转基因技术及其在棉花育种中的应用
(孙金霞 S090971 民族生态学 中央民族大学)
摘要：：棉花是一种重要的经济作物，在我国广泛种植。培育转基因棉花被看作是解决产量和生态环境问题最根本和最有效的方式。本文介绍了转基因棉花主要的研究方法，包括转化方法以及转入的基因等，并对转基因棉花的发展趋势作了相关探索。此外，本文总结了转基因技术在棉花遗传改良中的应用，包括棉花抗病、抗虫、抗除草荆、抗逆以及品质改良等方面的最新进展，并对棉花转基因研究中存在的主要问题和今后的研究与应用前景进行分析和展望。
Cotton Transgene Technology and Application of Genetic
Transformation in Cotton Breeding
Abstrast：Cotton is one of important industrial crops，and is widely planted in China．The cultivation of transgenic cotton is considered the most efficient way of increasing yield and resolving environmental problems．We introduced three dominant approaches in the development of genetic cotton and somee useful target genes，and forecast its probable future work．In addition, Transgenie cotton researehes for improving insect resistance，herbicide resistance，disease resistance，stress tolerance and fiber quality modification are presented． Meanwhile，an assessment of performance of transgenic cotton and its potential in cotton genetic transformation are prospected．
Key words：transgene；cotton；genetic transformation；cotton breeding
1973 年美国科学家科恩等人第一次将两种不同的DNA 分子进行体外重组, 并且在大肠杆菌中表达以来, 基因工程技术发展飞速, 该技术正在极大地改变着地球生物固有的进化进程。据不完全统计, 目前全球已有60 多种转基因园艺植物和大田作物相继问世, 其中转基因工程技术在棉花品种改良中的应用, 成效卓著。
自从1983年. 年人类首次获得转基因烟草、马铃薯以来，植物重组DNA技术在基础研究和应用开发中获得了显著进展，培育成功一批具有抗虫、抗病、耐除草剂和高产优质等外源优异性状的农作物新品种，对农业的生产方式和经济效益产生了深刻影响。棉花是利用转基因技术进行遗传改良最为成功的作物之一，仅我国自主研制的,CryA+CPTI 双价抗虫等基因就已被转育到41个棉花品种中。美国转基因抗虫棉大田种植已超过其棉田总面积的70%，澳大利亚和中国超过30%，全球转基因棉花种植面积达到680万公顷，占世界棉花种植面积的20%。
1.转基因技术
棉花转基因技术是指将外源DNA通过物理、化学或生物学方法导入棉花细胞并得到整合
和表达的过程。在棉花遗传转化体系中，主要有农杆菌介导、花粉管通道和基因枪3种转化方法。本研究拟对. 种方法的主要技术特点及研究和应用动态进行综述，旨为棉花分子育种提供参考。
1.1．农杆菌介导法
1.1.1农杆菌转化技术的理论基础
与棉花遗传转化有关的根癌农杆菌是一种土壤习居菌，在自然状态下能感染棉花等大多数双子叶植物营养器官的伤口，导致冠瘿瘤的发生。根癌农杆菌含有一种Ti质粒，侵染时通过棉花器官的伤口进入寄主组织，但其本身不进入寄主植物细胞，只把Ti质粒的T-DNA片断导入棉花的基因组中并得以表达，且外源DNA表达通常表现出典型的孟德尔遗传规律。由于Ti质粒本身能插入大到50kb的外源DNA，因此利用此转化载体，将Ti质粒上致瘤基因切除，代之以有益的外源DNA序列，并插入由真核型启动子和细菌抗生素抗性选择标记基因或报告基因组成的嵌合基因，将改造后的农杆菌侵染棉花器官或细胞，在加有相应选择因子的培养基上选择转化再生植株，进而可得到转基因植株。
1.1.2目前的研究热点及应用概况
目前，利用农杆菌进行棉花遗传转化的研究主要集中在基因的高效启动和表达，农杆菌遗传转化体系的改进和优化，即优化遗传转化的体细胞再生体系，缩短转基因植株的再生周期，通过调整培养基成分、固化剂浓度及激素水平等，改善体胚成熟、分化、生长的条件，减少畸形苗、变异系的发生。此外，还有采用嫁接或过渡培养等措施提高转基因植株移栽成活率，发展转基因棉花快速测定法，改进转化条件，提高转化效率等等。
1984 年首次报道了通过农杆菌介导，用“ 叶盘法”将抗卡那霉素基因导入棉花，1987 年等人将NPTⅡ和CAT基因导入珂字312，获得转基因再生棉株［1］。在国内，1994年陈志贤等将tfdA抗除草剂基因导入晋棉7号。目前，国内外利用农杆菌介导法已将Bt,CpTI,API等抗虫基因，tfdA,Bxn,aroA等抗除草剂及抗黄萎病、立枯病等许多有价值的目的基因导入棉花，并获得了转基因植株，且获得的部分转基因棉花已进入大田，进行商业化生产。
1.2.花粉管通道法
1.2.1花粉管通道转化技术的理论基础
20世纪70年代末，我国学者在远缘杂交研究中发现，授粉时混入异种作物花粉匀浆，其杂种后代出现了与异种作物相应的性状变异，推测外源DNA可能参与了受精过程。周光宇等结合我国远缘杂交的成功经验，提出了远缘杂交中存在DNA片段杂交的假设［2］，其主要内容是，授粉后外源DNA能沿着花粉管经过的珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞从而参与到新形成的种子中。由于这些细胞不具备正常的细胞壁，可作为天然的原生质体，易于DNA转化，受精后细胞DNA复制活跃，易于外源DNA的整合。
从整体上说，远缘亲本间的染色体结构是不亲和的。但从进化的角度来看，任何生物DNA均由4种核苷酸组成，这样就可能在顺序上出现不同程度的相同排列，因此部分基因的
结构有可能保持一定的亲合性。虽然进化中同时存在着相当强的保守性，但生物的主要基础代谢，如糖、氨基酸、能量代谢、蛋白质和核酸的生物合成与分解等都是共有的（如有90% 以上的已知酶在各种生物中都是共有的）。当外源花粉的基因组进入母体（ 受体）后，大部分片段被分解，侥幸保存下来的某些DNA 片段有可能整合进入受体的染色体，在子代中表达典型的或更多是非典型的遗传变异。外源DNA片段进入受体，整合是随机的，可能整合到结构基因中，也可能通过调控基因或重复序列以调控方式发挥作用
1.2.2花粉管通道法转化的棉花植株后代传特点
