酸酶酶活检测
根据酶动力计算公式：
∆A/min ⨯ VR ⨯ D
比活力（U/mg）＝
E 405 ⨯ VE ⨯ C ⨯ L
根据上图，∆A/min=3.5/min； VR =1.50002ml； D=10；
E405=18.3L/(mol*cm)； VE =0.00002ml； C=19.35mg/ml. L=0.5cm；
所以比活力（U/mg）=1. 48*10U/mg；
4
2.2 SDS-聚丙烯凝胶电泳
分析知，mark 中出现了三条蛋白质标记线，根据其间距及参考文献中给出的mark 泳道各条蛋白质标记线间距，可判定由上到下mark 泳道中的三条蛋白质标记线分别是兔磷酸化酶B ，牛血清白蛋白，兔肌动蛋白。样品蛋白质标记线与牛血清白蛋白迁移率相近，所以样品的分子量与牛血清白蛋白分子量相近，所以样品的分子量大致为66,200/mol.
2.3考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
根据考马斯亮蓝常量法测蛋白质标准曲线，其方程为：y=0.697x-0.007； 蛋白质稀释50倍的情况下测得吸光值为0.2625，根据方程，稀释50倍时蛋白质浓度C=0.387mg/ml，则原蛋白质浓度C=19.35mg/ml。
2.4小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活测定一些问题的讨论
1、测定底物浓度对酶反应速度的影响时，对酶反应的哪些条件要加以控制？本实验所取的条件是什么?
答：要对反应温度，酶浓度进行控制，本实验中反应温度为37℃，酶浓度为在原来
酶浓度的基础上稀释10倍。
2、为什么实验中能以平均速度表示反应的瞬时速度?
答：因为酶催化的反应速率与底物浓度有关，本实验中底物远远过量，所以可以
以平均速度表示反应的瞬时速度。
3、你认为实验中的关键步骤或值得注意的步骤是什么？
答：最关键的地方在于提取酶的时候要在低温环境下，免得酶失活，另外，测定酶活力的时候底物预热后要立即进行反应，防止底物提前分解影响实验结果。
4、本次实验的感受是什么？
答：本实验要细心，每个步骤都要认真搞懂原理的情况下再操作，免得破坏酶的活性影响实验结果。
2.5 SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量一些问题的讨论
1、用SDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量时为什么要用巯基乙醇？
答：保持蛋白质的二级结构。蛋白中如果有二硫键存在的话，会容易被氧化断开，有了巯基乙醇（还原性的物质）就可以免除这一隐患
2、SDS 在该电泳方法中的作用是什么？
答：在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，加入一定量的十二烷基硫酸钠
（SDS ），形成蛋白质-SDS 复合物，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。根据标准样品在该系统电泳中所作出的标准曲线，推算出被测蛋白样品分子量的近似值。
3、分析自己实验的成败原因。
答：本实验中我们组的mark 样品只有三条标记线，是分子量最多的三条，说明分子量小的蛋白质电泳进行得快，超出了凝胶的范围，所以没有在图像上有所体现。原因是电泳时间过长或电压过大造成的，因此应该适当减少电泳的时间或减少，免得分子量小的蛋白质“跑过头”。
参考文献：
[1]修志龙等. 生物化学[M].化学工业出版社.2008.
