植物降解组测序研究进展

广东农业科学2014年第3期

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植物降解组测序研究进展

朱柳村1，张莹2

（1. 上海大学系统生物技术研究所，上海200444；2. 扬州泊瑞生物农业开发有限公司，江苏扬州225200）摘

要:微小RNA （miRNA ）的靶标研究是近年来植物学研究的热点之一。降解组测序（Degradome Sequencing ）

是一种研究miRNA 靶标的新型高通量测序技术，其主要通过对miRNA 所结合并降解的信使RNA （mRNA ）产物进行高通量测序，再用生物信息学方法确定miRNA 的靶标mRNA 。目前该测序技术已广泛应用于植物发育过程以及不同胁迫条件处理下的调控研究。综述了降解组测序技术的原理、相关的分析软件及其在植物miRNA 靶标研究工作中的进展，以期为深入研究植物基因调控机制提供有利的条件。

关键词：降解组测序技术；微小RNA ；高通量测序；信使RNA ；靶标中图分类号：Q789

文献标识码：A

文章编号：1004-874X （2014）03-0165－05

Research progress of degradome sequencing method for plants

ZHU Liu-cun 1，ZHANG Ying 2

(1.Institute of System Biology, Shanghai University, Shanghai 200444, China ;

2. Yangzhou Breeding Biological Agriculture Technology Co. Ltd, Yangzhou 225200, China )

Abstract :miRNA target identification has been one of the study hotspots in plants. Recently, a high -throughput technique known as degradome sequencing has made it possible to sequence mRNA cleavage products on a large-scale. Computational methods now exist to use these data to find targets of conserved and newly identified miRNAs. This technology has been applied to study the regulation modes of miRNAs on their target genes during plant growth, development and environmental stress responses. In this paper, the protocols, analysis tools and application examples of degradome sequencing in plants were reviewed to provide useful knowledge background for studying gene regulation network.

Key words :degradome sequencing method; miRNA; high-throughput sequencing; mRNA; target

微小RNA （miRNA ）是动植物小RNA （sRNA ）中分布最丰富的一种。1994年，这种内源性小RNA 在线虫中首次被发现[1]，接着在植物[2]和病毒[3]中也被发现。

作用，包括植物代谢[7]、生长[8]、发育[9]以及生物胁迫[10]或非生物胁迫[11]下的抗逆性活动。miRNA 的靶标研究对于探讨植物基因的调控机制有着重要意义，是近年来的研究热点之一。降解组测序技术是近期用于研究

miRNA 长度通常为18~25个核苷酸，是一组非编码的小RNA ，它们主要通过与靶基因的3＇非翻译区域（3＇UTR ）

结合，在转录后水平抑制蛋白质的生成或者直接降解靶标信使RNA （mRNA ）[4]。植物中的miRNA 基因首先转录成miRNA 初级转录物，然后经过核酸酶带帽类似蛋白（Dicer ）的加工变成具有茎环结构的miRNA 前体。最终，这些miRNA 前体从细胞核中释放出来，被剪切成miRNA ，miRNA 双链复合体进入细胞质中[5]。成熟的

miRNA 与靶标相互作用关系的实验技术，具有高通量、

高效率、低成本的特点。本文综述了降解组测序技术的原理、相关的分析软件以及其在植物miRNA 靶标研究工作中的进展，以期为深入研究植物基因调控机制、构建植物调控网络提供研究平台。

1.1

降解组测序原理

降解组测序技术原理

降解组测序技术，又称为大规模平行末端分析

miRNA 与RNA 诱导的沉默复合体(RISC)结合，这个复合体RISC 靶向特定的mRNA ，即成熟的miRNA 与mRNA 上的互补位点相结合，通过碱基配对调控目标基因的表达[6]。miRNA 在植物中的多种活动中起到调节

收稿日期：2013-11-19

基金项目：上海市自然科学基金青年项目（12ZR1444200）作者简介：朱柳村(1983-)，男，博士，讲师，E-mail ：zhuliucun

（parallel analysis of RNA ends ，PARE ），是一种新出现的实验方法，它结合了高通量测序技术与生物信息学分析各自的优势，对细胞或者组织中由miRNA 介导的降解mRNA 的剪切片段进行深度测序分析，准确高效地筛选出miRNA 的靶基因，为研究miRNA 以及其对应的靶基因的相互关系提供了有效的手段。其测序原

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理如下[12]：植物体内绝大多数miRNA 通过与mRNA 几近完全互补配对，进行剪切，负向调控靶基因mRNA 的表达。剪切通常发生在miRNA 与mRNA 互补区域的第