性状变异广泛，类型丰富，稳定快，变异频率较高。研究表明，由外源DNA 直接导入所引起的性状变异，涉及棉花的各类质量和数量性状，包括植株形态、生长发育、生理生化、抗性、产量构成等各个方面，一般变异性状在D3或D4代就能够稳定，大大缩短了育种进程。同时，总DNA导入引起的变异在表型、生理生化产物及DNA分子标记的3个层次上与常规育种产生的变异极为相似。通常转化率为1%-10%。遗传较为复杂。有些变异既不是供体性状也不是受体原有性状，后代的分离现象，有的符合孟德尔规律，但大多数是不符和的。王关林等［3］认为，裸露的外源DNA直接导入受体细胞，在转化过程中进入受体细胞的外源DNA拷贝数较多，整合到植物细胞基因组的拷贝数和整合位点也较多，外源DNA的结构变化复杂，在受体细胞中的遗传稳定性较差，但已经整合到植物基因组的外源DNA 一般都能稳定遗传，只是遗传规律性较差。在转化后代中还存在外源基因不表达现象等。
1.2.3在棉花上的研究现状及应用
利用花粉管通道法实现棉花遗传转化是外源DNA直接导入植物体成功的例子之一。龚蓁蓁等［4］利用3H 标记的棉花总DNA 于授粉24h 后导入棉花子房，分时段取样，冷冻切片，经放射自显影，看到授粉后珠心与珠孔已相通，珠心孔道是相当宽的，易于DNA溶液进入80% 检视的胚囊中有DNA浸润。在进入胚囊的途径中，自显斑点主要集中显现在珠心孔道内，即花粉管通道，在花粉管通道以外的珠心组织无标记显示，表明授粉后形成的花粉管通道是外源DNA进入胚囊的天然的唯一途径。邓德旺［5］等报道了采用激光共聚焦显微技术等细胞 生物学方法评价花粉管通道转基因的技术原理。
花粉管通道转基因技术首先由我国科学家提出并在许多作物遗传转化中取得了成功，由于这一工作在初期阶段是以总DNA为外源基因供体，虽能引起后代发生变异，但对外源DNA 进入胚囊、卵细胞或受精卵导致核基因组或细胞质基因组的行为及整合机理，以及引起特定而广泛变异的机制和转化后的表达与调节等问题缺乏理论上的确切认识，致使国内外一些学者对其可靠性提出了质疑。目前，虽然已取得了后代转化的分子证据，但仍有许多问题需要进一步的探讨，例如外源DNA的整合机理、转化后代的基因沉默、拷贝数量对表达水平的影响以及外源基因的表达检测等。
在应用方面，1981年黄骏麒等应用花粉管通道法成功地将抗病基因导入到高产、优质、感病的棉花品种中，获得耐黄萎病、抗枯萎病的棉花3118新品种。谢道昕等通过花粉管途径将苏云金芽孢杆菌杀虫基因（Bt 基因）导入棉花，获得了转基因抗虫棉，并首次获得转基
因的分子证据。之后，我国学者通过此方法陆续将Bt, Bt+CpTI,sGNA等基因导入中国主栽棉花品种中，目前已育成许多转基因品种(系）。通过PCR，Southern，Western Blot等试验手段提供了花粉管导入法导入的外源DNA 整合到棉花基因组，并表达相应性状的确凿的分子证据，结合田间直接生物学鉴定，充分证明此方法是一个天然有效的转基因途径。该技术的建立开创了整株植物活体基因转化的新途径，经过多年来不断的研究和改进，该技术日趋成熟，在我国棉花转基因育种研究中发挥着重要作用。
1.3基因枪法
1.3.1 基因枪转化技术的理论基础
基因枪法（Particle gun），又称微弹轰击法，是依赖高速度的金属微粒将外源基因引入活细胞的一种转化技术。其基本原理是将外源DNA 包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压作用下将微粒高速射入受体组织或细胞，微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物基因组上，并得到表达，从而实现基因的转化。因为微粒的体积非常小，且射击速度很快，所以外源基因进入细胞后仍能保持正常生物活性，被轰击过的细胞或组织，虽含有颗粒，但仍能存活，发育不受太大的影响。美国Cornell 大学的John Sanford等［6］于1987年研制出火药引爆（gunpower）的基因枪。根据基因枪的动力系统，可将它们分为3种类型：1类是以火药爆炸力为加速动力，也是最早出现的一种基因枪。其粒子速度主要是通过火药的数量及速度调节器控制；第2类是以高压气体作为动力，如以氦气、氢气、氮气等；第3类是以高压放电为驱动力，其最大优点是可以无级调速，通过变化工作电压，粒子速度和射入浓度可准确控制。据现有文献报道，高压放电和高压气体轰击的转化率均高于火药引爆法。
1.3.2 研究进展和应用
基因枪转化技术在棉花遗传转化中尚处于研究和起步阶段。John［7］等第一次将此技术应用于棉花遗传转化中，以胚性悬浮细胞系为受体进行轰击，成功得到转化植株；之后，McCabe［8］等以茎尖分生组织为受体、郝秀英等［9］以棉花下胚轴为受体、Rajasekaran［10］等用胚性细胞悬浮系为受体均获得了抗性转化植株。谢迎秋［11］对叶肉细胞进行轰击研究棉花曲叶病毒反式作用因子Ac2的功能等。到目前，使用基因枪进行棉花的遗传转化不过十几年的时间，还有许多问题需要进一步研究。棉花基因枪转化效率一般为0.001%-0.01%，因此，如何提高转化率是有待解决的核心问题，国内外的研究主要围绕转化前受体材料类型、渗透处理、多茎尖诱导及劈开分生组织暴露出敏感层等，研究和提高外植体的接受能力及外植体的数量，同时研究轰击后细胞的恢复调整和梯度筛选强度等，以提高植株再生效率，优化转化技术体系，进而提高基因枪转化率。
1.4其他方法
获得转基因棉花的方法还有很多，例如PEG介导法、脂质体介导法、超声波介导法、电激法、注射法、浸泡法等。
2. 转基因棉花育种成就
2.1 抗虫基因工程
目前应用于棉花的抗虫基因主要有苏云金芽孢杆菌的内毒素蛋白(Bt基因)、从植物中分离的 昆虫蛋白酶抑制剂(PI基因)和植物凝集素基因(1ectin)。
2.1.1 转Bt抗虫棉
美国Agracetus 公司1987 年首次报道已获得外源标记基因的珂字312 遗传工程棉花, 不久该公司利用农杆菌Ti 质粒介导法在世界上首次将苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因转入商品棉。连续两年的室内和罩笼鉴定表明, 转基因棉花抗鳞翅目幼虫, 抗性特征稳定, 并可通过种子遗传。但大田抗棉铃虫试验效果不理想, 主要原因是转基因棉花中毒蛋白含量不够1990 年Monsanto 公司将改造的Bt 基因导入棉花, 参加大田试验的转基因材料中Bt 基因表达产物的含量提高了100 倍。1996年Monsanto 公司与岱字棉公司合作, 开展转Bt 基因抗虫棉的选育和品种的商业化工作, 并迅速将抗虫棉种子销售市场拓展到中国的河北、安徽、山东等省, 目前抗虫棉品种33B 占据中国抗虫性市场的半壁江山, 估计在黄河流域的推广面积已累计达13313 万hm2 。
Monsanto 公司最近又育成具有2 个Bt 基因的棉花新品系—BGII。田间试验表明新品系对棉铃虫,尺、甜菜夜蛾都有很好的抗性。另外, 澳大利亚、前苏联、法国也培育出抗虫棉品种。国内棉花抗虫基因工程起步较晚, 但发展迅速。中国农科院生物技术研究所、江苏省农科院经济所、山西省农科院棉花所、中国农科院棉花所等先后报道利用基因工程技术和常规育种手段相结合的方式, 获得了一系列转Bt 基因抗虫棉品系。目前已通过审定的国产转Bt 基因抗虫棉品种有: GK - 1、GK12、GK19、GK22、中38 、南抗3 号等。
