・245・
・遗传代谢内分泌疾病研究・
尿滤纸片法气相色谱2质谱分析技术在
遗传性代谢病高危筛查诊断中的应用
罗小平 王慕逖 魏虹 梁雁 王宏伟 林汉华 董永绥 刘皖君 方俊敏 宁琴 【摘要】 目的 建立一种适合我国国情的有机酸尿症及其他遗传性代谢病的高危筛查诊断方法。方法 应用滤纸片收集尿标本,建立尿有机酸及氨基酸代谢产物的萃取、衍化和气相色谱2质谱分析方法;成立遗传代谢性疾病高危筛查诊断协作网络并开展工作。结果 352例样本中共检出阳性病例34例(9166%),病种包括甲基丙二酸血症6例,α2酮戊二酸尿症5例,酪氨酸血症Ⅰ型4例,二羧酸尿症4例,多种羧化酶缺乏症3例,苯丙酮尿症3例,高乳酸血症3例,丙酸血症2例,鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症1例,乙基丙二酸2己二酸尿症1例,戊二酸尿症Ⅱ型1例和32甲基巴豆酰羧化酶缺乏症1例。常见的临床症状和体征包括智能发育落后、惊厥、肌张力异常和黄疸。常规实验室检查多见代谢性酸中毒、低血糖和高血氨等异常。结论 尿有机酸气相色谱2质谱分析为遗传性代谢病高危筛查诊断的重要技术。应用滤纸片收集尿标本后在遗传代谢病诊断中心进行检测为实用而有效的方法。建立协作网络是成功开展遗传性代谢病高危筛查诊断工作的关键。
【关键词】 代谢缺陷,先天性; 有机酸类; 碎片质谱法; 尿分析
Applicationofgaschromatography2massspectrometryanalysisonurinefilterpaperinthehigh2riskscreeninganddiagnosisofinheritedmetabolicdiseases LUOXiao2ping,WANGMu2ti,WEIHong,LIANGYan,WANGHong2wei,LINHan2hua,DONGYong2sui,LIUWan2jun,FANGJun2min,NINGQin1DepartmentofPediatrics,TongjiHospital,CenterfortheDiagnosisofGeneticMetabolicDiseases,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China
【Abstract】 Objective Toestablishaspecificprocedureforthehigh2riskscreeninganddiagnosisoforganicaciduriasandotherinheritedmetabolicdiseasesinChina1Methods Anation2widenetworkforthehigh2riskscreeninganddiagnosisofgeneticmetabolicdiseaseswasformedtofacilitatethecollaboration1Urinesampleswerecollectedusingfilterpaperfrompatientswithclinicalsymptomssuspiciousofinheritedmetabolicdiseases1Thesampleswereelutedwithdistilledwaterandinternalstandardswereadded1Samplesweretreatedwithhydroxylaminehydrochloridetoformoximestoimprovetherecoveriesof22ketoacids1Urinaryorganicacidswereextractedwithethylacetateanddiethyletherunderacidiccondition1Afterdehydration,thecombinedorganicphasewasevaporatedtodrynesswithnitrogen1TheresidueswereaddedwithBSTFA+1%TMCSandheatincubatedtoformthetrimethylsilylderivatives,andthenwereanalyzedonanAgilent5890/5973Ngaschromatography2massspectrometer(GC2MS),witha7683seriesauto2sampler1Thepeakswereidentifiedbyreferencetoamassspectrallibrary1Results Totally352sampleswerecollectedfromthenetworkcollaboratinghospitalssince20011Thirty2four(9166%)casesofvariousinheritedmetabolicdiseaseswerediagnosedwithanagerangeof2daysto14years1Thediseaseprofilewasconsistedofmethylmalonicacidemias(6),α2keto2glutaricaciduria(5),tyrosinemiatypeⅠ(4),dicarboxylicaciduria(4),multiplecarboxylasedeficiency(3),phenylketonuria(3),lacticacidemia(3),propionicacidemia(2),ornithinetranscarbamoylasedeficiency(1),ethylmalonic2adipicaciduria(1),glutaricaciduriatypeⅡ(1)and32methylcrotylCoAcarboxylasedeficiency(1)1Themostcommonclinicalsymptomsandsignsincludedmentalanddevelopmentalretardation,convulsion,musculotonicabnormalityandjaundice1Routinelaboratorytestsoftenrevealedmetabolicacidosis,hypoglycemiaandhyperammonemia,etc1Conclusion