引言
可溶性糖包括葡萄糖、果糖、蔗糖等单糖和双糖，是植物品质的重要构成性状之一，尤其是以果实为目的产品的植物，可溶性糖与酸的含量及其配比是影响果实风味品质的重要因素。对于鲜食品种，一般来讲，高糖中酸，风味浓，品质优；低糖中酸，风味淡，品质差。因此，可溶性糖的定量研究对植物的品质育种、储藏、加工特性等具有重要意义。而且可溶性糖广泛存在于植物的根、茎块和种子中，是人体热量的最最主要来源，具有较高的营养价值。本文重点介绍蒽酮比色法、铜还原碘量法、费林试剂法、原子吸收法、气相色谱法、液相色谱-蒸发光散射法，及连续流动法这几种实验如何定量测定可溶性糖含量。
1 蒽酮比色法
1.1 原理
糖在硫酸作用下生成糠醛，糠醛再与蒽酮作用形成绿色络合物，颜色的深浅与糖含量有关。在625 nm波长下的OD值与糖含量成正比。由于蒽酮试剂与糖反应的呈色强度随时间变化，故必须在反应后立即在同一时间内比色。
1.2 仪器与材料
1.2.1实验仪器
分光光度计，电炉，铝锅，电子天平，20ml刻度试管，刻度吸管5ml 1支、1ml 2支，漏斗。
1.2.2实验试剂
（1）蒽酮乙酸乙酯试剂：取分析纯蒽酮1g，溶于50ml乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中，在黑暗中可保存数星期，如有结晶析出，可微热溶解。
（2）浓硫酸（比重1.84）。
1.2.3实验材料
植物叶片。
1.3 实验方法
1.3.1标准曲线的制作
取20ml刻度试管11支，从0～10分别编号，按表24-1加入溶液和水。
然后按顺序向试管内加入1ml 9%苯酚溶液，摇匀，再从管液正面快速加入5ml浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8ml，在恒温下放置30min，显色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。按表1加入标准的蔗糖溶液，然后按顺序向试管中加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂和5ml浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm波长下测其光密度，以光密度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。
1.3.2可溶性糖的提取
取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10～0.30g，共3份，或干材料。
分别放入3支刻度试管中，加入5～10ml蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25ml容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。
1.3.3显色测定
吸取样品提取液0.5ml于20ml刻度试管中（重复2次），加蒸馏水1.5ml，以下步骤与标准曲线测定相同，测定样品的光密度。
1.3.4结果计算
可溶性糖含量(mg/g) = （从回归方程求得糖量/吸取样品液的体积）×提取液量×稀释倍数÷样品干重×10-6
2 铜还原碘量法
2.1 原理
试剂中的Cu2+与还原糖作用，生成氧化亚铜(Cu2O)沉淀。加入H2SO4后，氧化亚铜溶解生成Cu+,试剂中的KIO3与KI在酸化的同是生成I2。
KIO3+5KI+3H2SO4→3K2SO4+3H2O+3I2，然后Cu+被I2氧化，2Cu++I2 →2Cu+ + 2I-
溶液中剩余的碘以淀粉为指示剂，用Na2S2O3标准溶液滴定：Na2S2O3+ I2 → Na2S2O6 + 2NaI
同时以水代替样试液做空白滴定，将空白与样品的滴定差值带入由滴定标准系列糖液计算的回归方程中，即可求得所求试样中还原糖的含量。
2.2 仪器与试剂
2.2.1实验试剂
除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和GB∕T 6682 规定的至少三级水。
氢氧化钠溶液碱性铜试剂，盐酸溶液[c（HCl）=1mol∕L]，亚铁氰化钾溶液{w[K4Fe（CN）6·H2O=15％]}，硫酸锌溶液[w(ZnSO4·7H2O）6·H2O=30％]，硫酸+草酸混合液，硫代硫酸钠溶液，硫代硫酸钠工作溶液[c（Na2S2O3）=0.005mol∕L]，淀粉指示剂，酚酞指示剂，氢氧化钠溶液[c（NaOH）=0.5mol∕L]，葡萄糖标准液。
2.2.2仪器和设备
分析天平，高速组织捣碎机，电磁炉、可调温电炉或恒温水浴锅，25mL滴定管，（酸式、减式皆可），鼓风干燥箱。
2.3 实验方法
2.3.1样品制备
（1）新鲜样品：取有代表性的样品，洗净，把水吸干，用四分法取样，切碎，混匀，用组织捣碎机匀浆。黄瓜，番茄等多汁蔬菜可直接制成匀浆。其他样品蔬菜可称取切碎混匀的样品100.0g，加入100mL水制成匀浆，韭菜等水分较少的蔬菜可称取切碎混匀的样品100.0g，加入200mL水制成匀浆。去相当于10g样品的匀浆，精确到0.01g，用水洗入100mL容量瓶（V1）中，加入亚铁氰化钾溶液和硫酸锌溶液各1mL（如菜豆累高蛋白蔬菜可加入2mL）。摇匀后定容，放置片刻，等沉淀分离后过滤备用。
（2）干制品：将样品至于63℃~67℃鼓风干燥后，用粉碎机粉碎，过0.5mm筛。去1.00g~2.00g粉碎的样品防雨烧杯中，加入少量水湿润，用水洗入100mL容量瓶中，用沸水浴加热10min，冷却后，加入亚铁氰化钾溶液和硫酸锌溶液各1mL，摇匀后定容，过滤后备用。