2.1.2 转Bt + CPTI 双价抗虫棉
目前国内外转基因抗虫棉普遍存在抗虫性的遗传稳定性问题。转Bt基因单价抗虫棉只能产生一种杀虫蛋白, 主要对棉铃虫等鳞翅目害虫有抗性。但有关研究表明, 转单一Bt 杀虫基因抗虫棉种植若干年后, 棉铃虫有可能产生抗性。Bt 抗虫棉抗虫谱较窄, 抗虫范围局限性较大, Bt 抗虫棉主要只对鳞翅目中的一些害虫具有抗性。其次, Bt 抗虫棉的抗虫性表达具有时空性, 随着叶子的老化, 抗虫性下降。目前转Bt 基因抗虫棉品种的遗传基础比较薄弱, 一旦抗性崩溃, 其后果将是惨重的。与单价抗虫基因相比, 双价抗虫基因可成倍延长品种的抗性。据2001 年信息, 由中国农科院生物技术研究所构建Bt + CPTI 双价抗虫基因,利用花粉管通道法导入受体品种石远321 , 成功地培育出SGK321 双价基因抗虫棉, 并于1999 年6 月通过农业部生物基因安全性评价, 获准在4 个省份进行商品化生产SGK321 双价转基因抗虫棉同现有的单价抗虫棉相比, 最大的优点在于其具有更稳定持久的抗虫性。双价抗虫棉中的Bt 基因产生杀虫蛋白, 破坏棉铃虫的消化系统导致其死亡; 而CPTI 是一种广谱杀虫蛋白, 在杀虫机理上与Bt 蛋白不同, CPTI 基因产生胰蛋白酶抑制剂, 使棉铃 虫的蛋白酶失去活力, 不能消化食物中的蛋白质,得不到充足的营养, 导致发育不良, 最终死亡。通过两个抗虫基因的抗性互补和协同增效, 使得棉花不同部位的抗虫效果趋于均匀一致, 从而大大延缓或制止昆虫抗性的产生。一般单价抗虫棉可在生产上应用8～10 a , 而双价抗虫棉可在生产上应用20～30 a 。
另外, 把外源凝集素基因与CPTI 基因以及Bt杀虫基因结合, 构造三价转基因抗虫棉品种的遗传转化工作, 也正在进行之中。
2.1.3蛋白酶抑制剂基因的转化
蛋白酶抑制剂(PI)是自然界最为丰富的蛋白之一，是一种天然的杀虫物质，与B￡基因相比，由于其具有抗虫谱广，安全性高和害虫不易产生抗性等优点而广泛用于抗虫基因工程。目前应用于棉花的PI基因主要是豇豆胰蛋白酶抑制剂(Cp—Ti基因)和慈菇蛋白质酶抑制剂(API基因)。分别将CpTi基因和修饰过的CpTi基凼导人棉花，获褥的转基因植株后代对抗棉铃虫具有明显的抗性。API对多种蛋白酶具有抑制活性，其抗虫能力优于CpTi基因。Thomas等将API基因导入棉花，获得了表达API基因的抗虫棉，用转基因棉花叶片饲喂白粉虱能降低成虫的羽化率。转蛋白酶抑制剂基因棉花的获得，使棉花的抗虫范围和抗虫能力有了新的扩展。但由于PI基因往往需要大量表达才能产生明显的抗虫效果，因而转PI基因棉还没有在生产中得到推广和应用。
2.1.4 植物凝集素基因的转化
棉蚜是棉花的另一个主要害虫，随着抗棉铃虫转基因棉花的普遍种植，棉蚜的危害逐渐加重。因此，利用转基因技术获得抗蚜棉花品种已成为棉花抗虫育种的新课题。植物凝集素是一类具有特异糖结合的活性蛋白，有些具有抗虫性，特别是对蚜虫等同翅目害虫有极强的抗杀作用。将来源于小麦胚芽凝集素基因导人陆地棉后，转基因T。代能显著抑制棉铃幼虫和棉蚜的生长发育；而将Bt+GNA双价基因导人棉花后，获得的转基因株系对棉铃虫和棉蚜有较好的抑制效果[12]。菊芋凝集素基因对棉蚜也具有一定的抗性，用菊芋凝集素HTA基因和尾穗苋凝集素ACA基因转化棉花，获得的转化植株对蚜虫有明显抗性[13]。目前，国内外的研究者已开始这方面的工作，并获得了转基因植株[14]，可望在不久的将来培育出抗蚜棉花新品种。
2.2 抗除草剂棉花
棉田杂草种类繁多，给棉花生产造成严重干扰，而由于棉花不含抗除草剂基因。所以把外源抗除草剂基因转人棉花，使棉株对某种除草剂具有抗性，对棉花生产意义重大。棉花中成功应用的抗除草剂基因是：抗草甘膦(glyphosate)基因、抗溴苯腈(bromoxyril)基因和2，4一D单氧化酶基因(tfdA)。
2.2.1抗草甘膦基因的转化
草甘膦是目前应用最广泛的一种非选择性广谱除草剂，它特异性地抑制植物和细菌中草莽酸羟基乙烯转移酶(EPSPs)的活性。1989年，Deaton等[15]将编码异构EPSP草甘膦合成酶基因(aroA)转入棉花，选育出抗草甘膦除草剂的转基因棉花。经过连续三代的研究，发现该基因以单拷贝方式整合到棉花基因组中，且遵循盂德尔的遗传分离规律。随后，Monsanto公司的Nida等[16]也获得了抗草甘膦除草剂的转基因棉花。而Keller等[17]将来自链霉素茵属的Bar基因分别导人棉花品种后，获得了可抗高达15 g·kg-1除草剂的Basta@转基因株系。谢龙旭等[18]将抗草甘膦突变基因(aroAMl2)导人棉花品种，获得的转基因棉花对草甘膦具有较强的抗性。分子检测证实，aroAMl2基因整合到棉花基因组中并得到有效表达。
2.2.2转2,4一D单氧化酶基因
2，4一D是一种激素型除草剂，通过干扰植物细胞分裂的速率达到除草目的。2，4一D是一种非常稳定的化台物，但它能被微生物中的2，4一D单氧化酶(zfdA)所降解。棉花对2，4-D非常敏感，将微生物中分离出的tfdA基因转入棉花后，可大大提高棉花对2，4一D的抗性。目前，国内外均获得了一些抗2，4-D的棉花品系。1992年，Bay—ley等[19]首先把tfdA基因导人棉花中，获得了能稳定遗传并表达的转基因棒系。而Lyon等[20]将tfdA基因导入棉花中，获得的转基因T一代植株对2，4一D的抗性比对照增加了50～100倍。1994年，我国陈志贤等[21]将tfJA基因导人晋棉7号，抗性试验表明，转基因后代可耐0．08％以上2，4一D，超过一般大田使用浓度水平。估计不久的将来，可以获得抗2，4一D的棉花新品种或新种质。
2.2.3转澳苯腈水解酶基因
溴苯腈是除草剂Buctril的活性成分，通过抑制植物的光合作用中的电子传递发挥除草效能。抗溴苯腈的转基因棉是第一个在美国大面积种植的转基因作物。1989年，Fillatti等[22]将编码溴苯腈的水解酶基因BXN转人棉花中，田问试验表明转基因植株仍能正常生长。棉花对除草剂咪唑啉酮也非常敏感。Grula等[23]和Rajasekaran[24]等分别将乙酰羟酸合酶AHAs基因和膦丝菌素蛋白乙酰转移酶PAT基因导入陆地棉中，分子检测证实该基因已导人棉花基因组中并得到表达；抗性后代用平常使用5倍浓度的除草剂咪唑啉酮喷洒仍能正常生长。
抗除草剂棉花的选育成功并在生产上大面积应用，给棉花生产带来一场新的变革，育成一系列转抗除草荆基冈棉花新品种，并在牛产上大面积应用，可取得良好的生态和经济效益。
2.3抗病基因工程
棉花病害严重，尤其是黄萎病和枯萎病两种土传真菌性病害，根治非常困难，是棉花生产的主要障碍。目前，应用在棉花抗病基因丁程中的基因主要有几丁质酶(Chi)、6-1，3-葡聚糖酶(Glu)、葡萄糖氧化酶(GO)等外源抗病基因。
2.3.1几丁质酶基因和争1，3一葡聚糖酶基因
几丁质酶(Chi)和β-1，3一葡聚糖酶(GIu)是植物防御体系中的两种防卫因子，两者之问存在协同增效作用。为了提高棉花的抗枯黄萎病的能力，刘桂珍等[25]和程红梅等[26]先后将构建的Chi和Glu嵌合双价基因导人棉花，已选出对枯黄萎病抗性提高的转基因棉花株系。吴家和等[27]将维管束特异启动子启动的Chi和CaMV 35S启动的Glu嵌合基因导人陆地棉品种，获得3个高抗黄萎病的转基因纯合系。
