一、实验目的
1．了解微核测试的原理和毒理遗传学在实际生活与工作中的应用范围及意义
2．学习蚕豆根尖的微核测试技术
二、实验原理
微核（micronucleus, 简称MCN ），也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。微核往往是各种理化因子，如辐射、化学药剂对分裂细胞作用而产生的。在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA 的能力。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。有实验证明，整条染色体或几条染色体也能形成微核。这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。已经证实，微核率的大小是和作用因子的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点与染色体畸变的情况一样。蚕豆根尖微(micronucleus，MCN) 技术是一种检测化学品对生物毒害的遗传毒理学方法。不仅具有简便、快速、重复性好和灵敏度高的优势，而且其检测结果与动物试验结果具有很高的一致性。
亚硝酸盐广泛存在于自然环境(水体、土壤、植物) 中，许多腌制食品中亦含有亚硝酸盐。在胃酸等环境下亚硝酸盐与食物中的仲胺、叔胺和酰胺或蛋白质分解产物等反应生成强致癌物N_亚硝胺。亚硝胺还能够透过胎盘进入胎儿体内，对胎儿有致畸作用。硝酸盐和亚硝酸盐作为化学物质的毒害性多有研究，但把蚕豆根尖细胞微核技术用于食品添加剂的安全评价和检测其对生物体诱变效应的遗传毒理性试验却未见报道。NaNO2对蚕豆根尖的微核效应，由此证明蚕豆可以作为快速、灵敏检测食品中亚硝酸盐遗传毒性的供试材料。
三、实验材料
蚕豆种子、显微镜、载玻片、盖玻片、培养皿、滤纸、
NaNO 2 蒸馏水
卡纳氏固定液（3甲醇：1冰醋酸）
改良苯酚品红溶液
四、实验过程
1、被测试剂的配制与分组
用蒸馏水将NaN02配制成0．01、0．02、0．04、0．08 mmol/L 4种不同的浓度；
另设蒸馏水做对照(CK)组。另设蒸馏水做对照(CK)组。最后对应分成5组。 2 、浸种、催芽
选取籽粒饱满、大小一致的蚕豆种子洗净后，放入盛有蒸馏水的烧杯中，25℃下浸泡24 h 期间换水2次。待种子吸胀后，用纱布包裹置于培养皿中，在25℃恒 温生化培养箱中催芽24 h，至初生根长至2 cm左右。
3、染毒
选取发育良好，大小与根近似的蚕豆幼苗，将幼苗分别放入盛有不同浓度NaNO3和不同浓度NAN02溶液的培养皿中，染毒6 h 。然后用蒸馏水清洗根尖3～5次，换人新鲜蒸馏水培养24 h。同时用蒸馏水设立空白对照组。
4、 根尖细胞固定
切取根尖1 cm，用新配的卡诺氏固定液(甲醇：冰醋酸=3：1) 固定24 h，固定材料可经95％酒精和70％酒精各处理0．5 h，然后放入70％酒精中，在4℃冰箱中保存(保存时间不超过2个月) 。
5、 解离
从固定液中取出蚕豆根尖，用蒸馏水漂洗，再放到0．10 mol ／L HC1中，在60℃ 水浴中处理15 min，再用45％的醋酸处理10 min，使根尖软化。
6、 染色和压片
取处理好的根尖用蒸馏水漂洗后，置于载玻片上，用吸水纸吸去多余的液体，用
刀片将根尖的分生组织切下并切碎，加1～2滴改良的苯酚一碱性品红染色20 min ，采用十字压片法制片。
7、镜检及微核识别标准
常规制片后，将玻片标本放在显微镜的低倍镜下观察，找到分生组织区细胞分散良好、核膨大、分裂相多的部分转到高倍镜下进行观察。
微核识别标准：
（1）在主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。
（2）小核着色与主核相当或稍浅。
（3）小核形态为圆形、椭圆形或不规则型。
每一处理观察3个根尖，每个根尖计数1000个细胞中的微核数并进行记录。
五、实验数据的统计处理和污染程度划分
将实验数据按一下步骤进行统计学分析处理：
1．计算各测试样品（包括对照组）微核千分率（MCN‰）
如果对照本底MCN‰为10‰以下，可采用如下标准进行分析以确定样品的污染程度：
MCN‰在10‰以下，表示基本没有污染；
MCN‰在10‰－18‰区间，则表示有轻度污染；
MC N‰大于30‰，表示有重度污染；
2. 也可以计算各测试样品（包括对照组）污染指数
污染指数PI=实测微核率/对照组微核率
PI
1.5
2
PI>3.5 中度污染
3．统计表格