（3） 制品各种酱腌菜：去切碎混匀的样品100.0g，加入100mL水制成匀浆。蔬菜罐头可直接制取匀浆，操作步骤同5.1。番茄酱混匀后，可直接制取5.00g样品用水洗入100mL容量瓶同5.1操作。蔬菜汁称取混匀的样品20.00g用水洗入100mL容量瓶同
5.1操作。
2.3.2还原糖的鉴定
（1） 标准曲线的制作：用移液管吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL的葡萄糖标准液与100mL锥形瓶中，或200mm×25mm的试管中，各加水至5.0mL，加入5mL的铜试剂，锥形瓶或试管口上加小漏斗，用相应的架子固定，置于沸水浴中加热15min。取出后立即置于冷水中，冷却至25℃到30℃。将加盖小漏斗更换为表面皿（不可摇动）。加入2mL硫酸+草酸的混合液，立即摇动，使氢氧化亚铜完全溶解。用硫代硫酸钠工作溶液滴定至浅黄绿色时，加入约0.5mL的淀粉指示剂，滴定至蓝色消失为终点。以糖的含量（mg）为y，空白与糖液滴定差值为x，计算回归方程y=bx+a并计算出a和b的值。标准曲线于没新配一次铜试剂和硫代硫酸钠储备液制备一次即可。
（2）试样还原糖的测定：根据不同样品中糖的含量，用移液管吸取5mL～10mL(V2)与50mL或100mL(V3)于容量瓶中.用水定容(含糖量低的样品不作次稀释处理)。从容量瓶中吸取5.00mL（V5）与锥形瓶或试管中，加入5.00mL的铜试剂。以下按6.1.1标准曲线的制作步骤操作。记录滴定值（V4）。同时以水代替试样作空白（可不加热）。将试样与空白滴定差值带入回归方程即可算出试样中还原糖的含量。如试样与铜试剂加热反应后，砖红色氧化亚铜的含量较多看不到蓝色，则样品含糖量偏高，可酌情吸取1mL～4mL样液，加水至5.00mL测定。滴定值应不少于标准曲线的最高点。
（3）试样可溶性总糖测定：用移液管吸取5mL～10mL与50mL或100mL于容量瓶中，加入1mL的盐酸溶液，置于沸水浴中加热10min，冷却，加入酚酞试剂1～2滴，用约0.5mol∕L氢氧化钠溶液中和至红色，再用稀盐酸调定红色刚刚消失，定容。以下按还原糖步骤操作[1]。
2.3.3结果计算
试样中可溶性总糖的的含量以质量分数w1计，单位以百分率（％）表示，计算式如下：
W1=[a+b(V0-V4)×V1×V3]/V2×V5×m×1000
3 费林试剂法
3.1 原理
在沸热条件下,用还原糖溶液滴定一定量的费林试剂时将费林试剂中的二价铜还原
为一价铜,以亚甲基蓝为指示剂,稍过量的还原糖立即使蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的还原型亚甲基蓝。
3.2 仪器与试剂
3.2.1仪器设备
高速组织捣碎机，电热恒温水浴，1000W调温电炉，200ml,250ml容量瓶，250ml锥形瓶，50ml碱式滴定管。
3.2.2实验试剂
（1）费林试剂甲：称取硫酸铜(CuSO4·5H2O，分析纯)34.6g溶于水中，稀释至500ml， 过滤，贮于棕色瓶内。
（2）费林试剂乙：称取氢氧化钠 50g和酒石酸钾钠(KNaC4O6H4·4H2O，分析纯)138g溶于水中，稀释至 500ml,用石棉垫漏斗抽滤。
（3）转化糖标准溶液：称取9.5g蔗糖(分析纯)用水溶解后转入1000ml容量瓶中，加入6MHCl(分析纯)10ml,加水至100ml。在20～25℃下放置三天或在 25℃保温24h，然后用水定容(此为酸化的1%转化糖液,可保存3～4个月)。测定时，取1%转化糖液 25.00ml放入250ml容量瓶中,加入甲基红指示剂一滴，用 1MNaOH溶液中和后用水定容，即为1mg/ml转化糖标准溶液。
（4）亚甲基蓝溶液：称取0.5g亚甲基蓝(分析纯)溶于100ml水中。
（5）乙酸锌溶液：称取21.9g乙酸锌［Zn(OAC)2·2H2O，分析纯］溶于水中，加冰乙酸3ml，稀释至 100ml。
（6）亚铁氰化钾溶液：称取10.6g亚铁氰化钾［K4Fe(CN)6·3H2O,分析纯］溶于水， 稀释至 100ml。
3.3 实验方法
3.3.1样品提取液制备
取待测样品适量，洗净，用不锈钢刀将可食部分切成适当小块充分混匀后，按四分法取样。称取 100g鲜样加入等重量的水，放入组织捣碎机中捣成1:1匀浆，有些材料匀浆比例可适当调整，多汁果蔬类可直接捣浆。称取匀浆25.0或50.0g(相当于样品12.5或25.0g)放入150ml烧杯中，含有机酸较多的材料加0.5～2.0g粉状CaCO3调至中性(广范试纸检试)。用水将样液全部转入250ml容量瓶中，并调整体积约为200ml。置80±2℃水浴保温30min，其间摇动数次，取出加入乙酸锌溶液及亚铁氰化钾溶液各 2～5ml,冷却至室温后，用水定容，过滤备用。
3.3.2可溶性糖测定
（1）费林试剂的标定：取费林试剂甲、乙各5.00ml或在测定前先等体积混合后取10.00ml混合液于 250ml锥形瓶中,放入玻璃珠4～5粒,先加入比预测(按 6.2进行预测)仅少 0.5ml的 1mg/ml转化糖标准液。将此混合液置 1000W电炉上加热,使其在2min左右沸腾,准确煮沸2min,此时不离开电炉,立即加入 0.5%亚甲基蓝指示剂 6滴,并继续