UrineorganicacidsanalysisbyGC2MSremainstobethemostimportanttechniqueforthehigh2riskscreeninganddiagnosisofinheritedmetabolicdiseases1UseofurinefilterpaperforsamplecollectionandanalysisinadvancedgeneticmetaboliccentersisapracticalapproachtoextendthediagnosticcapacityandimprovethemanagementofsuchdiseasesinChina1Collaborativenetworkplayedacriticalroleinthe
基金项目:国家自然科学基金委员会国家杰出青年科学基金(30125019);卫生部临床学科重点建设项目(97070240)作者单位:430030武汉,华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科,同济医学院遗传代谢性疾病诊断中心
・246・successoftheprogram1
【Keywords】 Metabolism,intornerrors; Organicacids; Massfragmentograpny; Urinalysis 遗传性代谢病是一类重要的遗传性疾病,虽单
一病种的发病率低,但其作为一类疾病的总体发病
率甚高,目前已经认识的遗传性代谢病已超过500
种[1]。近年来生物化学、分子遗传学和计算机科学
的迅速发展,为遗传性代谢病的诊治和研究提供了
良好契机。随着人类疾病谱的改变,遗传因素在人
类疾病发病中的相对作用日趋重要,遗传性代谢病
的诊断和治疗在我国亦逐步引起重视[224]。
自1966年Tanaka等[5]应用气相色谱2质谱联用
技术(gaschromatography2massspectrometry,GC2MS)诊
断首例异戊酸血症以后,检测技术和方法不断改进,
迄今仍为遗传性代谢病最重要的诊断手段。既往我
国对此类疾病仅能作出初步诊断[6],或依靠将标本
送至国外合作单位确诊[7210]。我们于2000年在国
内率先独立建立了尿有机酸、氨基酸及其他代谢产
物的GC2MS分析方法,并成立了全国性遗传代谢性
疾病高危筛查诊断协作网络,采用滤纸收集尿液标
本,系统开展了遗传性代谢病的高危筛查诊断工作。
自2001年4月开始检测标本,至2002年10月已分
析样本352例。报告如下。
资料和方法
一、材料及标本来源
1.材料:所有有机酸标准品及饱和烃(C24)均购d～14岁,其中男221例,女131例。由送检单位提供临床病史,常规实验室检查(血/尿常规、肝肾功能、血电解质、血糖、血氨、血气分析、血乳酸、丙酮酸、酮体、尿筛查实验等)和特殊检查(CT,MRI等)结果以便于分析诊断。二、方法11建立有机酸、氨基酸及其他代谢产物质谱图谱库:200余种有机酸、氨基酸标准品甲基硅烷化衍生后进行GC2MS分析,获得各种有机酸、氨基酸及代谢产物的质谱图,编制成本中心专用质谱图谱库;并参照应用部分国外商用质谱图谱库,录入了常见药物代谢产物质谱图。21尿标本收集:采用国产新华3号滤纸(5cm×8cm)收集晨尿或任意尿,稍晾干后置专用滤纸干燥袋内送至本中心。对本院病例则直接收集其原尿标本。3.滤纸尿标本处理:干燥滤纸尿样用2ml去离子双蒸水分次离心洗脱,测定肌酐含量。取相当215μmol肌酐的原尿或滤纸洗脱尿样,加入50μg内标十五烷酸和22酮己酸,与100μ200μl盐酸羟胺、l0125mol/L硫酸、500μl饱和氯化胺混合45min以完成α2酮酸的肟化反应,然后分别用3ml乙酸乙酯和乙醚两次萃取,合并有机溶剂相,并用无水硫酸钠去除残余水分,加入外标C24,用纯净氮气吹干后,
加入100μl甲基硅烷化衍生剂,置干燥加热器(美国
Pierce公司)上60℃衍化60min,冷却后用正己烷稀
释至500μl。取1μl上样进行GC2MS分析。
4.GC2MS分析:应用安捷伦5890/5973N型GC2
MS进行样本分析,配备7673型自动进样器,HP25毛自美国Sigma公司,选取十五烷酸和22酮己酸为内标,C24为外标。乙酸乙酯、乙醚和正己烷购自美国Fisher公司,甲基硅烷化衍生剂(BSTFA+1%TMCS)由美国Supelco公司提供。常规生化试剂为上海化
学试剂总厂分析纯产品,高纯氦气和氮气
(991999%)为武汉钢铁公司产品。
2.标本来源:(1)同济医院儿科门诊、病房。(2)
遗传代谢性疾病高危筛查诊断协作网络单位。为深
入开展遗传性代谢病的筛查诊断工作,充分发挥各
地区医疗单位的技术和资源优势,加强合作,提高对
此类疾病的诊断治疗整体水平,在中华医学会儿科
学分会内分泌遗传代谢性疾病学组各单位的支持
下,来自国内20余家医疗单位的代表于2001年4
月在武汉同济医院成立了遗传代谢性疾病高危筛查
诊断协作网络并为本研究提供部分标本。所有标本