2.3.2葡萄糖氧化酶基因的应用
葡萄糖氧化酶(GO)用于防治土传性病害的主要机制是通过该酶催化β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和H2O2。生成的H2O2可直接诱发植物的抗病反应或作为抗菌剂，也可以作力第二信使诱导植株系统抗性的形成。将GO基因导入棉花后，转基因株系对抗黄蒌病的抗性明显提高
[28]；而刘慧君等[29]将G0基因导人感病品种新陆早7号，获得的转GO基因棉对立枯病和枯萎病等苗期病害，以及炭疽病、黑果病、疫病等铃期病害的抗性有明显提高，并且转GO基因棉株型变矮、果柄变长、单株成铃数多和纤维品质明显提高等农艺性状变化。这表明GO基因是一
种具有良好应用前景的广谱性基因，对棉花黄萎病育种有着非常重要的意义。
2.4抗逆境基因工程
近年来，国内外围绕棉花抗盐性、挽早衰等方面开展了一些研究，并取得了一定进展。研究发现，抗氧化酶如谷胱甘肽还原酶和超氧化物歧化酶的活性与逆境胁迫关系密切。Payton等[30]将锰超氧化物歧化酶MnS0D基因导人棉花，转基因棉花能表达叶绿体定位的MnSOD．叶片中的SOD的活性增加了3倍，并且谷胱甘肽还原酶和抗坏血酸还原酶的活性也相应增加。沈法富等[31]将抗盐碱罗布麻DNA导入鲁棉6号，育成了两个耐盐碱品系“91—11”和。91-15”，在含盐量为0．51％的滨海盐碱地种植，其皮棉产量分别比受体鲁棉6号增产191.7％和237.8％。根系是植物吸收水分和养分的主要器官，是决定植物生长状况和早衰与否的关键之一。将菜豆种子特异表达的蛋白启动子(Ph／P)调控的ipt基因导人棉花，发现转基因棉植株根系更加发达，同时转基因株系种子的细胞分裂、次生根数目和纤维长短发生了明显的变化[32]。植物在逆境胁迫下积累甜菜碱，而来自大肠杆菌的betA基因编码胆碱脱氢酶能催化胆碱形成甘氨酸甜菜碱。吕素莲等[33]将胆碱脱氢酶基因betA和突变的乙酰乳酸合成酶als基因导人到3个棉花优良品种中，获得了耐盐性明显提高的转基因植株及其子代，为棉花耐盐育种创造了优异材料。虽然棉花抗逆基因工程获得了一些进展，然而由于缺乏高抗的陆地棉种质，再加上受诸多外界因素的影响，其进展比较缓慢，还不能满足生产的需求。
2.5纤维品质改良基因工程
2.5.1增加纤维强度和长度
在棉花纤维中表达Endoxyoglucan转移酶、过氧化氢酶和过氧化物酶基因，可以提高棉花纤维初生壁的交联度和棉花纤维的强度，同时也可提高纤维的长度和整齐度，并且转基因棉花纤维品质明显优于对照[34]。Richtel
动物毛发由角蛋白组成，利用转基因技术将动物角质蛋白基因导人棉花，是培育优良纤维棉花品种的一种快速高效的方法。1999年，上海世华植物基因工程有限公司与中国科学院上海植物生理研究所合作，将兔毛角蛋白基因导人棉花，成功获得转兔毛角蛋白基因棉，这标志着我国利用基因工程改良棉纤维获得了创新性的突破。张震林等[37]将棉纤维特异表达启动子E6驱动的蚕丝芯蛋白基因导人陆地棉中，发现转基因棉T1和T2代的纤维比强度分别比对照提高了21％和23。3％。随后，他们又将E6启动子驱动的兔角蛋白基因导人陆地棉中，转基因棉的比强度有较大幅度提高，平均比对照提高6.3 CN·tex。而赵丽芬等-1[38]将兔毛角蛋白基因导人到SGK321烈价抗虫棉中，与对照相比，转化后代纤维长度增加3.3 mm，整齐度增加2.1％，比强度提高6.0 CN·tex-1，其它指标也都有不同程度的提高，为选育超优质纤维棉花新品种打下基础。革兰氏阴性菌木醋杆菌合成一种由纤维素微纤丝组成的胞外带状
物，与高等植物纤维素相比，它具有独特的结构和机械性能。将纤维素合成操纵子acsA和acsB基因导人棕色棉，转基因棉花纤维的比强度和长度比对照高15％，纤维素的含量比对照高7.06％，而细度比对照低11.76％[39]。有“生物钢”之美誉的蜘蛛牵引丝是由蜘蛛主壶腹腺产生的一种蛋白质纤维，它将高抗张强度和高弹性奇妙地结合于一身，是自然界力学性能最优良的天然蛋白质纤维。本实验室按照棉花密码子偏爱性规律，合成了3个牵引丝蛋白基因，分别构建了棉纤维特异启动子EB调控的蛛丝蛋白基因表达盒，用农杆菌介导法已成功导入了陆地棉冀棉14中，目前正在进行转基因棉花纤维品质测定。转动物角质蛋白、蚕丝芯蛋白、兔角蛋自和蛛丝蛋白等基因棉的获得不仅为棉花纤维品质的基因工程改良奠定了理论基础，还为棉花纤维品质育种提供新的材料，其有重要的理论和实践意义。
2.5.2增强纤维的保暖性
聚B-羟基丁酸(PHAs)是一种脂肪族热塑聚酯，具有热塑性好、可被微生物完全降解的特性，被认为是最好的无污染性塑料原料。1996年，John和Keller将纤维特异启动子E6驱动的phaB基因(乙酰CoA还原酶基因)和phaC基因(PHA合成酶基因)导人陆地棉中，phaB和phaC基因在棉花纤维中特异表达，在棉花纤维中积累聚羟基丁酸，改善了棉花纤维的保暖性能。 热学性质分析表明，转基因纤维的吸收热率比对照纤维高11.6％，导电性比对照低6.7％，而隔热性因PHB基因的存在而明显提高[40-42]。同年，Rinehart等[43]也获得了表达PHB基因的棉花转基因植株。这些研究显示转PHB基因棉纤维在制作地毯和冬衣方面潜力很大，同时向世人展示了利用转基因技术改良棉纤维品质的良好前景。
2.5.3改变纤维颜色的重组棉花
转基因彩色棉的出现可以免去漂白、染色等过程，既对人体健康有利，也减轻了纺织过程的环境污染，并不同程度地满足了人们对彩色棉的需求，具有广阔的开发利用前景。有色纤维性状受不完全显性单基因的控制，目前还没有克隆出棉花自身调控颜色的基因，棉花纤维颜色的改良主要依赖棉花以外的外源基因。1987年，Calgene公司将番茄胚珠特异表达启动子pZ渊控的合成黑色素melanin基因导人到棉花中，获得了产生深褐色或黑色纤维的转基因棉花[43]。McBride等[44]将纤维特异启动子调控的抗生链霉素茼TyrA和ORF438基因导人棉花基因组中，获得了色泽深度不同的棉花纤维。同样，他们将来源于大肠杆菌的Tna和来源于红球菌的Pig基因导人棉花中，获得了浅蓝色棉纤维。
3. 展望
转基因棉花的广泛种植，在遏制棉虫危害、降低劳动强度、减少环境污染、促进农田微观环境和宏观环境改善等方面显示出重要的作用。通过基凶的遗传转化，将外源DNA整合到棉花基因组并高效表达。使棉花获得供体的目标性状，实现了棉花与其他不同种属动植物和微生物之间的基因交流，打破了物种之间的界限，使棉花育种理论和技术取得了突破性的进 展。此外由于棉花是以利用纤维为主的农作物，在经过安全评定后推广，对环境造成的影响较低，因此具有广阔的发展前景。
然而尽管转基因棉花育种已取得很大的成就，仍存在着一些伺题，如转化周期长，转化
效率低，抗黄萎病育种进展缓慢，转基因棉花的安全性等。在今后的工作中，尚需进一步加强转基因理论和技术的研究，重点提高棉花的转化体系，提高转化效率，努力拓宽目的基因范围，全方位对棉花进行改良等。
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转基因技术及其在棉花育种中的应用