以每 4～5s的滴速滴加标准糖液,直至二价铜离子完全被还原生成砖红色氧化亚铜沉淀,溶液蓝色褪尽为终点。用准确滴定标准糖液的毫升数V1,乘以标准糖液浓度 ［mg/ml］,即得 10ml费林试剂所相当的糖的毫克数。 取已经制备的待测液100ml于200ml容量瓶中,加 6MHCl10ml。在80±2℃水浴加热10min,放入冷水槽中冷却后,加甲基红指示剂二滴用6M及 1MNaOH溶液中和,用水定容。
（2）预测：取费林试剂甲、乙各5.00ml或 10.00ml混合液于250ml锥形瓶中,，滴定管加入待测糖液约 15ml,在电炉上加热至沸，约沸 15s后迅速滴加待测糖液,至呈现极轻微的蓝色为止，此时加入 0.5%亚甲基蓝指示剂 6 滴，继续滴加待测糖液，直至溶液蓝色褪尽为止，记下待测糖液的用量 V2(毫升数)。
（3）准确测定：取费林试剂甲、乙各5.00ml或10.00ml混合液加入锥形瓶中，由滴定管加入比预测仅少0.5ml的待测糖液，并补加V1－V2 毫升水(标定费林试剂所消耗的标准糖液毫升数V1减去预测消耗的待测糖液毫升数 V2,即为应补加水的毫升数)，使其与标定费林试剂时的反应体积一致。以下按费林试剂标定同样操作，继续滴至终点。前后沸热时间须在 3min左右。待测糖液消耗量应控制在15～50ml范围内，不能大于标定费林试剂所用标准糖液体积V1。否则应增减称样量重新制备待测液[2]。
3.3.3结果计算
待测液可溶性糖含量(%)=滴定标准糖液的毫升数/待测液滴定的毫升数
4 原子吸收法
4.1 原理
将样液与过量的碱性铜盐反应，使产生沉淀，然后取上层清液用原子吸收分光光谱仪测定剩余铜含量，通过标准曲线计算水果蔬菜中可溶性糖含量[3]。
4.2 仪器与试剂
4.2.1实验仪器
原子吸收分光光谱仪，电热恒温水浴锅，高效自动阻止捣碎机，电子天平。
4.2.2实验试剂
（1）葡萄糖标准贮备液，5g/L
（2）碱性铜盐溶液
（3）10%中性醋酸铅溶液
（4）6mol/L氢氧化钠溶液
（5）6mol/L盐酸溶液
（6）6mol/L硫酸钠溶液
4.3 实验方法
4.3.1工作曲线绘制
分别吸取糖标准贮备液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0ml于50 ml容量瓶中，加入碱性铜盐溶液5.0ml，于沸水浴中反应15min，取出后立即用冷水冷却，定容。静置澄清
后，吸取清液再稀释50倍，用原子吸收分光光谱仪，铜空心阴极灯于324.8nm测吸光度，用吸光度和糖浓度值绘制工作曲线。
4.3.2样品测定
取待测样品适量，洗净，用不锈钢刀将可食部分切成适当小块充分混匀后，按四分法取样，放入高效自动阻止捣碎机捣成匀浆。称取匀浆25g，用约100ml水洗入250ml容量瓶中，摇匀，放入80摄氏度水浴保温浸提30min，期间摇动数次，取出冷却后滴加中性醋酸铅溶液至不再产生沉淀为止，再加入1-2g硫酸钠溶液以除去溶液中的过剩铅盐，定容，过滤。吸取清液50ml放入100ml容量瓶中。加入6mol/L盐酸溶液5.0ml，于90摄氏度中水解10min。取出冷却后，用6mol/L氢氧化钠溶液中和，用水定容即为待测液。吸取待测液5.0ml，按与工作曲线相同程序测定。
4.3.3结果计算
X=C×V×F×100
式中：X为样品中可溶性糖含量%；
C为查标准曲线获得的糖浓度值；
V为定容体积；
F为稀释倍数。
5气相色谱法
5.1原理
用糖醇衍生化成乙酸酯，用石英毛细管色谱柱对稻子、小麦麸皮样品进行分析测定，得到样品中可溶性NSP各组成单糖的色谱峰，并依据色谱图提供的数据计算样品中可溶性非淀粉各组成单糖的含量及其总含量[4]。
5.2 仪器和试剂
5.2.1实验仪器
气相色谱仪，检测器FID，恒温振荡器。
5.2.2实验试剂
（1）无水乙醇，NaBH4，冰醋酸，乙酸酐，氢氧化钾，乙酸乙酯氨水均为分析纯。
（2）标准单糖：木糖，阿拉伯糖，甘露糖，葡萄糖，岩藻糖，半乳糖，鼠李糖，均为AR级。
（3）实验样品：稻子、小麦麸皮。
5.2.3气相色谱条件
（1）石英毛细管柱，规格为25m×0.3mm；
（2）起始温度195℃，升温速度8℃∕min，最后温度升至225℃；
（3）检测器温度为250℃；
（4）汽化室温度为210℃；
（5）分流比为1:20；
（6）载气N2；
（7）进气量为0.8ul。
5.3 试验方法
5.3.1样品的前处理
将麦子小麦和麸皮分别粉碎后通入0.5mm的筛子，磨细的粉末加入硅胶保干器中24个小时，保持湿度，准称样品100mg分别放入8mL带螺帽玻璃试管中，加入80﹪的乙醇5ml，并加至80℃10min，离心分离，吸出上清液，可除去游离糖，并使内源酶失活。
5.3.2淀粉与NSP的分离
在40℃时用N2吹干样品，加20ml醋酸缓冲液（pH0.5），加热至100℃30min，搅拌使淀粉凝胶，冷却至95℃，加入0.05mlα-淀粉酶，恒温震荡，冷却至55℃，加入0.2mlα-葡萄糖苷酶，使样品酶解。将可溶性NSP与淀粉分离，离心，取上层清夜做可溶性NSP鉴定。
5.3.3可溶性NSP的测定
取上层清夜1ml放入8ml带螺帽试管中，加4ml无水乙醇，充分振荡，离心去掉上层清夜，剩余物用N2吹干，加入1ml 2mol/L三氟乙酸，加热到125℃，使样品全部水解，冷却室温，加入0.1ml内标物（阿洛糖500mg/L）。并在混合液中加入0.2ml的无水乙醇，和一滴3mol/L的NH4OH,再加入新配置的NaBH4,放置于40℃的水浴中，加冰醋酸分解过量的NaBH4，加入0.5ml的1-甲基咪唑和5ml乙酸酐反应10min，然后加入1ml无水乙醇静置10min，分两次加入10ml7.5mol/L KOH，溶液分为两层，用少量乙酸乙酯提取有基层2-3次且合并。有机层用N2吹干，所得糖醇乙酸脂可直接进行气相分析。