均来自临床怀疑遗传性代谢病的病例。患儿年龄2细管色谱柱,柱长30m,直径0132mm,膜厚0125μm,无分流式进样,进样口温度250℃。氦气为载气(1ml/min),界面温度250℃。质谱检测采用电子离解模式总离子扫描方式(EI70eV),质荷比(m/z)范围50～600,扫描周期014s。色谱柱箱程序升温从60℃开始,20℃/min升温至90℃后停留4min,然后以8℃/min升温至300℃,样本分析时间为30min。计算机系统记录色谱和质谱图形,应用质谱图谱库参比鉴定和各色谱峰的丰度进行定性和定量分析,结合临床资料分析判断。
・247・
结果讨论
一、原尿和滤纸尿标本有机酸分析结果比较
根据我国幅员辽阔,地区发展极不平衡的特点,
我们建立了滤纸尿标本收集、有机萃取和尿有机酸
GC2MS分析方法。曾在混合原尿中加入一定量各种遗传性代谢病(inbornerrorsofmetabolism,IEM,或称inheritedmetabolicdiseases)的概念由Garrod在1908年首次提出,现已知遗传性代谢病是由于单基因缺陷引起的代谢途径阻断,为一类以功能障碍为
主要表现的遗传性缺陷。约80%属常染色体隐性
遗传,余为X连锁遗传、常染色体显性遗传或线粒
体遗传。IEM的病理生理改变包括:受累代谢途径
的终末产物缺乏;中间和(或)旁路代谢产物大量蓄
积;或由于代谢途径受阻而导致对肝、脑、肌肉等组
织能量供应不足等。这些病理生理变化都直接或间
接影响多个器官系统,特别是脑的发育和功能,导致
严重伤残,甚或危及生命[11,12]。由于遗传代谢性疾
病种类繁多,而临床上常表现为极其类似的非特异
性症状,因此临床诊断十分困难。本组病例临床表
现亦显示多器官功能损伤的特点,与近期报道结果
类似[9,10]。智能发育异常、惊厥、肌张力异常、黄疸、
肝脾肿大和阳性家族史等易引起临床医师的重视。
常规实验室检查异常如严重代谢性酸中毒、低血糖、
尿筛查阳性、高血氨和颅脑CT/MRI改变等,提示应
进行遗传性代谢病高危筛查诊断。
应用生化方法测定异常代谢产物仍是目前诊断
遗传性代谢病的最主要方法,而GC2MS技术是目前
对遗传性代谢病进行高危筛查、确定诊断最为有效
和广泛应用的方法[13]。近年日本学者应用滤纸收
集尿标本,经尿素酶处理后不经有机萃取直接进行
GC2MS分析,可以同时鉴定有机酸和部分氨基酸及
糖醇代谢产物,试图推行用GC2MS方法进行遗传代
谢性疾病新生儿群体筛查[14,15]。但未经有机溶剂
萃取的气相色谱图的杂峰甚多,不利结果分析,且甚
易污染气相色谱柱和质谱离子源,其相对简单的尿
氨基酸分析结果亦不足以诊断复杂氨基酸病。为
此,我们在北美和欧洲通行的尿有机酸GC2MS分析
方法基础上,建立了滤纸片尿有机酸定性和定量分
析方法。针对尿筛查试验特异性和敏感性均较差的
问题,我们对所有标本均常规进行盐酸羟胺肟化处
理,利于α2酮酸的检测。这样,尿有机酸分析结合血
/尿氨基酸定量分析、酰基肉碱和长链脂肪酸分析等
即可诊断大多数不同临床表型的遗传性有机酸和氨
基酸代谢异常。
临床医生对遗传性代谢病有充分的认识和警
惕,是遗传性代谢病得以及时正确诊断和处理的关有机酸,浸透滤纸后晾干,置室温下分别保存1、3、5、7d后进行有机酸分析,与新鲜或冷冻原尿比较,尿有机酸谱和含量在两者间的差异均无显著意义(资料未显示)。我们采用乙酸乙酯和乙醚两次有机萃取,按肌酐含量定量分析。萃取前常规进行肟化处理程序,利于α2酮酸的检出,不致漏诊支链酮酸代谢障碍。二、高危筛查诊断结果及临床资料1.筛查诊断结果:352份尿样标本通过检测,诊断遗传性代谢病34例(9166%)。病种分布包括甲基丙二酸血症6例α,2酮戊二酸尿症5例,酪氨酸血症Ⅰ型4例,二羧酸尿症4例,多种羧化酶缺乏症3例,苯丙酮尿症3例,高乳酸血症3例,丙酸血症2例,鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症、乙基丙二酸2己二酸尿症、戊二酸尿症Ⅱ型及32甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症各1例。另外检出继发性酪氨酰尿症5例,高乳酸血症3例,32羟基异丁酸尿症和酮尿症各2例。图1为1例正常尿有机酸色谱图;图2A和2B分别为1例典型甲基丙二酸血症尿有机酸色谱图和甲基丙二酸的三甲基硅烷化衍生物质谱图;图3为1例典型多种羧化酶缺乏症尿有机酸色谱图。2.临床资料:遗传性代谢病临床表现复杂多变。本组高危筛查诊断的34例就诊年龄为2d～14岁。常见临床症状和体征依次为智能发育异常(智能落后/倒退、精神运动发育迟缓)21例(62%)、惊厥16例(47%)、肌张力异常(低下或增高)14例(41%)、黄疸8例、肝脾肿大7例、阳性家族史(双胎发病,同胞诊断为相同疾病或死于类似症状疾病、父母近亲婚配)6例、消化道症状(喂养困难、呕吐、腹泻)6例、湿疹4例、毛发异常3例、特殊气味2例和特殊面容2例。常规实验室和特殊辅助检查异常包括代谢性酸中毒16例(47%)、低血糖10例(29%)、高血氨8例、尿筛查阳性6例、肝酶活性增高6例、颅脑CT/MRI异常改变5例、血乳酸增高5例、酮症4例、脑电图改变3例、贫血3例、白细胞/血小板减少2例。
・248・附一院(杜敏联);中国医科大学第二临床学院(麻宏伟);中南大学湘雅二医院(易著文);中南大学湘雅医院(杨于嘉);天津市儿童医院(包美珍);北京大学第一医院(杨艳玲);北京协和医院(赵时敏);四键。对疑有此类疾病的患者儿,应迅速进行相应常规检查,争取在疾病极期或代谢危象期及时留存标本,转送至有条件的实验室确定诊断。对猝死、不明
原因死亡或部分高度怀疑遗传性代谢病的死亡病例,应争取在死亡前甚或尸检时留取体液或组织标本送检,常可为确定最后诊断提供重要依据,避免或减少医疗纠纷的发生。此类“代谢性尸检”已在北美多个中心常规进行[16]。有机酸和氨基酸等检查结果易受疾病发展和治疗情况等因素影响,检测结果必须结合临床和常规实验室资料综合分析判断,此点对于判断继发性有机酸尿症尤为重要。对临床高度怀疑遗传代谢性缺陷的病例,如一次检查为阴性结果或可疑,应考虑在疾病极期或代谢危象期重复检查,必要时应进行血/尿氨基酸、尿乳清酸、血长链脂肪酸和酰基肉碱定量分析。本组资料检测阳性率几近10%,与近期国内报道结果相似[9,10],表明所选送高危病例针对性较强,但亦提示临床医师应更加提高警惕,及时发现临床和常规实验室检查的异常,以免漏诊或误诊。