[2]许文涛等.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳快速染脱色方法的比较研究. 食品科学[J]. 2004,Vol.25.No.增
{3}孙士青等. 考马斯亮蓝法快速测定乳品中蛋白质含量. 山东科学[J].2011.24(6)
[4]栾雨时, 包永明.. 生物工程实验技术手册[M].化学工业出版社.2005
2012年生物化学实验B
姓 名：学 号：实验时间：实验分组：组内成员： 任课教师：实验报告
XXXX 2012年11月17日
摘要
本实验通过从小牛肠中通过刮去，离心，析出等方式提取小牛肠碱性磷酸酶，再通过SDS-聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质相对分子量，利用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量及测定酶的活性。
1. 实验部分
1.1试剂与仪器
1. 试剂：
（1）正丁醇、丙酮。
（2）1 mol/L 醋酸，1 mol/L NaOH，硫酸铵。 （3）平衡缓冲液：0.01 mol/L Tris-HCl，pH 8.0。 （4）底物缓冲液：1 mol/L 二乙醇胺-盐酸缓冲液。
（5）酶的底物溶液：用底物缓冲液配制15×10-3 mol/L 对硝基苯磷酸二钠溶液。 （6）30% 丙烯酰胺置棕色瓶。
（7）分离胶缓冲液：1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.8，已加入10% SDS。 （8）浓缩胶缓冲液：0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液，pH 6.8，已加入10% SDS。 （9）10% 过硫酸铵。
（10）TEMED （四甲基乙二胺）。
（11）上样缓冲液：称100 mg SDS、2 mg溴酚蓝、2 g甘油，加0.1 mL巯基乙醇、2 mL 0.05mol/L pH 8.0 Tris-HCl，加超纯水定容至10 mL。
（12）染色液：配置含0.1% 考马斯亮蓝R250，40%甲醇和10%冰醋酸的染色液500 mL，过滤后备用。
（13）脱色液：500 mL 10%甲醇和10%冰醋酸的脱色液1000 mL。 （14）电泳缓冲液。 2. 仪器
匀浆机、eppebdorf5型冷冻离心机、GSY —2型恒温水浴、UV762型紫外可见分光光度计。离心管，剪刀，载玻片，不锈钢盘，搪瓷盘，滤布，漏斗，分液漏斗，量筒，烧杯，移液抢，比色皿，DYY —11型电泳仪，24D 型电泳槽，制胶板，揺床，移液枪。
1.2 小牛肠碱性磷酸酶提取方法
1）取新鲜小牛肠，用剪刀剖开，用载玻片刮取小肠内粘膜，放到盘子一角。
2）将小肠粘膜液集中倒入匀浆机中，加冰冷蒸馏水，高速匀浆，重复多次。 3）缓慢加入冰冷正丁醇高速匀浆重复多次。在4℃，10000 rpm条件下离心。 4）用滤布过滤去除杂质，倒入分液漏斗中，静止分层，取下层水相，用HAc 溶液调pH 到4.9。4℃，10000 rpm，离心。
5）得到上清后放入离心管中，用NaOH 溶液调pH 至6.5，称取硫酸铵加到离心管中溶解；再加冰冷丙酮，混匀，4℃静置30 min以上。4℃，10000 rpm，离心。
6）上清液中加入冰冷丙酮，4℃放置30 min以上。4℃，10000 rpm，离心。 7）取沉淀溶于平衡缓冲液至全部溶解至冰箱保存待用。 8）底物处理：底物37℃水浴5 min。
1.3 小牛肠碱性磷酸酶酶活检测方法
1）将酶稀释10倍。
2）紫外分光光度计检测条件为405 nm 波长，测定时间60 s ，取值2 s ，记录范围0.0-1.5。3）取2个2 mL比色皿，加入上述（2）加热的底物缓冲液，校对归零。
4）将稀释10倍的酶液加到其中1个比色皿中（仪器外侧），用手堵住皿口。快速
上下倒2次，放回分光光度计中，测定酶动力学曲线
1.4 聚丙烯凝胶制备
1）装板：将垂直板型电泳的玻璃片洗净、晾干；放好胶条，用夹子夹好玻璃板，上面插上梳子，垂直放置在水平台面上备用。
2）制备分离胶：在小烧杯中按下表配制所需浓度的分离胶。
分离胶制备（浓度10%，制备量10 mL）
试剂 用量 H 2O
30% 丙烯酰胺
1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液pH 8.8
10% 过硫酸铵
TEMED
3）制备浓缩胶：在小烧杯中按下表配制所需浓度的浓缩胶。
4.1 mL 3.4 mL 2.4 mL 100 μL 10 μL
浓缩胶制备（浓度5%，制备量6 mL） 试剂 H 2O
30% 丙烯酰胺
0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液pH 6.8
10% 过硫酸铵
TEMED
4）蛋白样品处理：在1.5 mL离心管中按1：1体积比例，加样品和上样缓冲液，100 C 加热使蛋白变性。
5）浓缩胶完全聚合后，去掉夹子和胶条，拔去梳子，将凝胶玻璃板固定于电泳装置内槽上，加入电泳缓冲液，缓冲液高过玻璃板凹面。
用量 3.4 mL 1.0 mL 1.5 mL 60 μL 8 μL