2降解组测序结果的相关分析软件

到目前为止，通过分析降解组测序数据来鉴定植

10位核苷酸上。靶基因经剪切产生2个片段（5＇剪切片段和3＇剪切片段）。其中3＇剪切片段，包含有自由的5＇单磷酸和3＇polyA 尾巴，可被RNA 连接酶连接和磁珠富集，连接产物可用于下游高通量测序。而5＇剪切片段由于具有5＇帽子端或者缺少单磷酸而不能与RNA 连接酶连接，进而不能被高通量测序。对3＇降解片段的5＇

端文库测序后产生的数据进行比对分析，可以得到

物中miRNA 与靶标的相互作用关系的在线或本地软件有数个，如CleaveLand 、starBase 、SeqTar 、SoMART 和

PAREsnip 等。下面我们按照软件被报道的先后顺序进

行介绍。

2.1CleaveLand 预测软件

mRNA 序列的miRNA 剪切位点出现的降解片段峰。因

此，降解组测序技术结合生物信息学分析可以用来鉴定miRNA 的靶基因。

1.2降解组测序流程

图1显示了降解组测序技术的实验路线：mRNA

被miRNA 剪切后，3＇剪切片段通过RNA 连接酶与5＇

RNA 接头连接，并与富含poly （dT ）的序列结合后被反转录。对反转录后获得的cDNA 进行扩增，扩增产物随后被IIS 限制性内切酶MmeI 酶切，酶切识别位点位于5＇接头序列中，酶切位点位于识别位点下游20个核苷酸处。酶切后凸出端与3＇接头序列连接，作为模板，进

行高通量测序。测序后，通过生物信息学方法确定

CleaveLand 是首个专门用于分析降解组测序数据的软件，在很多物种中都成功地鉴定了miRNA 的靶标基因[13]。此软件是用C 语言编写的，其设计原理如下：如果小RNA （sRNA ）介导的分裂导致出现一个开帽的mRNA ，那么这个mRNA 的5＇端一定存在一段10bp 长的与sRNA 互补的核酸序列。这是因为由包含名为Argonaute （缩写为AGO ）蛋白复合物介导的分裂发生在互补区域的第10、11位核酸序列上。因此，将已开帽的mRNA 5＇端序列与对应的转录组序列比对，即可确定

完整的候选互补序列。将这些序列及其延伸部分与

miRNA 的靶标mRNA 。

sRNA 数据库比对，便可确认sRNA 的裂解靶标。然而，该软件的运行速度并不是很快，假定1个sRNA 的单一查询有10次随机，那么在内核为3.0GHz 和4GB RAM 的Linux 系统上处理1百万条降解组数据时的运行时间通常是1h

。

图1大规模平行末端文库构建流程

2.2

sRNA 靶标数据库

DegradomeSearch 是StarBase (sRNAtarget Base) 数据库提供的一款程序。StarBase 是一个具有基因注释和查找miRNA 与靶标相互作用关系功能的综合型数据库，包含了来自人类、小鼠、线虫、拟南芥、水稻和葡萄6个动植物的芯片数据和降解组测序数据[14]。StarBase 数据库中植物miRNA 与靶标的相互作用关系的鉴定主要仍然是依靠CleaveLand 软件完成。他们首先应用了CleaveLand 软件分析降解组序列，临界值小于7.0的结果直接被保留；临界值大于7.0的降解组序列，则再用数据库中自带的“DegradomeSearch ”程序进行处理后得到miRNA-靶标对。2.3

SeqTar 预测软件

SeqTar (SEQuencing-based sRNA TARget prediction) 是CleaveLand 的增强版[15]。由于CleaveLand 的算法限制了miRNA 与靶标间的错配数目，并且严格执行不允许在断裂部位，即mRNA5＇端第10、11位的互补序列上，存在错配或者G::U摇摆配对。但

是，研究表明，与靶标相互作用的断裂位点处存在错配。因此，为了减少鉴定结果中的假阳性并尽可能查找出更多的miRNA 与靶标的相互作用关系，SeqTar 方法引用了两个P 值（P m 和P v ），作为控制预测质量的标准。其中，P m 是指在sRNA 与靶标的互补序列中存在的错配位点数目，与打乱sRNA 序列后随机选取的靶标序列之间互补配对条件下的错配数目的关系；P v 是指sRNA 互补序列中心位置，即miRNA5＇端第10~11位核苷酸区域，匹配到的阅读序列数目的比例。通过这样的标准，SeqTar 可以找到更多的靶标。