一、实验目的
1．了解微核测试的原理和毒理遗传学在实际生活与工作中的应用范围及意义
2．学习蚕豆根尖的微核测试技术
二、实验原理
微核（micronucleus, 简称MCN ），也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。微核往往是各种理化因子，如辐射、化学药剂对分裂细胞作用而产生的。在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA 的能力。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。有实验证明，整条染色体或几条染色体也能形成微核。这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。已经证实，微核率的大小是和作用因子的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点与染色体畸变的情况一样。蚕豆根尖微(micronucleus，MCN) 技术是一种检测化学品对生物毒害的遗传毒理学方法。不仅具有简便、快速、重复性好和灵敏度高的优势，而且其检测结果与动物试验结果具有很高的一致性。
亚硝酸盐广泛存在于自然环境(水体、土壤、植物) 中，许多腌制食品中亦含有亚硝酸盐。在胃酸等环境下亚硝酸盐与食物中的仲胺、叔胺和酰胺或蛋白质分解产物等反应生成强致癌物N_亚硝胺。亚硝胺还能够透过胎盘进入胎儿体内，对胎儿有致畸作用。硝酸盐和亚硝酸盐作为化学物质的毒害性多有研究，但把蚕豆根尖细胞微核技术用于食品添加剂的安全评价和检测其对生物体诱变效应的遗传毒理性试验却未见报道。NaNO2对蚕豆根尖的微核效应，由此证明蚕豆可以作为快速、灵敏检测食品中亚硝酸盐遗传毒性的供试材料。
三、实验材料
蚕豆种子、显微镜、载玻片、盖玻片、培养皿、滤纸、
NaNO 2 蒸馏水
卡纳氏固定液（3甲醇：1冰醋酸）
改良苯酚品红溶液
四、实验过程
1、被测试剂的配制与分组
用蒸馏水将NaN02配制成0．01、0．02、0．04、0．08 mmol/L 4种不同的浓度；
另设蒸馏水做对照(CK)组。另设蒸馏水做对照(CK)组。最后对应分成5组。 2 、浸种、催芽
选取籽粒饱满、大小一致的蚕豆种子洗净后，放入盛有蒸馏水的烧杯中，25℃下浸泡24 h 期间换水2次。待种子吸胀后，用纱布包裹置于培养皿中，在25℃恒 温生化培养箱中催芽24 h，至初生根长至2 cm左右。
3、染毒
选取发育良好，大小与根近似的蚕豆幼苗，将幼苗分别放入盛有不同浓度NaNO3和不同浓度NAN02溶液的培养皿中，染毒6 h 。然后用蒸馏水清洗根尖3～5次，换人新鲜蒸馏水培养24 h。同时用蒸馏水设立空白对照组。
4、 根尖细胞固定
切取根尖1 cm，用新配的卡诺氏固定液(甲醇：冰醋酸=3：1) 固定24 h，固定材料可经95％酒精和70％酒精各处理0．5 h，然后放入70％酒精中，在4℃冰箱中保存(保存时间不超过2个月) 。
5、 解离
从固定液中取出蚕豆根尖，用蒸馏水漂洗，再放到0．10 mol ／L HC1中，在60℃ 水浴中处理15 min，再用45％的醋酸处理10 min，使根尖软化。
6、 染色和压片
取处理好的根尖用蒸馏水漂洗后，置于载玻片上，用吸水纸吸去多余的液体，用
刀片将根尖的分生组织切下并切碎，加1～2滴改良的苯酚一碱性品红染色20 min ，采用十字压片法制片。
7、镜检及微核识别标准
常规制片后，将玻片标本放在显微镜的低倍镜下观察，找到分生组织区细胞分散良好、核膨大、分裂相多的部分转到高倍镜下进行观察。
微核识别标准：
（1）在主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。
（2）小核着色与主核相当或稍浅。
（3）小核形态为圆形、椭圆形或不规则型。
每一处理观察3个根尖，每个根尖计数1000个细胞中的微核数并进行记录。
五、实验数据的统计处理和污染程度划分
将实验数据按一下步骤进行统计学分析处理：
1．计算各测试样品（包括对照组）微核千分率（MCN‰）
如果对照本底MCN‰为10‰以下，可采用如下标准进行分析以确定样品的污染程度：
MCN‰在10‰以下，表示基本没有污染；
MCN‰在10‰－18‰区间，则表示有轻度污染；
MC N‰大于30‰，表示有重度污染；
2. 也可以计算各测试样品（包括对照组）污染指数
污染指数PI=实测微核率/对照组微核率
PI
1.5
2
PI>3.5 中度污染
3．统计表格