充分利用现有资源,加强团结协作,不断完善检测技术是成功开展遗传性代谢病高危筛查诊断的保障。遗传代谢性疾病高危筛查诊断协作网络成立1年余来,工作运行良好,并有多家单位随后陆续加入。在资源共享、优势互补、成果共用、共同提高的原则下,网络成员团结协作,加强沟通,充分利用现代通讯设施的便利条件,实施了远程诊断。采用滤纸片收集尿标本更有利于异地标本分析,方便了高危筛查工作和远程诊断的开展,适合目前我国国情。检测结果一般在收到标本后1～3d以电话、传真、电子邮件或邮政快递方式报告,并针对具体病例情况,建议选择其他相关检查,讨论和指导治疗方案,取得良好效果。正确诊断并及时处理先证病例,不仅可以挽救患者生命,减少严重伤残发生,更是开展遗传咨询和系谱分析,进行产前诊断、携带者检出、基因分析和遗传病分子机制研究的基础,对于提高人口素质、降低出生缺陷、实行优生优育等具有重要意义。
(本文图1～3见插页421)
本遗传代谢性疾病高危筛查诊断协作网络单位及联系人(按单位名称笔画顺序):广州市儿童医院(刘丽);广州市妇婴医院(黄永兰);广州市第一人民医院(曾春华);广州医学院(陈跃勇);上海第二医科大学儿科研究所(顾学范);山东省妇幼保健院(王伟);中山大学川大学华西医学中心(毛萌);华中科技大学同济医学院附属同济医院(王慕逖、林汉华、罗小平);华中科技大学同济医学院附属协和医院(金润铭、周东风);成都市儿童医院(王晓蕾);江西省儿童医院(毛定安);佛山市妇幼保健院(高平明);武汉大学人民医院(黄星源);武汉大学中南医院(张渝侯);武汉市儿童医院(蔡宝珍、刘智胜);武汉市妇幼保健院(肖芳);青岛大学医学院附属医院(李堂);郑州大学第三附属医院(李洪玲);复旦大学儿科医院(沈水仙);首都医科大学附属北京儿童医院(颜纯、朱逞);重庆医科大学儿童医院(熊丰);深圳市儿童医院(刘晓红);深圳市妇儿医院(董国庆);深圳市宝安区妇幼保健院(卢光进);湖北省妇女儿童医院(张庆松)参考文献1ScriverCR,BeaudetAL,SlyWS,etal(eds).Themetabolicandmolecularbasesofinheriteddiseases.8thed.NewYork:McGraw2Hill,2001.12100.2王慕逖,罗小平.深入开展遗传性代谢缺陷病的筛查诊断工作.中华儿科杂志,2001,39:1292130.3秦炯.积极开展遗传性代谢疾病诊断与治疗的研究.中华儿科杂志,2001,39:5132514.4罗小平,王慕逖.加强遗传代谢性疾病的诊断治疗与发病机制研究.华中医学杂志,2002,26:61262.5TanakaK,BuddMA,EfronML,etal.Isovalericaiademia:anewgeneticdefectofleucinemetabolism.ProcNatlAcadSciUSA,1966,56:2362242.6宁聪,方红,熊密.二羧酸尿症一例.中华儿科杂志,1990,28:303.7杨艳玲,张月华,山口清次,等.六例丙酸血症的诊断和治疗分析.中华儿科杂志,2001,39:1702171.8麻宏伟,董贵章,王志超,等.复合羧化酶缺乏症一例.中华儿科杂志,2001,39:179.9许克铭,王立文,蔡虹,等.气相色谱2质谱法对高危婴幼儿遗传性代谢疾病筛查的研究.中华儿科杂志,2001,39:5152517.10杨艳玲,山口清次,田上泰子,等.有机酸尿症71例临床分析.北京大学学报(医学版),2002,34:2142218.11BurtonBK.Inbornerrorsofmetabolismininfancy:aguidetodiagnosis.Peidatrics,1998,102:129.12方俊敏,王慕逖.遗传性代谢缺陷病的诊断.中华儿科杂志,2001,39:1762179.13LehotayDC,ClarkeJT.Organicaciduriasandrelatedabnormalities.CritRevClinLabSci,1995,32:3772429.14KuharaT,ShinkaT,InoueY,etal.Pilotstudyofgaschromatographic2massspectrometricscreeningofnewbornurineforinbornerrorsofmetabolismaftertreatmentwithurease.JChromat.B,1999,731:1412147.15FuXW,IgaM,KimuraM.SimplifiedscreeningfororganicacidemiasusingGC/MSanddriedurinefilterpaper:astudyonneonatalmassscreening.EarlyHumanDevelopment,2000,58:41255.16ChaceDH,DiPernaJC,MitchellBL,etal.Electrospraytandemmassspectrometryforanalysisofacylcarnitinesindriedpostmortembloodspecimenscollectedatautopsyfrominfantswithunexplainedcauseofdeath.ClinChem,2001,47:116621182.(收稿日期:2002211207)(本文编辑:江澜)