2.4SoMART 预测软件

SoMART 是一个针对miRNA 和反式小干扰RNA （tasiRNA ）的在线处理软件，包括分析资源和工具[16]。这个在线处理软件包括了4种工具：切片探测工具（Slicer detector ），用于从输入基因中检测sRNA ；降解RNA 的定位工具（dRNA mapper ）用于检测已降解RNA 的产物；RNA 前体探测工具（PreMIR detector ），用于鉴定miRNA 或tasiRNA 的前体；sRNA 定位工具（sRNA mapper ），用于定位sRNA 。服务器中的4种数据库分别是sRNA 数据库（sRNA databases ），已过滤的sRNA 数据库［filtered sRNA （fRNA ）databases ］，降解RNA 的数据库［degradome RNA （dRNA ）databases ］和来自3个茄科（烟草、土豆和马铃薯）的DNA 数据库。其中，切片探测工具和已过滤的sRNA 数据库用于预测sRNA ，降解RNA 定位工具和降解RNA 数据库用于证实sRNA 与

靶标的相互作用关系。

167

2.5

PAREsnip 预测软件

PAREsnip 是根据高通量测序和降解组测序数据来寻找sRNA 靶标基因的工具[17]。此工具的运行流程主

要包括载入数据、数据过滤、裂解信号的定位、数据结构的建立、搜索、P 值计算、结果输出等7个部分。其中，裂解信号的定位规则与CleaveLand 相同采样5大分类系统，而其他几部分如数据结构的建立、搜索等部分都是该软件独有的，分别采用4通路树和依据规则性互补搜索算法。该软件可在Windows 、Linux 和Mac Os 等多种操作系统下运行，有命令行和可视化界面两种使用方式。

总结上述5款分析miRNA 与靶标相互关系的工具，可以看出，CleaveLand 是首个专门用于分析降解组测序数据的软件，但由于CleaveLand 中的算法、sRNA 的大小和庞大的降解组测序数据库（通常是数百万条序列）等因素，如果不使用大型计算机并行计算，很难在有效的时间内找出所有sRNA 与靶标基因的相互作用关系。因此，这个软件通常用来找寻少量sRNA 的裂解靶标，比如鉴定已知的miRNA 或者候选miRNA 的相互作用靶标。这意味着使用者在进行分析时通常会忽略数量巨大、种类繁多的其他sRNA 。另外，人们通常忽略很多sRNA 介导的非常规模式下的mRNA 裂解。如果研究者的目的是鉴定已知miRNA 的靶标基因，使用此软件可以很好的完成此任务。但如果目的是鉴定所有sRNA 的靶标基因则不适合应用此软件。此外，

CleaveLand 是一个只能应用于Linux/UNIX系统上、使用命令行操作的软件。这样导致大量没有Linux/UNIX系统或者没有使用过Linux/UNIX系统的研究者不能使用此软件。SeqTar 是CleaveLand 的改良版，将CleaveLand 查找sRNA 与靶标相互作用时互补配对出现错配的限定条件放宽，找出比CleaveLand 更多的sRNA 裂解靶标。但是这个软件仍然没有解决有效时间有限机器性能下获得所有可能的sRNA 与靶标基因相

互作用关系的问题，并且此软件不是免费使用。

SoMART 是一个在线处理sRNA 的软件。使用者首先需要应用切片探测工具预测sRNA 可能会靶向一个使用者提供的转录本。接着，使用dRNA 定位工具将降解组

测序序列与转录组序列比对。然后，使用者需要通过人工的比较切片探测工具和dRNA 定位工具的输出结果，来寻找靶标。为了自动处理多个转录本数据，使用者不得不开发其他的方法和后期处理软件。此外，SoMART 网站限定了sRNA 列表和降解组数据库，对不属于此范围的降解组数据难以进行处理。从严格意义上来讲，DegradomeSearch 作为StarBase 内置的一个程序仅仅是用来筛选CleaveLand 程序的结果，并不是一个专门鉴定miRNA 与靶标相互作用关系的工具。其在

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进行鉴定miRNA 的裂解目标位点的主要任务仍然是由CleaveLand 完成的，因此，DegradomeSearch 只能作为一个辅助程序使用。PAREsnip 是一个可在多种操作系统环境中运行、使用界面友好的软件，速度快、效率高。因为在相似的计算任务下，运行时间远远短于