1.5 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
1）玻璃试管中加入考马斯亮蓝。
2）在1.5 mL离心管中，取酶液分别稀释50、100、200倍。
3）各取100 μL 加入到5 mL考马斯亮蓝试管中，混匀，反应5 min以上。 4）紫外分光光度计检测条件：595 nm 波长。
5）取2个比色皿，加入考马斯亮蓝，分光光度计中校对归零。 6）将样品放入外侧比色皿中，读吸光值。 7）根据蛋白浓度标准曲线，计算酶蛋白浓度。
1.6 SDS-聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质相对分子量
1）用移液枪依次在泳道加样。
2）电泳：连接正、负极，待溴酚兰指示剂迁移至下沿处，停止电泳。
3）剥胶染色：电泳结束后，取出凝胶玻璃板，用水冲洗，将剥离下来的凝胶用水漂洗，转入染色缸中，加染色液，置摇床染色。
4）脱色：染色完毕，回收染色液，用水漂洗，加入脱色液，置摇床脱色，脱色至背景清晰。
5）观察测定蛋白的迁移率及条带，对照标准样品，分析蛋白样品的分子量及纯度。 6）拍照电泳结果，用于完成实验报告。
2. 结果与讨论
2.1小牛肠碱性磷酸酶酶活检测
根据酶动力计算公式：
∆A/min ⨯ VR ⨯ D
比活力（U/mg）＝
E 405 ⨯ VE ⨯ C ⨯ L
根据上图，∆A/min=3.5/min； VR =1.50002ml； D=10；
E405=18.3L/(mol*cm)； VE =0.00002ml； C=19.35mg/ml. L=0.5cm；
所以比活力（U/mg）=1. 48*10U/mg；
4
2.2 SDS-聚丙烯凝胶电泳
分析知，mark 中出现了三条蛋白质标记线，根据其间距及参考文献中给出的mark 泳道各条蛋白质标记线间距，可判定由上到下mark 泳道中的三条蛋白质标记线分别是兔磷酸化酶B ，牛血清白蛋白，兔肌动蛋白。样品蛋白质标记线与牛血清白蛋白迁移率相近，所以样品的分子量与牛血清白蛋白分子量相近，所以样品的分子量大致为66,200/mol.
2.3考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
根据考马斯亮蓝常量法测蛋白质标准曲线，其方程为：y=0.697x-0.007； 蛋白质稀释50倍的情况下测得吸光值为0.2625，根据方程，稀释50倍时蛋白质浓度C=0.387mg/ml，则原蛋白质浓度C=19.35mg/ml。
2.4小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活测定一些问题的讨论
1、测定底物浓度对酶反应速度的影响时，对酶反应的哪些条件要加以控制？本实验所取的条件是什么?
答：要对反应温度，酶浓度进行控制，本实验中反应温度为37℃，酶浓度为在原来
酶浓度的基础上稀释10倍。
2、为什么实验中能以平均速度表示反应的瞬时速度?
答：因为酶催化的反应速率与底物浓度有关，本实验中底物远远过量，所以可以
以平均速度表示反应的瞬时速度。
3、你认为实验中的关键步骤或值得注意的步骤是什么？
答：最关键的地方在于提取酶的时候要在低温环境下，免得酶失活，另外，测定酶活力的时候底物预热后要立即进行反应，防止底物提前分解影响实验结果。
4、本次实验的感受是什么？
答：本实验要细心，每个步骤都要认真搞懂原理的情况下再操作，免得破坏酶的活性影响实验结果。
2.5 SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量一些问题的讨论
1、用SDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量时为什么要用巯基乙醇？
答：保持蛋白质的二级结构。蛋白中如果有二硫键存在的话，会容易被氧化断开，有了巯基乙醇（还原性的物质）就可以免除这一隐患
2、SDS 在该电泳方法中的作用是什么？
答：在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，加入一定量的十二烷基硫酸钠
（SDS ），形成蛋白质-SDS 复合物，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。根据标准样品在该系统电泳中所作出的标准曲线，推算出被测蛋白样品分子量的近似值。
3、分析自己实验的成败原因。
答：本实验中我们组的mark 样品只有三条标记线，是分子量最多的三条，说明分子量小的蛋白质电泳进行得快，超出了凝胶的范围，所以没有在图像上有所体现。原因是电泳时间过长或电压过大造成的，因此应该适当减少电泳的时间或减少，免得分子量小的蛋白质“跑过头”。
参考文献：
[1]修志龙等. 生物化学[M].化学工业出版社.2008.
[2]许文涛等.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳快速染脱色方法的比较研究. 食品科学[J]. 2004,Vol.25.No.增
{3}孙士青等. 考马斯亮蓝法快速测定乳品中蛋白质含量. 山东科学[J].2011.24(6)
[4]栾雨时, 包永明.. 生物工程实验技术手册[M].化学工业出版社.2005