5.3.4结果计算
X=（样品峰面积×内标物重量×1000×相应因子/内标物峰面积×样品重量）×聚合因子
6 液相色谱-蒸发光散射法
6.1 原理
不挥发样品颗粒对光的散射程度与其质量成正比。
6.2 仪器与试剂
6.2.1实验仪器
高效液相色谱仪；低温型蒸发光散射检测器；高速冷冻离心机；匀浆机；电子分析天平。
6.2.2实验试剂
（1）D-果糖，D-葡萄糖，蔗糖，各种糖标样的纯度均大于99%。
（2）乙腈为色谱纯试剂。
（3）实验用水为二次蒸馏水。
（4）苹果样品。
6.3 实验方法
6.3.1标准溶液的配制
精确称取果糖，葡萄糖，蔗糖各25.0mg置于25ml容量瓶中，用蒸馏水稀释、定容，配制成5mg/ml混合糖标准液。使用前用蒸馏水稀释成所需浓度的标准工作溶液。
6.3.2样品处理
准确称取10g果肉，研磨后加入50ml蒸馏水，于80℃恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使可溶性糖充分浸出，然后离心和过滤，将滤液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。待测液用0.45µm的微孔滤膜过滤，滤液供HPLC分析。
6.3.3绘制色谱图
（1）色谱柱：规格为4.6mmID×250mm，5µm；柱温为室温；流动相为V(乙醇)：V（水）=80:20；流速0.8ml/min；进样量5µL。
（2）蒸发光散射检测器（ELSD）的漂移管温度40℃，氮气作载气，流速1.5mL/min。
6.3.4结果计算
将配好的混合糖标准贮备液依次稀释为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0mg/mL的不同浓度混合糖标准溶液，在测定条件下进样5µL，根据测得的峰面积与相应糖的浓度进行线性回归，得到曲线方程。再将最小浓度的标准溶液逐级稀释，依次进样5µL，计算当信噪比S/N=5时所对应的糖标准溶液的质量浓度以确定检测限[5]。
7 连续流动法
7.1 原理
用盐酸直接水解样品中的可溶性糖，然后用连续流动分析仪测定样品中可溶性糖的含量。
7.2 仪器与试剂
7.2.1实验仪器
连续流动分析仪。
7.2.2实验试剂
（1）试验用水为二级水，其它所用试剂均为分析纯；
（2）盐酸溶液：42.4 mL HC1 37％(GR)用水稀释至1 000 mL，加入1 mL Brij35；
（3）碳酸钠溶液：26.5 g Na2CO (GR)用水稀释至1 000 mL，加入1 mL Brij35。
（4）盐酸新亚铜溶液：0.4 g盐酸新亚铜(C14H 3C1N2；GR)，加0.2 g CuSO 4· 5H20用水稀释至1 000 mL，加入0．5 mL Brij35。
（5）葡萄糖标准储备液50mg/mL：称取50 g葡萄糖，用水稀至1 000 mL。用水稀释配制葡萄糖标准曲线系列：0．05、0．2、0．6、1．0、2．0mg/mL。
7.3 实验方法
7.3.1 样品中可溶性糖的测定
称取试样2.5 g～10 g(m2)，置于250 mL容量瓶中，加入约200mL水充分摇匀，然
后加5 mL乙酸锌溶液(200 g/L)摇匀，加5 mL亚铁氰化钾溶液(100 g/L)，加水稀释至刻度摇匀过滤，滤液上机测定。
7.3.2上机测定
将标准系列及7.3.1的样品滤液放人自动进样器，用试剂盐酸溶液（2）、碳酸钠溶液（3）、盐酸新亚铜溶液（4）引入流动仪测定。
具体的实验参数为：第一热池温度：92℃ ，第一热池温度：88℃。进样
率：30个样/h，寻峰时段15 s～80 s。标准曲线类型：线性[6]。
7.3.3结果计算
X=c×250/m×1000
式中：X为样品中可溶性糖含量；
c为由回归曲线查得葡萄糖浓度，（mg/ml）；
m 为称样量，g；
250为定容体积，mL。
8 研究进展
费林试剂法虽然处理操作简单，需要的仪器设备少，但滴定条件要求苛刻，由于各种内外因素的影响，即使是熟练的技术人员，在实际的操作过程中，也很难保证一个试样的两次平行测定结果在方法规定的允许误差范围之内。但是原子吸收法弥补了这一不足，该法在处理获得样液之后，不采用滴定法，而是将样液直接与过量的碱性铜盐反应，使产生沉淀，然后取上层清液用原子吸收分光光谱仪测定剩余铜含量，通过标准曲线计算水果蔬菜中可溶性糖含量，该方法简单易行。
随着科学技术的不断进步，人们开始采用气相色谱，液相色谱等精密仪器来定性及定量测定可溶性糖。一般的化学方法只能测定糖的含量，不能测定糖的组分。气相色谱法虽可测定糖的组成，但必须进行对糖进行衍生化才可测定，从而使检测步骤繁琐，且不可避免地引入误差。而使用高效液相色谱法是由于糖本身在紫外区无吸收，通常使用RID进行检测，但RID检测器灵敏度较低，而且受外界影响因素大。蒸发光散射检测器作为一种新型的通用型质量检测器，稳定性好，灵敏度高，无溶剂峰影响，弥补了HPLC传统检测器的不足。
铜还原碘量法、费林试剂法、色谱法、蒽酮比色法[7-8]等这些方法的前处理耗时耗材，且逐个滴定，耗用很大人工物力，分析操作繁琐冗长，极大地限制了分析速度，批量检测尤其困难。连续流动仪作为新一代的分析仪器提供了较低的检出限，较宽的动态线性范围，进样、检测和数据处理全部自动化[9-10]，具有实验方法简单，耗材少，准确性高，重现性好，速度快，适于大批量检测等优点。
河北大学2010届本科课程设计
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引言