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尿滤纸片法气相色谱2质谱分析技术在
遗传性代谢病高危筛查诊断中的应用
罗小平 王慕逖 魏虹 梁雁 王宏伟 林汉华 董永绥 刘皖君 方俊敏 宁琴 【摘要】 目的 建立一种适合我国国情的有机酸尿症及其他遗传性代谢病的高危筛查诊断方法。方法 应用滤纸片收集尿标本,建立尿有机酸及氨基酸代谢产物的萃取、衍化和气相色谱2质谱分析方法;成立遗传代谢性疾病高危筛查诊断协作网络并开展工作。结果 352例样本中共检出阳性病例34例(9166%),病种包括甲基丙二酸血症6例,α2酮戊二酸尿症5例,酪氨酸血症Ⅰ型4例,二羧酸尿症4例,多种羧化酶缺乏症3例,苯丙酮尿症3例,高乳酸血症3例,丙酸血症2例,鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症1例,乙基丙二酸2己二酸尿症1例,戊二酸尿症Ⅱ型1例和32甲基巴豆酰羧化酶缺乏症1例。常见的临床症状和体征包括智能发育落后、惊厥、肌张力异常和黄疸。常规实验室检查多见代谢性酸中毒、低血糖和高血氨等异常。结论 尿有机酸气相色谱2质谱分析为遗传性代谢病高危筛查诊断的重要技术。应用滤纸片收集尿标本后在遗传代谢病诊断中心进行检测为实用而有效的方法。建立协作网络是成功开展遗传性代谢病高危筛查诊断工作的关键。
【关键词】 代谢缺陷,先天性; 有机酸类; 碎片质谱法; 尿分析
Applicationofgaschromatography2massspectrometryanalysisonurinefilterpaperinthehigh2riskscreeninganddiagnosisofinheritedmetabolicdiseases LUOXiao2ping,WANGMu2ti,WEIHong,LIANGYan,WANGHong2wei,LINHan2hua,DONGYong2sui,LIUWan2jun,FANGJun2min,NINGQin1DepartmentofPediatrics,TongjiHospital,CenterfortheDiagnosisofGeneticMetabolicDiseases,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China
【Abstract】 Objective Toestablishaspecificprocedureforthehigh2riskscreeninganddiagnosisoforganicaciduriasandotherinheritedmetabolicdiseasesinChina1Methods Anation2widenetworkforthehigh2riskscreeninganddiagnosisofgeneticmetabolicdiseaseswasformedtofacilitatethecollaboration1Urinesampleswerecollectedusingfilterpaperfrompatientswithclinicalsymptomssuspiciousofinheritedmetabolicdiseases1Thesampleswereelutedwithdistilledwaterandinternalstandardswereadded1Samplesweretreatedwithhydroxylaminehydrochloridetoformoximestoimprovetherecoveriesof22ketoacids1Urinaryorganicacidswereextractedwithethylacetateanddiethyletherunderacidiccondition1Afterdehydration,thecombinedorganicphasewasevaporatedtodrynesswithnitrogen1TheresidueswereaddedwithBSTFA+1%TMCSandheatincubatedtoformthetrimethylsilylderivatives,andthenwereanalyzedonanAgilent5890/5973Ngaschromatography2massspectrometer(GC2MS),witha7683seriesauto2sampler1Thepeakswereidentifiedbyreferencetoamassspectrallibrary1Results Totally352sampleswerecollectedfromthenetworkcollaboratinghospitalssince20011Thirty2four(9166%)casesofvariousinheritedmetabolicdiseaseswerediagnosedwithanagerangeof2daysto14years1Thediseaseprofilewasconsistedofmethylmalonicacidemias(6),α2keto2glutaricaciduria(5),tyrosinemiatypeⅠ(4),dicarboxylicaciduria(4),multiplecarboxylasedeficiency(3),phenylketonuria(3),lacticacidemia(3),propionicacidemia(2),ornithinetranscarbamoylasedeficiency(1),ethylmalonic2adipicaciduria(1),glutaricaciduriatypeⅡ(1)and32methylcrotylCoAcarboxylasedeficiency(1)1Themostcommonclinicalsymptomsandsignsincludedmentalanddevelopmentalretardation,convulsion,musculotonicabnormalityandjaundice1Routinelaboratorytestsoftenrevealedmetabolicacidosis,hypoglycemiaandhyperammonemia,etc1Conclusion