CleaveLand ，且结果相似, 还可按照使用者的需求调整限定条件。当使用与SeqTar 类似的限定条件时，所得结

果也是相近的，所以该软件是目前较好的选择。

3降解组测序技术在植物研究中的应用

降解组测序的应用，主要在于确认上游miRNA 的

剪切基因，进而得知下游响应基因的通径。即由miRNA 芯片或利用深度测序发掘新的miRNA ，并获得miRNA 表达量差异，再从降解组测序结果确认miRNA 剪切哪些基因，进一步通过芯片或测序分析下游基因的表达量差异，结合生物信息基因本体论分析（Gene

Ontology ，GO) 、通路（Pathway ）分析与外表性状，将植物miRNA 的调控机制由上而下进行整体性分析。目前，

这套方法被广泛应用于植物中发育过程以及抗逆性的调控研究。

截至2013年10月，已有20多种植物单个或多个个体应用了降解组测序研究，这些研究包括了多数模式植物和大量的非模式植物，比如水稻、大豆、棉花、玉米、掌叶半夏、葡萄、萝卜、草莓、地黄、龙眼、杨树、西红柿、胡杨、小麦、芥菜、野生大豆、野生水稻、油菜、蝴蝶兰、大麦、紫衫、苹果、黄瓜、拟南芥、苜蓿、苔藓等

[18-40]

。

通过应用降解组测序方法，研究者不仅在多种植物中鉴定出miRNA 调控的靶标基因，还深入研究了miRNA 及其靶标基因在不同生长发育过程中（表1）以及植物在不同胁迫处理等条件下（表2）的差异表达情况。

表1降解组测序用于植物生长发育过程的研究

物种

生长发育阶段参考文献

草莓Fragaria x ananassa

果实衰老过程

[18]

大豆Glycine max 果实发育[19]地黄Rehmannia glutinosa 移植[20]龙眼Dimocarpus longan 胚胎发育[21]棉花Gossypium hirsutum 体胚发育[22]葡萄Grapevines 开花结果[23]水稻Oryza sativa

根部发育、生长繁殖[24-25]西红柿Solanum lycopersicum 果实生产成熟[26]野生水稻Zizania

驯化[27]

4展望

迄今为止，降解组测序技术已经成为研究植物中

miRNA 与其调控靶标相互作用关系以及进一步研究不

表2降解组测序用于植物抗逆性研究的汇总

物种

胁迫条件

参考文献

大豆

Glycine max

磷处理[28]

大麦Hordeum vulgare L. 干旱[29]胡杨Populus euphratica 干旱、盐碱[11,30]萝卜Raphanus sativus L. 钙处理[31]苜蓿Medicago truncatula 汞处理[32]小麦Triticum aestivum 柄锈菌处理、寒冷[33－34]烟草Nicotiana tabacum 受伤[35]杨树Populus trichocarpa

干旱[36]野生大豆Glycine soja

铝处理[37]油菜Brassica napus 钙处理[38]玉米Zea mays 缺水、低氮[39-40]

同生长发育时期、不同胁迫处理等过程中的调节通路、构建调控网络的一种全新而有效的方法，在未来将依然是研究的热点。相信随着越来越多的高通量测序研究技术的应用和研究的深入开展，各种植物的遗传背景知识会越来越丰富，将为深入研究植物基因功能、培育优良植物品种提供坚实的基础。

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（下转第174页）

174

月细根生物量一直在增加，封育5年的细根生长季是最短的，说明封育年限的增加对细根的生长时间是有提升作用的。4个封育年限林分细根生物量的峰值大致出现在春季（3月或4月）和秋季（9月、10月或11月），这与杨玉盛等[16,18]和梅莉等[19]部分研究不尽相同，这与研究地概况和树种特性有关。从细根生物量来看，封育

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5年的林分是最好的，封育10年、20年、30年的林分细

根生物量没有差异。开始封育后，细根生物量会有一个增长趋势，随着年限的增加细根生物量会降低，随着生物多样性的增加和枯枝落叶层的分解，细根生物量会在一定范围内上下浮动，试验数据显示这一范围是

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好，还要考虑地上生物量和养分含量。因此，对于复合经营应因地制宜，并非时间越久复合效益越好。

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（责任编辑张辉玲）

軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇軇

（上接第169页）

drought -responsive

and

novel

Populus

trichocarpa

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and

analysis

microRNA

responding

long -term

waterlogging in crown roots of maize seedlings [J].Physiol Plant, 2013, 147(2):181-193.

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maize

miRNAs

involved

responses

nitrogen

deficiency[J].PLoS One, 2012, 7(1):e29669.