可溶性糖包括葡萄糖、果糖、蔗糖等单糖和双糖，是植物品质的重要构成性状之一，尤其是以果实为目的产品的植物，可溶性糖与酸的含量及其配比是影响果实风味品质的重要因素。对于鲜食品种，一般来讲，高糖中酸，风味浓，品质优；低糖中酸，风味淡，品质差。因此，可溶性糖的定量研究对植物的品质育种、储藏、加工特性等具有重要意义。而且可溶性糖广泛存在于植物的根、茎块和种子中，是人体热量的最最主要来源，具有较高的营养价值。本文重点介绍蒽酮比色法、铜还原碘量法、费林试剂法、原子吸收法、气相色谱法、液相色谱-蒸发光散射法，及连续流动法这几种实验如何定量测定可溶性糖含量。
1 蒽酮比色法
1.1 原理
糖在硫酸作用下生成糠醛，糠醛再与蒽酮作用形成绿色络合物，颜色的深浅与糖含量有关。在625 nm波长下的OD值与糖含量成正比。由于蒽酮试剂与糖反应的呈色强度随时间变化，故必须在反应后立即在同一时间内比色。
1.2 仪器与材料
1.2.1实验仪器
分光光度计，电炉，铝锅，电子天平，20ml刻度试管，刻度吸管5ml 1支、1ml 2支，漏斗。
1.2.2实验试剂
（1）蒽酮乙酸乙酯试剂：取分析纯蒽酮1g，溶于50ml乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中，在黑暗中可保存数星期，如有结晶析出，可微热溶解。
（2）浓硫酸（比重1.84）。
1.2.3实验材料
植物叶片。
1.3 实验方法
1.3.1标准曲线的制作
取20ml刻度试管11支，从0～10分别编号，按表24-1加入溶液和水。
然后按顺序向试管内加入1ml 9%苯酚溶液，摇匀，再从管液正面快速加入5ml浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8ml，在恒温下放置30min，显色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。按表1加入标准的蔗糖溶液，然后按顺序向试管中加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂和5ml浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm波长下测其光密度，以光密度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。
1.3.2可溶性糖的提取
取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10～0.30g，共3份，或干材料。
分别放入3支刻度试管中，加入5～10ml蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25ml容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。
1.3.3显色测定
吸取样品提取液0.5ml于20ml刻度试管中（重复2次），加蒸馏水1.5ml，以下步骤与标准曲线测定相同，测定样品的光密度。
1.3.4结果计算
可溶性糖含量(mg/g) = （从回归方程求得糖量/吸取样品液的体积）×提取液量×稀释倍数÷样品干重×10-6
2 铜还原碘量法
2.1 原理
试剂中的Cu2+与还原糖作用，生成氧化亚铜(Cu2O)沉淀。加入H2SO4后，氧化亚铜溶解生成Cu+,试剂中的KIO3与KI在酸化的同是生成I2。
KIO3+5KI+3H2SO4→3K2SO4+3H2O+3I2，然后Cu+被I2氧化，2Cu++I2 →2Cu+ + 2I-
溶液中剩余的碘以淀粉为指示剂，用Na2S2O3标准溶液滴定：Na2S2O3+ I2 → Na2S2O6 + 2NaI
同时以水代替样试液做空白滴定，将空白与样品的滴定差值带入由滴定标准系列糖液计算的回归方程中，即可求得所求试样中还原糖的含量。
2.2 仪器与试剂
2.2.1实验试剂
除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和GB∕T 6682 规定的至少三级水。
氢氧化钠溶液碱性铜试剂，盐酸溶液[c（HCl）=1mol∕L]，亚铁氰化钾溶液{w[K4Fe（CN）6·H2O=15％]}，硫酸锌溶液[w(ZnSO4·7H2O）6·H2O=30％]，硫酸+草酸混合液，硫代硫酸钠溶液，硫代硫酸钠工作溶液[c（Na2S2O3）=0.005mol∕L]，淀粉指示剂，酚酞指示剂，氢氧化钠溶液[c（NaOH）=0.5mol∕L]，葡萄糖标准液。
2.2.2仪器和设备
分析天平，高速组织捣碎机，电磁炉、可调温电炉或恒温水浴锅，25mL滴定管，（酸式、减式皆可），鼓风干燥箱。
2.3 实验方法
2.3.1样品制备
（1）新鲜样品：取有代表性的样品，洗净，把水吸干，用四分法取样，切碎，混匀，用组织捣碎机匀浆。黄瓜，番茄等多汁蔬菜可直接制成匀浆。其他样品蔬菜可称取切碎混匀的样品100.0g，加入100mL水制成匀浆，韭菜等水分较少的蔬菜可称取切碎混匀的样品100.0g，加入200mL水制成匀浆。去相当于10g样品的匀浆，精确到0.01g，用水洗入100mL容量瓶（V1）中，加入亚铁氰化钾溶液和硫酸锌溶液各1mL（如菜豆累高蛋白蔬菜可加入2mL）。摇匀后定容，放置片刻，等沉淀分离后过滤备用。
（2）干制品：将样品至于63℃~67℃鼓风干燥后，用粉碎机粉碎，过0.5mm筛。去1.00g~2.00g粉碎的样品防雨烧杯中，加入少量水湿润，用水洗入100mL容量瓶中，用沸水浴加热10min，冷却后，加入亚铁氰化钾溶液和硫酸锌溶液各1mL，摇匀后定容，过滤后备用。
