呕吐毒素试剂盒法在小麦及面粉等农副产品中的应用
一、呕吐毒素介绍：
呕吐毒素又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇,是单端孢菌素烯烃中的一种。作为一种常见的真菌毒素，呕吐毒素在自然界中广泛存在于小麦、玉米等粮谷类农作物中，在世界范围内存在着较高的污染率。小麦一旦被呕吐毒素产毒霉菌株污染，在适宜生长环境 中，产毒菌株会迅速生长，产生呕吐毒素，小麦赤霉粒大概在3%，呕吐毒素基本达到超标的上限；而小麦中的呕吐毒素又会随小麦粉的生产过程带入到面粉中，严重威胁人体健康。
呕吐毒素属于剧毒或中等毒物，对人有很强的毒性，当人摄入了被呕吐毒素污染的食物后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡。
二、小麦和面粉中呕吐毒素国家残留限量标准
大麦、小麦、麦片、小麦粉≤1000ug/kg
三、呕吐毒素试剂盒法检测步骤
1 技术指标
1.1 试剂盒灵敏度：3ppb(ng/ml)
1.2 反应模式：37℃，30min～30min～15min
1.3 检测下限：
谷物、饲料…………………………150ppb
1.4 交叉反应率：
呕吐毒素……………………………………100%
3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇……………
1.5 样本回收率：
谷物及配合饲料…………………………85%±15%
2 试剂盒组成
酶标板、标准品（0ppb、3ppb、9ppb、27ppb、81ppb、243ppb）、酶标记物、抗体工作液、底物液A、底物液B、终止液、20X浓缩洗涤液、2X复溶液
3 试剂盒法需具备的仪器
酶标仪、打印机、小型粉粹机、20目标准筛、振荡器、离心机、天平:(感量0.01g)、恒温培养箱、微量移液器：单道20ul-100ul、100ul-1000ul、多道300ul
4检测前实验样品的准备及处理：
济南痕量生物提供样本前处理方法如下：
4.1 样本处理前须知：
实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。
4.2 配液：
配液1：复溶液
将2×复溶液用去离子水2倍稀释，用于样本的复溶，复溶液在2-8℃环境可保存一个月。
配液2：工作洗涤液
将20×浓缩洗涤液用去离子水20倍稀释制成工作洗涤液，用于试剂盒的洗涤，浓缩洗涤液在2-8℃环境可保存一个月。
4.3 样本前处理步骤：
4.3.1 谷物（大米、玉米、小米等）及饲料处理方法
1）称取5g（精确到0.01g）粉碎样品（过20目筛）于50ml离心管中，加25ml去离子水，振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；
2）取0.1ml上清，加入0.9ml复溶液，混匀；
3）取50μl进行分析。
样本稀释倍数：50 检测下限：150ppb
5 酶联免疫试验步骤
将所需试剂从2-8℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
5.1 编 号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
5.2 加样反应：加标准品应用液或样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗体工作液50µl/孔，轻轻振荡5秒混匀，37℃避光反应30分钟。
5.3 洗 涤：将孔内液体甩干，用工作洗涤液250µl/孔充分洗涤5次，每次间隔30秒，最后用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
5.4 加酶反应：加酶标记物100µl/孔，37℃避光反应30分钟。
5.5 洗 涤：重复5.3步骤
5.6 显 色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，轻轻振荡5秒混匀，37℃避
光显色15分钟。
5.7 终 止：加终止液50µl/孔，轻轻振荡混匀，终止反应。
5.8 测吸光值：用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值（建议用双波长450/630nm）。测定应在终止反应后10分钟内完成。
6 结果分析
6.1 百分吸光率的计算
标准液或样本的百分吸光率等于标准液或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
A
百分吸光度值（%）＝
A0
A—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb标准溶液的平均吸光度值
6.2 标准曲线的绘制与计算
以标准液百分吸光率为纵坐标，对应的标准液浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准液的半对数曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。 7 注意事项
7.1 室温低于25℃或试剂及样本没有回到室温（25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
7.2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
7.3 混合要均匀，洗板要彻底，在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性。
7.4 在所有孵育过程中，用盖板膜封住微孔板，避免光线照射。
7.5 不要使用过了有效期的试剂盒，不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
7.6 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm
7.7 反应终止液有腐蚀性，避免接触皮肤。
×100%