UrineorganicacidsanalysisbyGC2MSremainstobethemostimportanttechniqueforthehigh2riskscreeninganddiagnosisofinheritedmetabolicdiseases1UseofurinefilterpaperforsamplecollectionandanalysisinadvancedgeneticmetaboliccentersisapracticalapproachtoextendthediagnosticcapacityandimprovethemanagementofsuchdiseasesinChina1Collaborativenetworkplayedacriticalroleinthe
基金项目:国家自然科学基金委员会国家杰出青年科学基金(30125019);卫生部临床学科重点建设项目(97070240)作者单位:430030武汉,华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科,同济医学院遗传代谢性疾病诊断中心
・246・successoftheprogram1
【Keywords】 Metabolism,intornerrors; Organicacids; Massfragmentograpny; Urinalysis 遗传性代谢病是一类重要的遗传性疾病,虽单
一病种的发病率低,但其作为一类疾病的总体发病
率甚高,目前已经认识的遗传性代谢病已超过500
种[1]。近年来生物化学、分子遗传学和计算机科学
的迅速发展,为遗传性代谢病的诊治和研究提供了
良好契机。随着人类疾病谱的改变,遗传因素在人
类疾病发病中的相对作用日趋重要,遗传性代谢病
的诊断和治疗在我国亦逐步引起重视[224]。
自1966年Tanaka等[5]应用气相色谱2质谱联用
技术(gaschromatography2massspectrometry,GC2MS)诊
断首例异戊酸血症以后,检测技术和方法不断改进,
迄今仍为遗传性代谢病最重要的诊断手段。既往我
国对此类疾病仅能作出初步诊断[6],或依靠将标本
送至国外合作单位确诊[7210]。我们于2000年在国
内率先独立建立了尿有机酸、氨基酸及其他代谢产
物的GC2MS分析方法,并成立了全国性遗传代谢性
疾病高危筛查诊断协作网络,采用滤纸收集尿液标
本,系统开展了遗传性代谢病的高危筛查诊断工作。
自2001年4月开始检测标本,至2002年10月已分
析样本352例。报告如下。
资料和方法
一、材料及标本来源
1.材料:所有有机酸标准品及饱和烃(C24)均购d～14岁,其中男221例,女131例。由送检单位提供临床病史,常规实验室检查(血/尿常规、肝肾功能、血电解质、血糖、血氨、血气分析、血乳酸、丙酮酸、酮体、尿筛查实验等)和特殊检查(CT,MRI等)结果以便于分析诊断。二、方法11建立有机酸、氨基酸及其他代谢产物质谱图谱库:200余种有机酸、氨基酸标准品甲基硅烷化衍生后进行GC2MS分析,获得各种有机酸、氨基酸及代谢产物的质谱图,编制成本中心专用质谱图谱库;并参照应用部分国外商用质谱图谱库,录入了常见药物代谢产物质谱图。21尿标本收集:采用国产新华3号滤纸(5cm×8cm)收集晨尿或任意尿,稍晾干后置专用滤纸干燥袋内送至本中心。对本院病例则直接收集其原尿标本。3.滤纸尿标本处理:干燥滤纸尿样用2ml去离子双蒸水分次离心洗脱,测定肌酐含量。取相当215μmol肌酐的原尿或滤纸洗脱尿样,加入50μg内标十五烷酸和22酮己酸,与100μ200μl盐酸羟胺、l0125mol/L硫酸、500μl饱和氯化胺混合45min以完成α2酮酸的肟化反应,然后分别用3ml乙酸乙酯和乙醚两次萃取,合并有机溶剂相,并用无水硫酸钠去除残余水分,加入外标C24,用纯净氮气吹干后,
加入100μl甲基硅烷化衍生剂,置干燥加热器(美国
Pierce公司)上60℃衍化60min,冷却后用正己烷稀
释至500μl。取1μl上样进行GC2MS分析。
4.GC2MS分析:应用安捷伦5890/5973N型GC2
MS进行样本分析,配备7673型自动进样器,HP25毛自美国Sigma公司,选取十五烷酸和22酮己酸为内标,C24为外标。乙酸乙酯、乙醚和正己烷购自美国Fisher公司,甲基硅烷化衍生剂(BSTFA+1%TMCS)由美国Supelco公司提供。常规生化试剂为上海化
学试剂总厂分析纯产品,高纯氦气和氮气
(991999%)为武汉钢铁公司产品。
2.标本来源:(1)同济医院儿科门诊、病房。(2)
遗传代谢性疾病高危筛查诊断协作网络单位。为深
入开展遗传性代谢病的筛查诊断工作,充分发挥各
地区医疗单位的技术和资源优势,加强合作,提高对
此类疾病的诊断治疗整体水平,在中华医学会儿科
学分会内分泌遗传代谢性疾病学组各单位的支持
下,来自国内20余家医疗单位的代表于2001年4
月在武汉同济医院成立了遗传代谢性疾病高危筛查
诊断协作网络并为本研究提供部分标本。所有标本