（3） 制品各种酱腌菜：去切碎混匀的样品100.0g，加入100mL水制成匀浆。蔬菜罐头可直接制取匀浆，操作步骤同5.1。番茄酱混匀后，可直接制取5.00g样品用水洗入100mL容量瓶同5.1操作。蔬菜汁称取混匀的样品20.00g用水洗入100mL容量瓶同
5.1操作。
2.3.2还原糖的鉴定
（1） 标准曲线的制作：用移液管吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL的葡萄糖标准液与100mL锥形瓶中，或200mm×25mm的试管中，各加水至5.0mL，加入5mL的铜试剂，锥形瓶或试管口上加小漏斗，用相应的架子固定，置于沸水浴中加热15min。取出后立即置于冷水中，冷却至25℃到30℃。将加盖小漏斗更换为表面皿（不可摇动）。加入2mL硫酸+草酸的混合液，立即摇动，使氢氧化亚铜完全溶解。用硫代硫酸钠工作溶液滴定至浅黄绿色时，加入约0.5mL的淀粉指示剂，滴定至蓝色消失为终点。以糖的含量（mg）为y，空白与糖液滴定差值为x，计算回归方程y=bx+a并计算出a和b的值。标准曲线于没新配一次铜试剂和硫代硫酸钠储备液制备一次即可。
（2）试样还原糖的测定：根据不同样品中糖的含量，用移液管吸取5mL～10mL(V2)与50mL或100mL(V3)于容量瓶中.用水定容(含糖量低的样品不作次稀释处理)。从容量瓶中吸取5.00mL（V5）与锥形瓶或试管中，加入5.00mL的铜试剂。以下按6.1.1标准曲线的制作步骤操作。记录滴定值（V4）。同时以水代替试样作空白（可不加热）。将试样与空白滴定差值带入回归方程即可算出试样中还原糖的含量。如试样与铜试剂加热反应后，砖红色氧化亚铜的含量较多看不到蓝色，则样品含糖量偏高，可酌情吸取1mL～4mL样液，加水至5.00mL测定。滴定值应不少于标准曲线的最高点。
（3）试样可溶性总糖测定：用移液管吸取5mL～10mL与50mL或100mL于容量瓶中，加入1mL的盐酸溶液，置于沸水浴中加热10min，冷却，加入酚酞试剂1～2滴，用约0.5mol∕L氢氧化钠溶液中和至红色，再用稀盐酸调定红色刚刚消失，定容。以下按还原糖步骤操作[1]。
2.3.3结果计算
试样中可溶性总糖的的含量以质量分数w1计，单位以百分率（％）表示，计算式如下：
W1=[a+b(V0-V4)×V1×V3]/V2×V5×m×1000
3 费林试剂法
3.1 原理
在沸热条件下,用还原糖溶液滴定一定量的费林试剂时将费林试剂中的二价铜还原
为一价铜,以亚甲基蓝为指示剂,稍过量的还原糖立即使蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的还原型亚甲基蓝。
3.2 仪器与试剂
3.2.1仪器设备
高速组织捣碎机，电热恒温水浴，1000W调温电炉，200ml,250ml容量瓶，250ml锥形瓶，50ml碱式滴定管。
3.2.2实验试剂
（1）费林试剂甲：称取硫酸铜(CuSO4·5H2O，分析纯)34.6g溶于水中，稀释至500ml， 过滤，贮于棕色瓶内。
（2）费林试剂乙：称取氢氧化钠 50g和酒石酸钾钠(KNaC4O6H4·4H2O，分析纯)138g溶于水中，稀释至 500ml,用石棉垫漏斗抽滤。
（3）转化糖标准溶液：称取9.5g蔗糖(分析纯)用水溶解后转入1000ml容量瓶中，加入6MHCl(分析纯)10ml,加水至100ml。在20～25℃下放置三天或在 25℃保温24h，然后用水定容(此为酸化的1%转化糖液,可保存3～4个月)。测定时，取1%转化糖液 25.00ml放入250ml容量瓶中,加入甲基红指示剂一滴，用 1MNaOH溶液中和后用水定容，即为1mg/ml转化糖标准溶液。
（4）亚甲基蓝溶液：称取0.5g亚甲基蓝(分析纯)溶于100ml水中。
（5）乙酸锌溶液：称取21.9g乙酸锌［Zn(OAC)2·2H2O，分析纯］溶于水中，加冰乙酸3ml，稀释至 100ml。
（6）亚铁氰化钾溶液：称取10.6g亚铁氰化钾［K4Fe(CN)6·3H2O,分析纯］溶于水， 稀释至 100ml。
3.3 实验方法
3.3.1样品提取液制备
取待测样品适量，洗净，用不锈钢刀将可食部分切成适当小块充分混匀后，按四分法取样。称取 100g鲜样加入等重量的水，放入组织捣碎机中捣成1:1匀浆，有些材料匀浆比例可适当调整，多汁果蔬类可直接捣浆。称取匀浆25.0或50.0g(相当于样品12.5或25.0g)放入150ml烧杯中，含有机酸较多的材料加0.5～2.0g粉状CaCO3调至中性(广范试纸检试)。用水将样液全部转入250ml容量瓶中，并调整体积约为200ml。置80±2℃水浴保温30min，其间摇动数次，取出加入乙酸锌溶液及亚铁氰化钾溶液各 2～5ml,冷却至室温后，用水定容，过滤备用。
3.3.2可溶性糖测定
（1）费林试剂的标定：取费林试剂甲、乙各5.00ml或在测定前先等体积混合后取10.00ml混合液于 250ml锥形瓶中,放入玻璃珠4～5粒,先加入比预测(按 6.2进行预测)仅少 0.5ml的 1mg/ml转化糖标准液。将此混合液置 1000W电炉上加热,使其在2min左右沸腾,准确煮沸2min,此时不离开电炉,立即加入 0.5%亚甲基蓝指示剂 6滴,并继续