呕吐毒素试剂盒法在小麦及面粉等农副产品中的应用
一、呕吐毒素介绍：
呕吐毒素又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇,是单端孢菌素烯烃中的一种。作为一种常见的真菌毒素，呕吐毒素在自然界中广泛存在于小麦、玉米等粮谷类农作物中，在世界范围内存在着较高的污染率。小麦一旦被呕吐毒素产毒霉菌株污染，在适宜生长环境 中，产毒菌株会迅速生长，产生呕吐毒素，小麦赤霉粒大概在3%，呕吐毒素基本达到超标的上限；而小麦中的呕吐毒素又会随小麦粉的生产过程带入到面粉中，严重威胁人体健康。
呕吐毒素属于剧毒或中等毒物，对人有很强的毒性，当人摄入了被呕吐毒素污染的食物后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡。
二、小麦和面粉中呕吐毒素国家残留限量标准
大麦、小麦、麦片、小麦粉≤1000ug/kg
三、呕吐毒素试剂盒法检测步骤
1 技术指标
1.1 试剂盒灵敏度：3ppb(ng/ml)
1.2 反应模式：37℃，30min～30min～15min
1.3 检测下限：
谷物、饲料…………………………150ppb
1.4 交叉反应率：
呕吐毒素……………………………………100%
3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇……………
1.5 样本回收率：
谷物及配合饲料…………………………85%±15%
2 试剂盒组成
酶标板、标准品（0ppb、3ppb、9ppb、27ppb、81ppb、243ppb）、酶标记物、抗体工作液、底物液A、底物液B、终止液、20X浓缩洗涤液、2X复溶液
3 试剂盒法需具备的仪器
酶标仪、打印机、小型粉粹机、20目标准筛、振荡器、离心机、天平:(感量0.01g)、恒温培养箱、微量移液器：单道20ul-100ul、100ul-1000ul、多道300ul
4检测前实验样品的准备及处理：
济南痕量生物提供样本前处理方法如下：
4.1 样本处理前须知：
实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。
4.2 配液：
配液1：复溶液
将2×复溶液用去离子水2倍稀释，用于样本的复溶，复溶液在2-8℃环境可保存一个月。
配液2：工作洗涤液
将20×浓缩洗涤液用去离子水20倍稀释制成工作洗涤液，用于试剂盒的洗涤，浓缩洗涤液在2-8℃环境可保存一个月。
4.3 样本前处理步骤：
4.3.1 谷物（大米、玉米、小米等）及饲料处理方法
1）称取5g（精确到0.01g）粉碎样品（过20目筛）于50ml离心管中，加25ml去离子水，振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；
2）取0.1ml上清，加入0.9ml复溶液，混匀；
3）取50μl进行分析。
样本稀释倍数：50 检测下限：150ppb
5 酶联免疫试验步骤
将所需试剂从2-8℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
5.1 编 号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
5.2 加样反应：加标准品应用液或样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗体工作液50µl/孔，轻轻振荡5秒混匀，37℃避光反应30分钟。
5.3 洗 涤：将孔内液体甩干，用工作洗涤液250µl/孔充分洗涤5次，每次间隔30秒，最后用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
5.4 加酶反应：加酶标记物100µl/孔，37℃避光反应30分钟。
5.5 洗 涤：重复5.3步骤
5.6 显 色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，轻轻振荡5秒混匀，37℃避
光显色15分钟。
5.7 终 止：加终止液50µl/孔，轻轻振荡混匀，终止反应。
5.8 测吸光值：用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值（建议用双波长450/630nm）。测定应在终止反应后10分钟内完成。
6 结果分析
6.1 百分吸光率的计算
标准液或样本的百分吸光率等于标准液或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
A
百分吸光度值（%）＝
A0
A—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb标准溶液的平均吸光度值
6.2 标准曲线的绘制与计算
以标准液百分吸光率为纵坐标，对应的标准液浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准液的半对数曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。 7 注意事项
7.1 室温低于25℃或试剂及样本没有回到室温（25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
7.2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
7.3 混合要均匀，洗板要彻底，在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性。
7.4 在所有孵育过程中，用盖板膜封住微孔板，避免光线照射。
7.5 不要使用过了有效期的试剂盒，不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
7.6 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm
7.7 反应终止液有腐蚀性，避免接触皮肤。
×100%