均来自临床怀疑遗传性代谢病的病例。患儿年龄2细管色谱柱,柱长30m,直径0132mm,膜厚0125μm,无分流式进样,进样口温度250℃。氦气为载气(1ml/min),界面温度250℃。质谱检测采用电子离解模式总离子扫描方式(EI70eV),质荷比(m/z)范围50～600,扫描周期014s。色谱柱箱程序升温从60℃开始,20℃/min升温至90℃后停留4min,然后以8℃/min升温至300℃,样本分析时间为30min。计算机系统记录色谱和质谱图形,应用质谱图谱库参比鉴定和各色谱峰的丰度进行定性和定量分析,结合临床资料分析判断。
・247・
结果讨论
一、原尿和滤纸尿标本有机酸分析结果比较
根据我国幅员辽阔,地区发展极不平衡的特点,
我们建立了滤纸尿标本收集、有机萃取和尿有机酸
GC2MS分析方法。曾在混合原尿中加入一定量各种遗传性代谢病(inbornerrorsofmetabolism,IEM,或称inheritedmetabolicdiseases)的概念由Garrod在1908年首次提出,现已知遗传性代谢病是由于单基因缺陷引起的代谢途径阻断,为一类以功能障碍为
主要表现的遗传性缺陷。约80%属常染色体隐性
遗传,余为X连锁遗传、常染色体显性遗传或线粒
体遗传。IEM的病理生理改变包括:受累代谢途径
的终末产物缺乏;中间和(或)旁路代谢产物大量蓄
积;或由于代谢途径受阻而导致对肝、脑、肌肉等组
织能量供应不足等。这些病理生理变化都直接或间
接影响多个器官系统,特别是脑的发育和功能,导致
严重伤残,甚或危及生命[11,12]。由于遗传代谢性疾
病种类繁多,而临床上常表现为极其类似的非特异
性症状,因此临床诊断十分困难。本组病例临床表
现亦显示多器官功能损伤的特点,与近期报道结果
类似[9,10]。智能发育异常、惊厥、肌张力异常、黄疸、
肝脾肿大和阳性家族史等易引起临床医师的重视。
常规实验室检查异常如严重代谢性酸中毒、低血糖、
尿筛查阳性、高血氨和颅脑CT/MRI改变等,提示应
进行遗传性代谢病高危筛查诊断。
应用生化方法测定异常代谢产物仍是目前诊断
遗传性代谢病的最主要方法,而GC2MS技术是目前
对遗传性代谢病进行高危筛查、确定诊断最为有效
和广泛应用的方法[13]。近年日本学者应用滤纸收
集尿标本,经尿素酶处理后不经有机萃取直接进行
GC2MS分析,可以同时鉴定有机酸和部分氨基酸及
糖醇代谢产物,试图推行用GC2MS方法进行遗传代
谢性疾病新生儿群体筛查[14,15]。但未经有机溶剂
萃取的气相色谱图的杂峰甚多,不利结果分析,且甚
易污染气相色谱柱和质谱离子源,其相对简单的尿
氨基酸分析结果亦不足以诊断复杂氨基酸病。为
此,我们在北美和欧洲通行的尿有机酸GC2MS分析
方法基础上,建立了滤纸片尿有机酸定性和定量分
析方法。针对尿筛查试验特异性和敏感性均较差的
问题,我们对所有标本均常规进行盐酸羟胺肟化处
理,利于α2酮酸的检测。这样,尿有机酸分析结合血
/尿氨基酸定量分析、酰基肉碱和长链脂肪酸分析等
即可诊断大多数不同临床表型的遗传性有机酸和氨
基酸代谢异常。
临床医生对遗传性代谢病有充分的认识和警
惕,是遗传性代谢病得以及时正确诊断和处理的关有机酸,浸透滤纸后晾干,置室温下分别保存1、3、5、7d后进行有机酸分析,与新鲜或冷冻原尿比较,尿有机酸谱和含量在两者间的差异均无显著意义(资料未显示)。我们采用乙酸乙酯和乙醚两次有机萃取,按肌酐含量定量分析。萃取前常规进行肟化处理程序,利于α2酮酸的检出,不致漏诊支链酮酸代谢障碍。二、高危筛查诊断结果及临床资料1.筛查诊断结果:352份尿样标本通过检测,诊断遗传性代谢病34例(9166%)。病种分布包括甲基丙二酸血症6例α,2酮戊二酸尿症5例,酪氨酸血症Ⅰ型4例,二羧酸尿症4例,多种羧化酶缺乏症3例,苯丙酮尿症3例,高乳酸血症3例,丙酸血症2例,鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症、乙基丙二酸2己二酸尿症、戊二酸尿症Ⅱ型及32甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症各1例。另外检出继发性酪氨酰尿症5例,高乳酸血症3例,32羟基异丁酸尿症和酮尿症各2例。图1为1例正常尿有机酸色谱图;图2A和2B分别为1例典型甲基丙二酸血症尿有机酸色谱图和甲基丙二酸的三甲基硅烷化衍生物质谱图;图3为1例典型多种羧化酶缺乏症尿有机酸色谱图。2.临床资料:遗传性代谢病临床表现复杂多变。本组高危筛查诊断的34例就诊年龄为2d～14岁。常见临床症状和体征依次为智能发育异常(智能落后/倒退、精神运动发育迟缓)21例(62%)、惊厥16例(47%)、肌张力异常(低下或增高)14例(41%)、黄疸8例、肝脾肿大7例、阳性家族史(双胎发病,同胞诊断为相同疾病或死于类似症状疾病、父母近亲婚配)6例、消化道症状(喂养困难、呕吐、腹泻)6例、湿疹4例、毛发异常3例、特殊气味2例和特殊面容2例。常规实验室和特殊辅助检查异常包括代谢性酸中毒16例(47%)、低血糖10例(29%)、高血氨8例、尿筛查阳性6例、肝酶活性增高6例、颅脑CT/MRI异常改变5例、血乳酸增高5例、酮症4例、脑电图改变3例、贫血3例、白细胞/血小板减少2例。
・248・附一院(杜敏联);中国医科大学第二临床学院(麻宏伟);中南大学湘雅二医院(易著文);中南大学湘雅医院(杨于嘉);天津市儿童医院(包美珍);北京大学第一医院(杨艳玲);北京协和医院(赵时敏);四键。对疑有此类疾病的患者儿,应迅速进行相应常规检查,争取在疾病极期或代谢危象期及时留存标本,转送至有条件的实验室确定诊断。对猝死、不明