(孙金霞 S090971 民族生态学 中央民族大学)
摘要：：棉花是一种重要的经济作物，在我国广泛种植。培育转基因棉花被看作是解决产量和生态环境问题最根本和最有效的方式。本文介绍了转基因棉花主要的研究方法，包括转化方法以及转入的基因等，并对转基因棉花的发展趋势作了相关探索。此外，本文总结了转基因技术在棉花遗传改良中的应用，包括棉花抗病、抗虫、抗除草荆、抗逆以及品质改良等方面的最新进展，并对棉花转基因研究中存在的主要问题和今后的研究与应用前景进行分析和展望。
Cotton Transgene Technology and Application of Genetic
Transformation in Cotton Breeding
Abstrast：Cotton is one of important industrial crops，and is widely planted in China．The cultivation of transgenic cotton is considered the most efficient way of increasing yield and resolving environmental problems．We introduced three dominant approaches in the development of genetic cotton and somee useful target genes，and forecast its probable future work．In addition, Transgenie cotton researehes for improving insect resistance，herbicide resistance，disease resistance，stress tolerance and fiber quality modification are presented． Meanwhile，an assessment of performance of transgenic cotton and its potential in cotton genetic transformation are prospected．
Key words：transgene；cotton；genetic transformation；cotton breeding
1973 年美国科学家科恩等人第一次将两种不同的DNA 分子进行体外重组, 并且在大肠杆菌中表达以来, 基因工程技术发展飞速, 该技术正在极大地改变着地球生物固有的进化进程。据不完全统计, 目前全球已有60 多种转基因园艺植物和大田作物相继问世, 其中转基因工程技术在棉花品种改良中的应用, 成效卓著。
自从1983年. 年人类首次获得转基因烟草、马铃薯以来，植物重组DNA技术在基础研究和应用开发中获得了显著进展，培育成功一批具有抗虫、抗病、耐除草剂和高产优质等外源优异性状的农作物新品种，对农业的生产方式和经济效益产生了深刻影响。棉花是利用转基因技术进行遗传改良最为成功的作物之一，仅我国自主研制的,CryA+CPTI 双价抗虫等基因就已被转育到41个棉花品种中。美国转基因抗虫棉大田种植已超过其棉田总面积的70%，澳大利亚和中国超过30%，全球转基因棉花种植面积达到680万公顷，占世界棉花种植面积的20%。
1.转基因技术
棉花转基因技术是指将外源DNA通过物理、化学或生物学方法导入棉花细胞并得到整合
和表达的过程。在棉花遗传转化体系中，主要有农杆菌介导、花粉管通道和基因枪3种转化方法。本研究拟对. 种方法的主要技术特点及研究和应用动态进行综述，旨为棉花分子育种提供参考。
1.1．农杆菌介导法
1.1.1农杆菌转化技术的理论基础
与棉花遗传转化有关的根癌农杆菌是一种土壤习居菌，在自然状态下能感染棉花等大多数双子叶植物营养器官的伤口，导致冠瘿瘤的发生。根癌农杆菌含有一种Ti质粒，侵染时通过棉花器官的伤口进入寄主组织，但其本身不进入寄主植物细胞，只把Ti质粒的T-DNA片断导入棉花的基因组中并得以表达，且外源DNA表达通常表现出典型的孟德尔遗传规律。由于Ti质粒本身能插入大到50kb的外源DNA，因此利用此转化载体，将Ti质粒上致瘤基因切除，代之以有益的外源DNA序列，并插入由真核型启动子和细菌抗生素抗性选择标记基因或报告基因组成的嵌合基因，将改造后的农杆菌侵染棉花器官或细胞，在加有相应选择因子的培养基上选择转化再生植株，进而可得到转基因植株。
1.1.2目前的研究热点及应用概况
目前，利用农杆菌进行棉花遗传转化的研究主要集中在基因的高效启动和表达，农杆菌遗传转化体系的改进和优化，即优化遗传转化的体细胞再生体系，缩短转基因植株的再生周期，通过调整培养基成分、固化剂浓度及激素水平等，改善体胚成熟、分化、生长的条件，减少畸形苗、变异系的发生。此外，还有采用嫁接或过渡培养等措施提高转基因植株移栽成活率，发展转基因棉花快速测定法，改进转化条件，提高转化效率等等。
1984 年首次报道了通过农杆菌介导，用“ 叶盘法”将抗卡那霉素基因导入棉花，1987 年等人将NPTⅡ和CAT基因导入珂字312，获得转基因再生棉株［1］。在国内，1994年陈志贤等将tfdA抗除草剂基因导入晋棉7号。目前，国内外利用农杆菌介导法已将Bt,CpTI,API等抗虫基因，tfdA,Bxn,aroA等抗除草剂及抗黄萎病、立枯病等许多有价值的目的基因导入棉花，并获得了转基因植株，且获得的部分转基因棉花已进入大田，进行商业化生产。
1.2.花粉管通道法
1.2.1花粉管通道转化技术的理论基础
20世纪70年代末，我国学者在远缘杂交研究中发现，授粉时混入异种作物花粉匀浆，其杂种后代出现了与异种作物相应的性状变异，推测外源DNA可能参与了受精过程。周光宇等结合我国远缘杂交的成功经验，提出了远缘杂交中存在DNA片段杂交的假设［2］，其主要内容是，授粉后外源DNA能沿着花粉管经过的珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞从而参与到新形成的种子中。由于这些细胞不具备正常的细胞壁，可作为天然的原生质体，易于DNA转化，受精后细胞DNA复制活跃，易于外源DNA的整合。
从整体上说，远缘亲本间的染色体结构是不亲和的。但从进化的角度来看，任何生物DNA均由4种核苷酸组成，这样就可能在顺序上出现不同程度的相同排列，因此部分基因的
结构有可能保持一定的亲合性。虽然进化中同时存在着相当强的保守性，但生物的主要基础代谢，如糖、氨基酸、能量代谢、蛋白质和核酸的生物合成与分解等都是共有的（如有90% 以上的已知酶在各种生物中都是共有的）。当外源花粉的基因组进入母体（ 受体）后，大部分片段被分解，侥幸保存下来的某些DNA 片段有可能整合进入受体的染色体，在子代中表达典型的或更多是非典型的遗传变异。外源DNA片段进入受体，整合是随机的，可能整合到结构基因中，也可能通过调控基因或重复序列以调控方式发挥作用
1.2.2花粉管通道法转化的棉花植株后代传特点