（责任编辑崔建勋）

广东农业科学2014年第3期

165

植物降解组测序研究进展

朱柳村1，张莹2

（1. 上海大学系统生物技术研究所，上海200444；2. 扬州泊瑞生物农业开发有限公司，江苏扬州225200）摘

要:微小RNA （miRNA ）的靶标研究是近年来植物学研究的热点之一。降解组测序（Degradome Sequencing ）

关键词：降解组测序技术；微小RNA ；高通量测序；信使RNA ；靶标中图分类号：Q789

文献标识码：A

文章编号：1004-874X （2014）03-0165－05

Research progress of degradome sequencing method for plants

ZHU Liu-cun 1，ZHANG Ying 2

(1.Institute of System Biology, Shanghai University, Shanghai 200444, China ;

2. Yangzhou Breeding Biological Agriculture Technology Co. Ltd, Yangzhou 225200, China )

Key words :degradome sequencing method; miRNA; high-throughput sequencing; mRNA; target

微小RNA （miRNA ）是动植物小RNA （sRNA ）中分布最丰富的一种。1994年，这种内源性小RNA 在线虫中首次被发现[1]，接着在植物[2]和病毒[3]中也被发现。

miRNA 长度通常为18~25个核苷酸，是一组非编码的小RNA ，它们主要通过与靶基因的3＇非翻译区域（3＇UTR ）

miRNA 与靶标相互作用关系的实验技术，具有高通量、

1.1

降解组测序原理

降解组测序技术原理

降解组测序技术，又称为大规模平行末端分析

收稿日期：2013-11-19

基金项目：上海市自然科学基金青年项目（12ZR1444200）作者简介：朱柳村(1983-)，男，博士，讲师，E-mail ：zhuliucun

@gmail.com

166

理如下[12]：植物体内绝大多数miRNA 通过与mRNA 几近完全互补配对，进行剪切，负向调控靶基因mRNA 的表达。剪切通常发生在miRNA 与mRNA 互补区域的第

2降解组测序结果的相关分析软件

到目前为止，通过分析降解组测序数据来鉴定植

端文库测序后产生的数据进行比对分析，可以得到

物中miRNA 与靶标的相互作用关系的在线或本地软件有数个，如CleaveLand 、starBase 、SeqTar 、SoMART 和

PAREsnip 等。下面我们按照软件被报道的先后顺序进

行介绍。

2.1CleaveLand 预测软件

mRNA 序列的miRNA 剪切位点出现的降解片段峰。因

此，降解组测序技术结合生物信息学分析可以用来鉴定miRNA 的靶基因。

1.2降解组测序流程

图1显示了降解组测序技术的实验路线：mRNA

被miRNA 剪切后，3＇剪切片段通过RNA 连接酶与5＇

行高通量测序。测序后，通过生物信息学方法确定

完整的候选互补序列。将这些序列及其延伸部分与

miRNA 的靶标mRNA 。

。

图1大规模平行末端文库构建流程

2.2

sRNA 靶标数据库

SeqTar 预测软件

2.4SoMART 预测软件

靶标的相互作用关系。

167

2.5

PAREsnip 预测软件

PAREsnip 是根据高通量测序和降解组测序数据来寻找sRNA 靶标基因的工具[17]。此工具的运行流程主

互作用关系的问题，并且此软件不是免费使用。

SoMART 是一个在线处理sRNA 的软件。使用者首先需要应用切片探测工具预测sRNA 可能会靶向一个使用者提供的转录本。接着，使用dRNA 定位工具将降解组

168

CleaveLand ，且结果相似, 还可按照使用者的需求调整限定条件。当使用与SeqTar 类似的限定条件时，所得结

果也是相近的，所以该软件是目前较好的选择。

3降解组测序技术在植物研究中的应用

降解组测序的应用，主要在于确认上游miRNA 的

Ontology ，GO) 、通路（Pathway ）分析与外表性状，将植物miRNA 的调控机制由上而下进行整体性分析。目前，

这套方法被广泛应用于植物中发育过程以及抗逆性的调控研究。

[18-40]

。

表1降解组测序用于植物生长发育过程的研究

物种

生长发育阶段参考文献

草莓Fragaria x ananassa

果实衰老过程

[18]

根部发育、生长繁殖[24-25]西红柿Solanum lycopersicum 果实生产成熟[26]野生水稻Zizania

驯化[27]

4展望

迄今为止，降解组测序技术已经成为研究植物中

miRNA 与其调控靶标相互作用关系以及进一步研究不

表2降解组测序用于植物抗逆性研究的汇总

物种

胁迫条件

参考文献

大豆

Glycine max

磷处理[28]

干旱[36]野生大豆Glycine soja

铝处理[37]油菜Brassica napus 钙处理[38]玉米Zea mays 缺水、低氮[39-40]

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and

conserved

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（上接第169页）

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