原因死亡或部分高度怀疑遗传性代谢病的死亡病例,应争取在死亡前甚或尸检时留取体液或组织标本送检,常可为确定最后诊断提供重要依据,避免或减少医疗纠纷的发生。此类“代谢性尸检”已在北美多个中心常规进行[16]。有机酸和氨基酸等检查结果易受疾病发展和治疗情况等因素影响,检测结果必须结合临床和常规实验室资料综合分析判断,此点对于判断继发性有机酸尿症尤为重要。对临床高度怀疑遗传代谢性缺陷的病例,如一次检查为阴性结果或可疑,应考虑在疾病极期或代谢危象期重复检查,必要时应进行血/尿氨基酸、尿乳清酸、血长链脂肪酸和酰基肉碱定量分析。本组资料检测阳性率几近10%,与近期国内报道结果相似[9,10],表明所选送高危病例针对性较强,但亦提示临床医师应更加提高警惕,及时发现临床和常规实验室检查的异常,以免漏诊或误诊。
充分利用现有资源,加强团结协作,不断完善检测技术是成功开展遗传性代谢病高危筛查诊断的保障。遗传代谢性疾病高危筛查诊断协作网络成立1年余来,工作运行良好,并有多家单位随后陆续加入。在资源共享、优势互补、成果共用、共同提高的原则下,网络成员团结协作,加强沟通,充分利用现代通讯设施的便利条件,实施了远程诊断。采用滤纸片收集尿标本更有利于异地标本分析,方便了高危筛查工作和远程诊断的开展,适合目前我国国情。检测结果一般在收到标本后1～3d以电话、传真、电子邮件或邮政快递方式报告,并针对具体病例情况,建议选择其他相关检查,讨论和指导治疗方案,取得良好效果。正确诊断并及时处理先证病例,不仅可以挽救患者生命,减少严重伤残发生,更是开展遗传咨询和系谱分析,进行产前诊断、携带者检出、基因分析和遗传病分子机制研究的基础,对于提高人口素质、降低出生缺陷、实行优生优育等具有重要意义。
(本文图1～3见插页421)
本遗传代谢性疾病高危筛查诊断协作网络单位及联系人(按单位名称笔画顺序):广州市儿童医院(刘丽);广州市妇婴医院(黄永兰);广州市第一人民医院(曾春华);广州医学院(陈跃勇);上海第二医科大学儿科研究所(顾学范);山东省妇幼保健院(王伟);中山大学川大学华西医学中心(毛萌);华中科技大学同济医学院附属同济医院(王慕逖、林汉华、罗小平);华中科技大学同济医学院附属协和医院(金润铭、周东风);成都市儿童医院(王晓蕾);江西省儿童医院(毛定安);佛山市妇幼保健院(高平明);武汉大学人民医院(黄星源);武汉大学中南医院(张渝侯);武汉市儿童医院(蔡宝珍、刘智胜);武汉市妇幼保健院(肖芳);青岛大学医学院附属医院(李堂);郑州大学第三附属医院(李洪玲);复旦大学儿科医院(沈水仙);首都医科大学附属北京儿童医院(颜纯、朱逞);重庆医科大学儿童医院(熊丰);深圳市儿童医院(刘晓红);深圳市妇儿医院(董国庆);深圳市宝安区妇幼保健院(卢光进);湖北省妇女儿童医院(张庆松)参考文献1ScriverCR,BeaudetAL,SlyWS,etal(eds).Themetabolicandmolecularbasesofinheriteddiseases.8thed.NewYork:McGraw2Hill,2001.12100.2王慕逖,罗小平.深入开展遗传性代谢缺陷病的筛查诊断工作.中华儿科杂志,2001,39:1292130.3秦炯.积极开展遗传性代谢疾病诊断与治疗的研究.中华儿科杂志,2001,39:5132514.4罗小平,王慕逖.加强遗传代谢性疾病的诊断治疗与发病机制研究.华中医学杂志,2002,26:61262.5TanakaK,BuddMA,EfronML,etal.Isovalericaiademia:anewgeneticdefectofleucinemetabolism.ProcNatlAcadSciUSA,1966,56:2362242.6宁聪,方红,熊密.二羧酸尿症一例.中华儿科杂志,1990,28:303.7杨艳玲,张月华,山口清次,等.六例丙酸血症的诊断和治疗分析.中华儿科杂志,2001,39:1702171.8麻宏伟,董贵章,王志超,等.复合羧化酶缺乏症一例.中华儿科杂志,2001,39:179.9许克铭,王立文,蔡虹,等.气相色谱2质谱法对高危婴幼儿遗传性代谢疾病筛查的研究.中华儿科杂志,2001,39:5152517.10杨艳玲,山口清次,田上泰子,等.有机酸尿症71例临床分析.北京大学学报(医学版),2002,34:2142218.11BurtonBK.Inbornerrorsofmetabolismininfancy:aguidetodiagnosis.Peidatrics,1998,102:129.12方俊敏,王慕逖.遗传性代谢缺陷病的诊断.中华儿科杂志,2001,39:1762179.13LehotayDC,ClarkeJT.Organicaciduriasandrelatedabnormalities.CritRevClinLabSci,1995,32:3772429.14KuharaT,ShinkaT,InoueY,etal.Pilotstudyofgaschromatographic2massspectrometricscreeningofnewbornurineforinbornerrorsofmetabolismaftertreatmentwithurease.JChromat.B,1999,731:1412147.15FuXW,IgaM,KimuraM.SimplifiedscreeningfororganicacidemiasusingGC/MSanddriedurinefilterpaper:astudyonneonatalmassscreening.EarlyHumanDevelopment,2000,58:41255.16ChaceDH,DiPernaJC,MitchellBL,etal.Electrospraytandemmassspectrometryforanalysisofacylcarnitinesindriedpostmortembloodspecimenscollectedatautopsyfrominfantswithunexplainedcauseofdeath.ClinChem,2001,47:116621182.(收稿日期:2002211207)(本文编辑:江澜)