性状变异广泛，类型丰富，稳定快，变异频率较高。研究表明，由外源DNA 直接导入所引起的性状变异，涉及棉花的各类质量和数量性状，包括植株形态、生长发育、生理生化、抗性、产量构成等各个方面，一般变异性状在D3或D4代就能够稳定，大大缩短了育种进程。同时，总DNA导入引起的变异在表型、生理生化产物及DNA分子标记的3个层次上与常规育种产生的变异极为相似。通常转化率为1%-10%。遗传较为复杂。有些变异既不是供体性状也不是受体原有性状，后代的分离现象，有的符合孟德尔规律，但大多数是不符和的。王关林等［3］认为，裸露的外源DNA直接导入受体细胞，在转化过程中进入受体细胞的外源DNA拷贝数较多，整合到植物细胞基因组的拷贝数和整合位点也较多，外源DNA的结构变化复杂，在受体细胞中的遗传稳定性较差，但已经整合到植物基因组的外源DNA 一般都能稳定遗传，只是遗传规律性较差。在转化后代中还存在外源基因不表达现象等。
1.2.3在棉花上的研究现状及应用
利用花粉管通道法实现棉花遗传转化是外源DNA直接导入植物体成功的例子之一。龚蓁蓁等［4］利用3H 标记的棉花总DNA 于授粉24h 后导入棉花子房，分时段取样，冷冻切片，经放射自显影，看到授粉后珠心与珠孔已相通，珠心孔道是相当宽的，易于DNA溶液进入80% 检视的胚囊中有DNA浸润。在进入胚囊的途径中，自显斑点主要集中显现在珠心孔道内，即花粉管通道，在花粉管通道以外的珠心组织无标记显示，表明授粉后形成的花粉管通道是外源DNA进入胚囊的天然的唯一途径。邓德旺［5］等报道了采用激光共聚焦显微技术等细胞 生物学方法评价花粉管通道转基因的技术原理。
花粉管通道转基因技术首先由我国科学家提出并在许多作物遗传转化中取得了成功，由于这一工作在初期阶段是以总DNA为外源基因供体，虽能引起后代发生变异，但对外源DNA 进入胚囊、卵细胞或受精卵导致核基因组或细胞质基因组的行为及整合机理，以及引起特定而广泛变异的机制和转化后的表达与调节等问题缺乏理论上的确切认识，致使国内外一些学者对其可靠性提出了质疑。目前，虽然已取得了后代转化的分子证据，但仍有许多问题需要进一步的探讨，例如外源DNA的整合机理、转化后代的基因沉默、拷贝数量对表达水平的影响以及外源基因的表达检测等。
在应用方面，1981年黄骏麒等应用花粉管通道法成功地将抗病基因导入到高产、优质、感病的棉花品种中，获得耐黄萎病、抗枯萎病的棉花3118新品种。谢道昕等通过花粉管途径将苏云金芽孢杆菌杀虫基因（Bt 基因）导入棉花，获得了转基因抗虫棉，并首次获得转基
因的分子证据。之后，我国学者通过此方法陆续将Bt, Bt+CpTI,sGNA等基因导入中国主栽棉花品种中，目前已育成许多转基因品种(系）。通过PCR，Southern，Western Blot等试验手段提供了花粉管导入法导入的外源DNA 整合到棉花基因组，并表达相应性状的确凿的分子证据，结合田间直接生物学鉴定，充分证明此方法是一个天然有效的转基因途径。该技术的建立开创了整株植物活体基因转化的新途径，经过多年来不断的研究和改进，该技术日趋成熟，在我国棉花转基因育种研究中发挥着重要作用。
1.3基因枪法
1.3.1 基因枪转化技术的理论基础
基因枪法（Particle gun），又称微弹轰击法，是依赖高速度的金属微粒将外源基因引入活细胞的一种转化技术。其基本原理是将外源DNA 包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压作用下将微粒高速射入受体组织或细胞，微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物基因组上，并得到表达，从而实现基因的转化。因为微粒的体积非常小，且射击速度很快，所以外源基因进入细胞后仍能保持正常生物活性，被轰击过的细胞或组织，虽含有颗粒，但仍能存活，发育不受太大的影响。美国Cornell 大学的John Sanford等［6］于1987年研制出火药引爆（gunpower）的基因枪。根据基因枪的动力系统，可将它们分为3种类型：1类是以火药爆炸力为加速动力，也是最早出现的一种基因枪。其粒子速度主要是通过火药的数量及速度调节器控制；第2类是以高压气体作为动力，如以氦气、氢气、氮气等；第3类是以高压放电为驱动力，其最大优点是可以无级调速，通过变化工作电压，粒子速度和射入浓度可准确控制。据现有文献报道，高压放电和高压气体轰击的转化率均高于火药引爆法。
1.3.2 研究进展和应用
基因枪转化技术在棉花遗传转化中尚处于研究和起步阶段。John［7］等第一次将此技术应用于棉花遗传转化中，以胚性悬浮细胞系为受体进行轰击，成功得到转化植株；之后，McCabe［8］等以茎尖分生组织为受体、郝秀英等［9］以棉花下胚轴为受体、Rajasekaran［10］等用胚性细胞悬浮系为受体均获得了抗性转化植株。谢迎秋［11］对叶肉细胞进行轰击研究棉花曲叶病毒反式作用因子Ac2的功能等。到目前，使用基因枪进行棉花的遗传转化不过十几年的时间，还有许多问题需要进一步研究。棉花基因枪转化效率一般为0.001%-0.01%，因此，如何提高转化率是有待解决的核心问题，国内外的研究主要围绕转化前受体材料类型、渗透处理、多茎尖诱导及劈开分生组织暴露出敏感层等，研究和提高外植体的接受能力及外植体的数量，同时研究轰击后细胞的恢复调整和梯度筛选强度等，以提高植株再生效率，优化转化技术体系，进而提高基因枪转化率。
1.4其他方法
获得转基因棉花的方法还有很多，例如PEG介导法、脂质体介导法、超声波介导法、电激法、注射法、浸泡法等。
2. 转基因棉花育种成就
2.1 抗虫基因工程
目前应用于棉花的抗虫基因主要有苏云金芽孢杆菌的内毒素蛋白(Bt基因)、从植物中分离的 昆虫蛋白酶抑制剂(PI基因)和植物凝集素基因(1ectin)。
2.1.1 转Bt抗虫棉
美国Agracetus 公司1987 年首次报道已获得外源标记基因的珂字312 遗传工程棉花, 不久该公司利用农杆菌Ti 质粒介导法在世界上首次将苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因转入商品棉。连续两年的室内和罩笼鉴定表明, 转基因棉花抗鳞翅目幼虫, 抗性特征稳定, 并可通过种子遗传。但大田抗棉铃虫试验效果不理想, 主要原因是转基因棉花中毒蛋白含量不够1990 年Monsanto 公司将改造的Bt 基因导入棉花, 参加大田试验的转基因材料中Bt 基因表达产物的含量提高了100 倍。1996年Monsanto 公司与岱字棉公司合作, 开展转Bt 基因抗虫棉的选育和品种的商业化工作, 并迅速将抗虫棉种子销售市场拓展到中国的河北、安徽、山东等省, 目前抗虫棉品种33B 占据中国抗虫性市场的半壁江山, 估计在黄河流域的推广面积已累计达13313 万hm2 。
Monsanto 公司最近又育成具有2 个Bt 基因的棉花新品系—BGII。田间试验表明新品系对棉铃虫,尺、甜菜夜蛾都有很好的抗性。另外, 澳大利亚、前苏联、法国也培育出抗虫棉品种。国内棉花抗虫基因工程起步较晚, 但发展迅速。中国农科院生物技术研究所、江苏省农科院经济所、山西省农科院棉花所、中国农科院棉花所等先后报道利用基因工程技术和常规育种手段相结合的方式, 获得了一系列转Bt 基因抗虫棉品系。目前已通过审定的国产转Bt 基因抗虫棉品种有: GK - 1、GK12、GK19、GK22、中38 、南抗3 号等。
