第十章原生质体培养
✧教学目的与要求：
✧深入了解植物细胞结构功能与细胞全能性表达的关系，掌握原生质体的分离以及培养过程中渗透压和激素的调控原理与技术。
第一节、原生质体研究概况
一、原生质体的概念
✧原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。
二、原生质体研究进展
✧据统计，目前已有49个科，146个属的320多种植物经原生质体培养得到了再生植株（1993）。其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。
三、原生质体研究的意义
✧1、除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，同时叶为制造新杂种开辟了道路。2、原生质体可摄入外源DNA ，细胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础。3、获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。
第二节、原生质体的制备
1、用于分离原生质体的材料准备
✧无菌试管苗叶片
✧上胚轴和子叶
✧培养细胞
2、酶处理
✧原生质体分离常用的商品酶
✧纤维素酶类
✧果胶酶类
✧半纤维素酶
酶溶剂及其渗透压
✧酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。
✧渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。
✧酶浓度及酶解时间
✧酶解时间
✧酶浓度酶解温度
3、原生质体的收集和纯化
✧飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll 、Ficoll 。
✧Percoll 是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(
✧Ficoll
✧Ficoll 是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g ／ml 仍
未超出正常生理性渗透压, 也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
✧以火炬松胚性细胞悬浮培养系为试材，原生质体纯化采用漂浮法，上层为6%的
F icoll 溶液，下层为9%的F icoll 溶液，1000r/min离心5min 后，原生质体悬浮于上层。
✧普通马铃薯四倍体栽培种" 甘农薯2号" 、"Favorita" 、"Russet Burbank" 试管苗叶
片为材料来源, 游离培养马铃薯原生质体. 结果表明, 游离前材料的低温预处理, 酶解前对组织和酶液进行真空渗透处理, 均能显著提高原生质体产量. 用Ficoll 密度梯度离心法收集原生质体进行培养, 结果表明第三、四层界面的原生质体有较好的培养效果.
✧沉淀法
✧常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将酶液洗出干净，再用Percoll 飘浮一次。
4、原生质体活力检测
✧目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。
✧FDA 法：FDA （二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，
在活细胞内，FDA 被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。✧伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏时，细胞才能被染色，
因而可以通过细胞被染色与否确定活性。
5、影响原生质体活力的因素
✧分离材料的生理状态
✧酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压
✧分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间
✧环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响
第三节、原生质体培养
一、培养基
1．渗透压
✧常用的渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。
✧原生质体的渗透压原则：培养基渗透压与细胞渗透压等渗。
2．无机盐
✧大量元素浓度；
✧NO3－和NH4+的比例；
✧Ca2+浓度
3．有机成分
✧维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。
4．激素
✧常用的激素：NAA 、IAA 、BA 与2,4-D
5．pH 值
四、原生质体培养方法
✧液体浅层培养
✧固体培养
✧液体－固体双层培养
✧琼脂糖珠培养
✧用适温的琼脂糖液与提纯的原生质体液混合均匀，然后以0.5ml 左右的液滴滴入
培养液中，待形成琼脂糖珠后，震荡培养的一种方法。
五、愈伤组织形成和植株再生
✧细胞分裂与细胞壁再生
✧愈伤组织形成
✧愈伤组织分化
✧植株再生
第四节、影响原生质体培养的主要因素
一、基因型
✧较早的试验曾证明矮牵牛叶肉原生质体的不同生长发育时期是受不同基因所
控制的。
✧Dudits 等（1991）用苜蓿(Medicagosativa) 不同基因型做了较深入的研究，
认为有某个基因型在离体培养时难以形成细胞胚。
二、原生质体的来源
✧供体材料体类型
✧供体细胞的分化程度
✧供体细胞的生长同步性
三、起始培养密度与培养基
✧基本起始密度
✧培养基激素水平
✧密度与培养基营养成分完全性
四、原生质体培养中的一些生理问题
✧细胞的逆境反应一般是快速地产生涉及诱发不同代谢途径（例如苯基丙烷途径
phenyl-propanoid route ）的酶系统，结果形成了植物抗毒素(phyto-alexins)和如木质素一类的结构多聚物。
✧有些逆境反应对原生质体制备和培养是不利的，例如在甜菜原生质体制备时由
于某些酶的活性增强使得形成类脂过氧化物(lipidperoxides) ，结果引起原生质膜的氧化损伤。而对马铃薯原生质体活力的损伤乃是由于乙烯产生所致(PerlAetal.,1991) 。
✧许多次生化谢产物被认为是植物在抵御物理、化学和生物侵袭等不良环境中起
重要作用，因此胁迫因子不可诱导其合成。
✧Dicosmo 证明真菌诱发因子对于刺激或诱导一些培养物产生植物毒素最有效。例
罂粟中的血根碱、茜草科中的蒽醌，长春花中的吲哚生物碱。诱发因子包括高压灭菌的菌丝悬浮液。
✧Rokem 试验中发现添加真菌丝体对三角叶薯芋悬浮培养物中薯芋皂苷含量影响