以每 4～5s的滴速滴加标准糖液,直至二价铜离子完全被还原生成砖红色氧化亚铜沉淀,溶液蓝色褪尽为终点。用准确滴定标准糖液的毫升数V1,乘以标准糖液浓度 ［mg/ml］,即得 10ml费林试剂所相当的糖的毫克数。 取已经制备的待测液100ml于200ml容量瓶中,加 6MHCl10ml。在80±2℃水浴加热10min,放入冷水槽中冷却后,加甲基红指示剂二滴用6M及 1MNaOH溶液中和,用水定容。
（2）预测：取费林试剂甲、乙各5.00ml或 10.00ml混合液于250ml锥形瓶中,，滴定管加入待测糖液约 15ml,在电炉上加热至沸，约沸 15s后迅速滴加待测糖液,至呈现极轻微的蓝色为止，此时加入 0.5%亚甲基蓝指示剂 6 滴，继续滴加待测糖液，直至溶液蓝色褪尽为止，记下待测糖液的用量 V2(毫升数)。
（3）准确测定：取费林试剂甲、乙各5.00ml或10.00ml混合液加入锥形瓶中，由滴定管加入比预测仅少0.5ml的待测糖液，并补加V1－V2 毫升水(标定费林试剂所消耗的标准糖液毫升数V1减去预测消耗的待测糖液毫升数 V2,即为应补加水的毫升数)，使其与标定费林试剂时的反应体积一致。以下按费林试剂标定同样操作，继续滴至终点。前后沸热时间须在 3min左右。待测糖液消耗量应控制在15～50ml范围内，不能大于标定费林试剂所用标准糖液体积V1。否则应增减称样量重新制备待测液[2]。
3.3.3结果计算
待测液可溶性糖含量(%)=滴定标准糖液的毫升数/待测液滴定的毫升数
4 原子吸收法
4.1 原理
将样液与过量的碱性铜盐反应，使产生沉淀，然后取上层清液用原子吸收分光光谱仪测定剩余铜含量，通过标准曲线计算水果蔬菜中可溶性糖含量[3]。
4.2 仪器与试剂
4.2.1实验仪器
原子吸收分光光谱仪，电热恒温水浴锅，高效自动阻止捣碎机，电子天平。
4.2.2实验试剂
（1）葡萄糖标准贮备液，5g/L
（2）碱性铜盐溶液
（3）10%中性醋酸铅溶液
（4）6mol/L氢氧化钠溶液
（5）6mol/L盐酸溶液
（6）6mol/L硫酸钠溶液
4.3 实验方法
4.3.1工作曲线绘制
分别吸取糖标准贮备液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0ml于50 ml容量瓶中，加入碱性铜盐溶液5.0ml，于沸水浴中反应15min，取出后立即用冷水冷却，定容。静置澄清
后，吸取清液再稀释50倍，用原子吸收分光光谱仪，铜空心阴极灯于324.8nm测吸光度，用吸光度和糖浓度值绘制工作曲线。
4.3.2样品测定
取待测样品适量，洗净，用不锈钢刀将可食部分切成适当小块充分混匀后，按四分法取样，放入高效自动阻止捣碎机捣成匀浆。称取匀浆25g，用约100ml水洗入250ml容量瓶中，摇匀，放入80摄氏度水浴保温浸提30min，期间摇动数次，取出冷却后滴加中性醋酸铅溶液至不再产生沉淀为止，再加入1-2g硫酸钠溶液以除去溶液中的过剩铅盐，定容，过滤。吸取清液50ml放入100ml容量瓶中。加入6mol/L盐酸溶液5.0ml，于90摄氏度中水解10min。取出冷却后，用6mol/L氢氧化钠溶液中和，用水定容即为待测液。吸取待测液5.0ml，按与工作曲线相同程序测定。
4.3.3结果计算
X=C×V×F×100
式中：X为样品中可溶性糖含量%；
C为查标准曲线获得的糖浓度值；
V为定容体积；
F为稀释倍数。
5气相色谱法
5.1原理
用糖醇衍生化成乙酸酯，用石英毛细管色谱柱对稻子、小麦麸皮样品进行分析测定，得到样品中可溶性NSP各组成单糖的色谱峰，并依据色谱图提供的数据计算样品中可溶性非淀粉各组成单糖的含量及其总含量[4]。
5.2 仪器和试剂
5.2.1实验仪器
气相色谱仪，检测器FID，恒温振荡器。
5.2.2实验试剂
（1）无水乙醇，NaBH4，冰醋酸，乙酸酐，氢氧化钾，乙酸乙酯氨水均为分析纯。
（2）标准单糖：木糖，阿拉伯糖，甘露糖，葡萄糖，岩藻糖，半乳糖，鼠李糖，均为AR级。
（3）实验样品：稻子、小麦麸皮。
5.2.3气相色谱条件
（1）石英毛细管柱，规格为25m×0.3mm；
（2）起始温度195℃，升温速度8℃∕min，最后温度升至225℃；
（3）检测器温度为250℃；
（4）汽化室温度为210℃；
（5）分流比为1:20；
（6）载气N2；
（7）进气量为0.8ul。
5.3 试验方法
5.3.1样品的前处理
将麦子小麦和麸皮分别粉碎后通入0.5mm的筛子，磨细的粉末加入硅胶保干器中24个小时，保持湿度，准称样品100mg分别放入8mL带螺帽玻璃试管中，加入80﹪的乙醇5ml，并加至80℃10min，离心分离，吸出上清液，可除去游离糖，并使内源酶失活。
5.3.2淀粉与NSP的分离
在40℃时用N2吹干样品，加20ml醋酸缓冲液（pH0.5），加热至100℃30min，搅拌使淀粉凝胶，冷却至95℃，加入0.05mlα-淀粉酶，恒温震荡，冷却至55℃，加入0.2mlα-葡萄糖苷酶，使样品酶解。将可溶性NSP与淀粉分离，离心，取上层清夜做可溶性NSP鉴定。
5.3.3可溶性NSP的测定
取上层清夜1ml放入8ml带螺帽试管中，加4ml无水乙醇，充分振荡，离心去掉上层清夜，剩余物用N2吹干，加入1ml 2mol/L三氟乙酸，加热到125℃，使样品全部水解，冷却室温，加入0.1ml内标物（阿洛糖500mg/L）。并在混合液中加入0.2ml的无水乙醇，和一滴3mol/L的NH4OH,再加入新配置的NaBH4,放置于40℃的水浴中，加冰醋酸分解过量的NaBH4，加入0.5ml的1-甲基咪唑和5ml乙酸酐反应10min，然后加入1ml无水乙醇静置10min，分两次加入10ml7.5mol/L KOH，溶液分为两层，用少量乙酸乙酯提取有基层2-3次且合并。有机层用N2吹干，所得糖醇乙酸脂可直接进行气相分析。