2.1.2 转Bt + CPTI 双价抗虫棉
目前国内外转基因抗虫棉普遍存在抗虫性的遗传稳定性问题。转Bt基因单价抗虫棉只能产生一种杀虫蛋白, 主要对棉铃虫等鳞翅目害虫有抗性。但有关研究表明, 转单一Bt 杀虫基因抗虫棉种植若干年后, 棉铃虫有可能产生抗性。Bt 抗虫棉抗虫谱较窄, 抗虫范围局限性较大, Bt 抗虫棉主要只对鳞翅目中的一些害虫具有抗性。其次, Bt 抗虫棉的抗虫性表达具有时空性, 随着叶子的老化, 抗虫性下降。目前转Bt 基因抗虫棉品种的遗传基础比较薄弱, 一旦抗性崩溃, 其后果将是惨重的。与单价抗虫基因相比, 双价抗虫基因可成倍延长品种的抗性。据2001 年信息, 由中国农科院生物技术研究所构建Bt + CPTI 双价抗虫基因,利用花粉管通道法导入受体品种石远321 , 成功地培育出SGK321 双价基因抗虫棉, 并于1999 年6 月通过农业部生物基因安全性评价, 获准在4 个省份进行商品化生产SGK321 双价转基因抗虫棉同现有的单价抗虫棉相比, 最大的优点在于其具有更稳定持久的抗虫性。双价抗虫棉中的Bt 基因产生杀虫蛋白, 破坏棉铃虫的消化系统导致其死亡; 而CPTI 是一种广谱杀虫蛋白, 在杀虫机理上与Bt 蛋白不同, CPTI 基因产生胰蛋白酶抑制剂, 使棉铃 虫的蛋白酶失去活力, 不能消化食物中的蛋白质,得不到充足的营养, 导致发育不良, 最终死亡。通过两个抗虫基因的抗性互补和协同增效, 使得棉花不同部位的抗虫效果趋于均匀一致, 从而大大延缓或制止昆虫抗性的产生。一般单价抗虫棉可在生产上应用8～10 a , 而双价抗虫棉可在生产上应用20～30 a 。
另外, 把外源凝集素基因与CPTI 基因以及Bt杀虫基因结合, 构造三价转基因抗虫棉品种的遗传转化工作, 也正在进行之中。
2.1.3蛋白酶抑制剂基因的转化
蛋白酶抑制剂(PI)是自然界最为丰富的蛋白之一，是一种天然的杀虫物质，与B￡基因相比，由于其具有抗虫谱广，安全性高和害虫不易产生抗性等优点而广泛用于抗虫基因工程。目前应用于棉花的PI基因主要是豇豆胰蛋白酶抑制剂(Cp—Ti基因)和慈菇蛋白质酶抑制剂(API基因)。分别将CpTi基因和修饰过的CpTi基凼导人棉花，获褥的转基因植株后代对抗棉铃虫具有明显的抗性。API对多种蛋白酶具有抑制活性，其抗虫能力优于CpTi基因。Thomas等将API基因导入棉花，获得了表达API基因的抗虫棉，用转基因棉花叶片饲喂白粉虱能降低成虫的羽化率。转蛋白酶抑制剂基因棉花的获得，使棉花的抗虫范围和抗虫能力有了新的扩展。但由于PI基因往往需要大量表达才能产生明显的抗虫效果，因而转PI基因棉还没有在生产中得到推广和应用。
2.1.4 植物凝集素基因的转化
棉蚜是棉花的另一个主要害虫，随着抗棉铃虫转基因棉花的普遍种植，棉蚜的危害逐渐加重。因此，利用转基因技术获得抗蚜棉花品种已成为棉花抗虫育种的新课题。植物凝集素是一类具有特异糖结合的活性蛋白，有些具有抗虫性，特别是对蚜虫等同翅目害虫有极强的抗杀作用。将来源于小麦胚芽凝集素基因导人陆地棉后，转基因T。代能显著抑制棉铃幼虫和棉蚜的生长发育；而将Bt+GNA双价基因导人棉花后，获得的转基因株系对棉铃虫和棉蚜有较好的抑制效果[12]。菊芋凝集素基因对棉蚜也具有一定的抗性，用菊芋凝集素HTA基因和尾穗苋凝集素ACA基因转化棉花，获得的转化植株对蚜虫有明显抗性[13]。目前，国内外的研究者已开始这方面的工作，并获得了转基因植株[14]，可望在不久的将来培育出抗蚜棉花新品种。
2.2 抗除草剂棉花
棉田杂草种类繁多，给棉花生产造成严重干扰，而由于棉花不含抗除草剂基因。所以把外源抗除草剂基因转人棉花，使棉株对某种除草剂具有抗性，对棉花生产意义重大。棉花中成功应用的抗除草剂基因是：抗草甘膦(glyphosate)基因、抗溴苯腈(bromoxyril)基因和2，4一D单氧化酶基因(tfdA)。
2.2.1抗草甘膦基因的转化
草甘膦是目前应用最广泛的一种非选择性广谱除草剂，它特异性地抑制植物和细菌中草莽酸羟基乙烯转移酶(EPSPs)的活性。1989年，Deaton等[15]将编码异构EPSP草甘膦合成酶基因(aroA)转入棉花，选育出抗草甘膦除草剂的转基因棉花。经过连续三代的研究，发现该基因以单拷贝方式整合到棉花基因组中，且遵循盂德尔的遗传分离规律。随后，Monsanto公司的Nida等[16]也获得了抗草甘膦除草剂的转基因棉花。而Keller等[17]将来自链霉素茵属的Bar基因分别导人棉花品种后，获得了可抗高达15 g·kg-1除草剂的Basta@转基因株系。谢龙旭等[18]将抗草甘膦突变基因(aroAMl2)导人棉花品种，获得的转基因棉花对草甘膦具有较强的抗性。分子检测证实，aroAMl2基因整合到棉花基因组中并得到有效表达。
2.2.2转2,4一D单氧化酶基因
2，4一D是一种激素型除草剂，通过干扰植物细胞分裂的速率达到除草目的。2，4一D是一种非常稳定的化台物，但它能被微生物中的2，4一D单氧化酶(zfdA)所降解。棉花对2，4-D非常敏感，将微生物中分离出的tfdA基因转入棉花后，可大大提高棉花对2，4一D的抗性。目前，国内外均获得了一些抗2，4-D的棉花品系。1992年，Bay—ley等[19]首先把tfdA基因导人棉花中，获得了能稳定遗传并表达的转基因棒系。而Lyon等[20]将tfdA基因导入棉花中，获得的转基因T一代植株对2，4一D的抗性比对照增加了50～100倍。1994年，我国陈志贤等[21]将tfJA基因导人晋棉7号，抗性试验表明，转基因后代可耐0．08％以上2，4一D，超过一般大田使用浓度水平。估计不久的将来，可以获得抗2，4一D的棉花新品种或新种质。
2.2.3转澳苯腈水解酶基因
溴苯腈是除草剂Buctril的活性成分，通过抑制植物的光合作用中的电子传递发挥除草效能。抗溴苯腈的转基因棉是第一个在美国大面积种植的转基因作物。1989年，Fillatti等[22]将编码溴苯腈的水解酶基因BXN转人棉花中，田问试验表明转基因植株仍能正常生长。棉花对除草剂咪唑啉酮也非常敏感。Grula等[23]和Rajasekaran[24]等分别将乙酰羟酸合酶AHAs基因和膦丝菌素蛋白乙酰转移酶PAT基因导入陆地棉中，分子检测证实该基因已导人棉花基因组中并得到表达；抗性后代用平常使用5倍浓度的除草剂咪唑啉酮喷洒仍能正常生长。
抗除草剂棉花的选育成功并在生产上大面积应用，给棉花生产带来一场新的变革，育成一系列转抗除草荆基冈棉花新品种，并在牛产上大面积应用，可取得良好的生态和经济效益。
2.3抗病基因工程
棉花病害严重，尤其是黄萎病和枯萎病两种土传真菌性病害，根治非常困难，是棉花生产的主要障碍。目前，应用在棉花抗病基因丁程中的基因主要有几丁质酶(Chi)、6-1，3-葡聚糖酶(Glu)、葡萄糖氧化酶(GO)等外源抗病基因。
2.3.1几丁质酶基因和争1，3一葡聚糖酶基因
几丁质酶(Chi)和β-1，3一葡聚糖酶(GIu)是植物防御体系中的两种防卫因子，两者之问存在协同增效作用。为了提高棉花的抗枯黄萎病的能力，刘桂珍等[25]和程红梅等[26]先后将构建的Chi和Glu嵌合双价基因导人棉花，已选出对枯黄萎病抗性提高的转基因棉花株系。吴家和等[27]将维管束特异启动子启动的Chi和CaMV 35S启动的Glu嵌合基因导人陆地棉品种，获得3个高抗黄萎病的转基因纯合系。
2.3.2葡萄糖氧化酶基因的应用
葡萄糖氧化酶(GO)用于防治土传性病害的主要机制是通过该酶催化β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和H2O2。生成的H2O2可直接诱发植物的抗病反应或作为抗菌剂，也可以作力第二信使诱导植株系统抗性的形成。将GO基因导入棉花后，转基因株系对抗黄蒌病的抗性明显提高
[28]；而刘慧君等[29]将G0基因导人感病品种新陆早7号，获得的转GO基因棉对立枯病和枯萎病等苗期病害，以及炭疽病、黑果病、疫病等铃期病害的抗性有明显提高，并且转GO基因棉株型变矮、果柄变长、单株成铃数多和纤维品质明显提高等农艺性状变化。这表明GO基因是一
种具有良好应用前景的广谱性基因，对棉花黄萎病育种有着非常重要的意义。
2.4抗逆境基因工程
近年来，国内外围绕棉花抗盐性、挽早衰等方面开展了一些研究，并取得了一定进展。研究发现，抗氧化酶如谷胱甘肽还原酶和超氧化物歧化酶的活性与逆境胁迫关系密切。Payton等[30]将锰超氧化物歧化酶MnS0D基因导人棉花，转基因棉花能表达叶绿体定位的MnSOD．叶片中的SOD的活性增加了3倍，并且谷胱甘肽还原酶和抗坏血酸还原酶的活性也相应增加。沈法富等[31]将抗盐碱罗布麻DNA导入鲁棉6号，育成了两个耐盐碱品系“91—11”和。91-15”，在含盐量为0．51％的滨海盐碱地种植，其皮棉产量分别比受体鲁棉6号增产191.7％和237.8％。根系是植物吸收水分和养分的主要器官，是决定植物生长状况和早衰与否的关键之一。将菜豆种子特异表达的蛋白启动子(Ph／P)调控的ipt基因导人棉花，发现转基因棉植株根系更加发达，同时转基因株系种子的细胞分裂、次生根数目和纤维长短发生了明显的变化[32]。植物在逆境胁迫下积累甜菜碱，而来自大肠杆菌的betA基因编码胆碱脱氢酶能催化胆碱形成甘氨酸甜菜碱。吕素莲等[33]将胆碱脱氢酶基因betA和突变的乙酰乳酸合成酶als基因导人到3个棉花优良品种中，获得了耐盐性明显提高的转基因植株及其子代，为棉花耐盐育种创造了优异材料。虽然棉花抗逆基因工程获得了一些进展，然而由于缺乏高抗的陆地棉种质，再加上受诸多外界因素的影响，其进展比较缓慢，还不能满足生产的需求。
2.5纤维品质改良基因工程
2.5.1增加纤维强度和长度
在棉花纤维中表达Endoxyoglucan转移酶、过氧化氢酶和过氧化物酶基因，可以提高棉花纤维初生壁的交联度和棉花纤维的强度，同时也可提高纤维的长度和整齐度，并且转基因棉花纤维品质明显优于对照[34]。Richtel
动物毛发由角蛋白组成，利用转基因技术将动物角质蛋白基因导人棉花，是培育优良纤维棉花品种的一种快速高效的方法。1999年，上海世华植物基因工程有限公司与中国科学院上海植物生理研究所合作，将兔毛角蛋白基因导人棉花，成功获得转兔毛角蛋白基因棉，这标志着我国利用基因工程改良棉纤维获得了创新性的突破。张震林等[37]将棉纤维特异表达启动子E6驱动的蚕丝芯蛋白基因导人陆地棉中，发现转基因棉T1和T2代的纤维比强度分别比对照提高了21％和23。3％。随后，他们又将E6启动子驱动的兔角蛋白基因导人陆地棉中，转基因棉的比强度有较大幅度提高，平均比对照提高6.3 CN·tex。而赵丽芬等-1[38]将兔毛角蛋白基因导人到SGK321烈价抗虫棉中，与对照相比，转化后代纤维长度增加3.3 mm，整齐度增加2.1％，比强度提高6.0 CN·tex-1，其它指标也都有不同程度的提高，为选育超优质纤维棉花新品种打下基础。革兰氏阴性菌木醋杆菌合成一种由纤维素微纤丝组成的胞外带状
物，与高等植物纤维素相比，它具有独特的结构和机械性能。将纤维素合成操纵子acsA和acsB基因导人棕色棉，转基因棉花纤维的比强度和长度比对照高15％，纤维素的含量比对照高7.06％，而细度比对照低11.76％[39]。有“生物钢”之美誉的蜘蛛牵引丝是由蜘蛛主壶腹腺产生的一种蛋白质纤维，它将高抗张强度和高弹性奇妙地结合于一身，是自然界力学性能最优良的天然蛋白质纤维。本实验室按照棉花密码子偏爱性规律，合成了3个牵引丝蛋白基因，分别构建了棉纤维特异启动子EB调控的蛛丝蛋白基因表达盒，用农杆菌介导法已成功导入了陆地棉冀棉14中，目前正在进行转基因棉花纤维品质测定。转动物角质蛋白、蚕丝芯蛋白、兔角蛋自和蛛丝蛋白等基因棉的获得不仅为棉花纤维品质的基因工程改良奠定了理论基础，还为棉花纤维品质育种提供新的材料，其有重要的理论和实践意义。
2.5.2增强纤维的保暖性
聚B-羟基丁酸(PHAs)是一种脂肪族热塑聚酯，具有热塑性好、可被微生物完全降解的特性，被认为是最好的无污染性塑料原料。1996年，John和Keller将纤维特异启动子E6驱动的phaB基因(乙酰CoA还原酶基因)和phaC基因(PHA合成酶基因)导人陆地棉中，phaB和phaC基因在棉花纤维中特异表达，在棉花纤维中积累聚羟基丁酸，改善了棉花纤维的保暖性能。 热学性质分析表明，转基因纤维的吸收热率比对照纤维高11.6％，导电性比对照低6.7％，而隔热性因PHB基因的存在而明显提高[40-42]。同年，Rinehart等[43]也获得了表达PHB基因的棉花转基因植株。这些研究显示转PHB基因棉纤维在制作地毯和冬衣方面潜力很大，同时向世人展示了利用转基因技术改良棉纤维品质的良好前景。
2.5.3改变纤维颜色的重组棉花
转基因彩色棉的出现可以免去漂白、染色等过程，既对人体健康有利，也减轻了纺织过程的环境污染，并不同程度地满足了人们对彩色棉的需求，具有广阔的开发利用前景。有色纤维性状受不完全显性单基因的控制，目前还没有克隆出棉花自身调控颜色的基因，棉花纤维颜色的改良主要依赖棉花以外的外源基因。1987年，Calgene公司将番茄胚珠特异表达启动子pZ渊控的合成黑色素melanin基因导人到棉花中，获得了产生深褐色或黑色纤维的转基因棉花[43]。McBride等[44]将纤维特异启动子调控的抗生链霉素茼TyrA和ORF438基因导人棉花基因组中，获得了色泽深度不同的棉花纤维。同样，他们将来源于大肠杆菌的Tna和来源于红球菌的Pig基因导人棉花中，获得了浅蓝色棉纤维。
3. 展望
转基因棉花的广泛种植，在遏制棉虫危害、降低劳动强度、减少环境污染、促进农田微观环境和宏观环境改善等方面显示出重要的作用。通过基凶的遗传转化，将外源DNA整合到棉花基因组并高效表达。使棉花获得供体的目标性状，实现了棉花与其他不同种属动植物和微生物之间的基因交流，打破了物种之间的界限，使棉花育种理论和技术取得了突破性的进 展。此外由于棉花是以利用纤维为主的农作物，在经过安全评定后推广，对环境造成的影响较低，因此具有广阔的发展前景。
然而尽管转基因棉花育种已取得很大的成就，仍存在着一些伺题，如转化周期长，转化
效率低，抗黄萎病育种进展缓慢，转基因棉花的安全性等。在今后的工作中，尚需进一步加强转基因理论和技术的研究，重点提高棉花的转化体系，提高转化效率，努力拓宽目的基因范围，全方位对棉花进行改良等。
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