5.3.4结果计算
X=（样品峰面积×内标物重量×1000×相应因子/内标物峰面积×样品重量）×聚合因子
6 液相色谱-蒸发光散射法
6.1 原理
不挥发样品颗粒对光的散射程度与其质量成正比。
6.2 仪器与试剂
6.2.1实验仪器
高效液相色谱仪；低温型蒸发光散射检测器；高速冷冻离心机；匀浆机；电子分析天平。
6.2.2实验试剂
（1）D-果糖，D-葡萄糖，蔗糖，各种糖标样的纯度均大于99%。
（2）乙腈为色谱纯试剂。
（3）实验用水为二次蒸馏水。
（4）苹果样品。
6.3 实验方法
6.3.1标准溶液的配制
精确称取果糖，葡萄糖，蔗糖各25.0mg置于25ml容量瓶中，用蒸馏水稀释、定容，配制成5mg/ml混合糖标准液。使用前用蒸馏水稀释成所需浓度的标准工作溶液。
6.3.2样品处理
准确称取10g果肉，研磨后加入50ml蒸馏水，于80℃恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使可溶性糖充分浸出，然后离心和过滤，将滤液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。待测液用0.45µm的微孔滤膜过滤，滤液供HPLC分析。
6.3.3绘制色谱图
（1）色谱柱：规格为4.6mmID×250mm，5µm；柱温为室温；流动相为V(乙醇)：V（水）=80:20；流速0.8ml/min；进样量5µL。
（2）蒸发光散射检测器（ELSD）的漂移管温度40℃，氮气作载气，流速1.5mL/min。
6.3.4结果计算
将配好的混合糖标准贮备液依次稀释为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0mg/mL的不同浓度混合糖标准溶液，在测定条件下进样5µL，根据测得的峰面积与相应糖的浓度进行线性回归，得到曲线方程。再将最小浓度的标准溶液逐级稀释，依次进样5µL，计算当信噪比S/N=5时所对应的糖标准溶液的质量浓度以确定检测限[5]。
7 连续流动法
7.1 原理
用盐酸直接水解样品中的可溶性糖，然后用连续流动分析仪测定样品中可溶性糖的含量。
7.2 仪器与试剂
7.2.1实验仪器
连续流动分析仪。
7.2.2实验试剂
（1）试验用水为二级水，其它所用试剂均为分析纯；
（2）盐酸溶液：42.4 mL HC1 37％(GR)用水稀释至1 000 mL，加入1 mL Brij35；
（3）碳酸钠溶液：26.5 g Na2CO (GR)用水稀释至1 000 mL，加入1 mL Brij35。
（4）盐酸新亚铜溶液：0.4 g盐酸新亚铜(C14H 3C1N2；GR)，加0.2 g CuSO 4· 5H20用水稀释至1 000 mL，加入0．5 mL Brij35。
（5）葡萄糖标准储备液50mg/mL：称取50 g葡萄糖，用水稀至1 000 mL。用水稀释配制葡萄糖标准曲线系列：0．05、0．2、0．6、1．0、2．0mg/mL。
7.3 实验方法
7.3.1 样品中可溶性糖的测定
称取试样2.5 g～10 g(m2)，置于250 mL容量瓶中，加入约200mL水充分摇匀，然
后加5 mL乙酸锌溶液(200 g/L)摇匀，加5 mL亚铁氰化钾溶液(100 g/L)，加水稀释至刻度摇匀过滤，滤液上机测定。
7.3.2上机测定
将标准系列及7.3.1的样品滤液放人自动进样器，用试剂盐酸溶液（2）、碳酸钠溶液（3）、盐酸新亚铜溶液（4）引入流动仪测定。
具体的实验参数为：第一热池温度：92℃ ，第一热池温度：88℃。进样
率：30个样/h，寻峰时段15 s～80 s。标准曲线类型：线性[6]。
7.3.3结果计算
X=c×250/m×1000
式中：X为样品中可溶性糖含量；
c为由回归曲线查得葡萄糖浓度，（mg/ml）；
m 为称样量，g；
250为定容体积，mL。
8 研究进展
费林试剂法虽然处理操作简单，需要的仪器设备少，但滴定条件要求苛刻，由于各种内外因素的影响，即使是熟练的技术人员，在实际的操作过程中，也很难保证一个试样的两次平行测定结果在方法规定的允许误差范围之内。但是原子吸收法弥补了这一不足，该法在处理获得样液之后，不采用滴定法，而是将样液直接与过量的碱性铜盐反应，使产生沉淀，然后取上层清液用原子吸收分光光谱仪测定剩余铜含量，通过标准曲线计算水果蔬菜中可溶性糖含量，该方法简单易行。
随着科学技术的不断进步，人们开始采用气相色谱，液相色谱等精密仪器来定性及定量测定可溶性糖。一般的化学方法只能测定糖的含量，不能测定糖的组分。气相色谱法虽可测定糖的组成，但必须进行对糖进行衍生化才可测定，从而使检测步骤繁琐，且不可避免地引入误差。而使用高效液相色谱法是由于糖本身在紫外区无吸收，通常使用RID进行检测，但RID检测器灵敏度较低，而且受外界影响因素大。蒸发光散射检测器作为一种新型的通用型质量检测器，稳定性好，灵敏度高，无溶剂峰影响，弥补了HPLC传统检测器的不足。
铜还原碘量法、费林试剂法、色谱法、蒽酮比色法[7-8]等这些方法的前处理耗时耗材，且逐个滴定，耗用很大人工物力，分析操作繁琐冗长，极大地限制了分析速度，批量检测尤其困难。连续流动仪作为新一代的分析仪器提供了较低的检出限，较宽的动态线性范围，进样、检测和数据处理全部自动化[9-10]，具有实验方法简单，耗材少，准确性高，重现性好，速度快，适于大批量检测等优点。
河北大学2010届本科课程设计
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