✧✧✧✧✧✧✧✧✧✧✧✧✧✧✧✧✧显著。产量日对照约134mg/L增至230mg/L。2．修复机理原生质体分离时会丢失一些不同的细胞结构。使原生质体中细胞骨架的组分、结构、方向发生变化，最常见的是引起细胞极性的改变(SimmondD H., 1991) ，同时也会干扰质膜的蛋白质系统。原生质体修复其质膜及其中的蛋白质组分的能力，细胞壁再生的能力及细胞骨架的修复修复和调整能力都对它们能否进一步发育有很大影响。3．细胞脱分化与细胞分裂分离的原生质体原来的细胞状态常常会影响脱分化的进行。细胞在培养初期的一些变化，如液泡消失、细胞体积增加、细胞质变浓，核蛋白体增加等，与此同时DNA 开始复制，随后染色质变浓，原生质体脱分化成为类似分生组织状态的细胞。原生质体培养初期的细胞分裂至少涉及到以下多个因子：细胞壁的再生、细胞骨架的修复与调整、原生质体分离时细胞所处的周期（G2期细胞具有较高的分裂频率）。另外，细胞壁的再生与DNA 的合成协调与否也会影响细胞分裂。五、原生质体研究的趋势低密度和单个原生质体培养；原生质体衍生系统如微小原生质体、胞质体、核质体的利用；单倍配子体如花粉原生质体培养；计算机控制系统、流式细胞光度计等技术的应用。思考题1．原生质体、亚原生质体、微小原生质体和原生质球的概念。2．为什么原生质体要培养在等渗培养基中？3．影响原生质体培养的主要因素。4．原生质体的培养方法有哪些？各有何优缺点。5．性细胞原生质体的种类、分化途径及应用领域。6．为什么说原生质体培养系统是现代生物技术的载体？
第十章原生质体培养
✧教学目的与要求：
✧深入了解植物细胞结构功能与细胞全能性表达的关系，掌握原生质体的分离以及培养过程中渗透压和激素的调控原理与技术。
第一节、原生质体研究概况
一、原生质体的概念
✧原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。
二、原生质体研究进展
✧据统计，目前已有49个科，146个属的320多种植物经原生质体培养得到了再生植株（1993）。其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。
三、原生质体研究的意义
✧1、除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，同时叶为制造新杂种开辟了道路。2、原生质体可摄入外源DNA ，细胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础。3、获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。
第二节、原生质体的制备
1、用于分离原生质体的材料准备
✧无菌试管苗叶片
✧上胚轴和子叶
✧培养细胞
2、酶处理
✧原生质体分离常用的商品酶
✧纤维素酶类
✧果胶酶类
✧半纤维素酶
酶溶剂及其渗透压
✧酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。
✧渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。
✧酶浓度及酶解时间
✧酶解时间
✧酶浓度酶解温度
3、原生质体的收集和纯化
✧飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll 、Ficoll 。
✧Percoll 是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(
✧Ficoll
✧Ficoll 是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g ／ml 仍
未超出正常生理性渗透压, 也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
✧以火炬松胚性细胞悬浮培养系为试材，原生质体纯化采用漂浮法，上层为6%的
F icoll 溶液，下层为9%的F icoll 溶液，1000r/min离心5min 后，原生质体悬浮于上层。
✧普通马铃薯四倍体栽培种" 甘农薯2号" 、"Favorita" 、"Russet Burbank" 试管苗叶
片为材料来源, 游离培养马铃薯原生质体. 结果表明, 游离前材料的低温预处理, 酶解前对组织和酶液进行真空渗透处理, 均能显著提高原生质体产量. 用Ficoll 密度梯度离心法收集原生质体进行培养, 结果表明第三、四层界面的原生质体有较好的培养效果.
✧沉淀法
✧常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将酶液洗出干净，再用Percoll 飘浮一次。
4、原生质体活力检测
✧目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。
✧FDA 法：FDA （二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，
在活细胞内，FDA 被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。✧伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏时，细胞才能被染色，
因而可以通过细胞被染色与否确定活性。
5、影响原生质体活力的因素
✧分离材料的生理状态
✧酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压
✧分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间
✧环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响
第三节、原生质体培养
一、培养基
1．渗透压
✧常用的渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。
✧原生质体的渗透压原则：培养基渗透压与细胞渗透压等渗。
2．无机盐
✧大量元素浓度；
✧NO3－和NH4+的比例；
✧Ca2+浓度
3．有机成分
✧维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。
4．激素
✧常用的激素：NAA 、IAA 、BA 与2,4-D
5．pH 值
四、原生质体培养方法
✧液体浅层培养
✧固体培养
✧液体－固体双层培养
✧琼脂糖珠培养
✧用适温的琼脂糖液与提纯的原生质体液混合均匀，然后以0.5ml 左右的液滴滴入
培养液中，待形成琼脂糖珠后，震荡培养的一种方法。
五、愈伤组织形成和植株再生
✧细胞分裂与细胞壁再生
✧愈伤组织形成
✧愈伤组织分化
✧植株再生
第四节、影响原生质体培养的主要因素
一、基因型
✧较早的试验曾证明矮牵牛叶肉原生质体的不同生长发育时期是受不同基因所
控制的。
✧Dudits 等（1991）用苜蓿(Medicagosativa) 不同基因型做了较深入的研究，
认为有某个基因型在离体培养时难以形成细胞胚。
二、原生质体的来源
✧供体材料体类型
✧供体细胞的分化程度
✧供体细胞的生长同步性
三、起始培养密度与培养基
✧基本起始密度
✧培养基激素水平
✧密度与培养基营养成分完全性
四、原生质体培养中的一些生理问题
✧细胞的逆境反应一般是快速地产生涉及诱发不同代谢途径（例如苯基丙烷途径
phenyl-propanoid route ）的酶系统，结果形成了植物抗毒素(phyto-alexins)和如木质素一类的结构多聚物。
✧有些逆境反应对原生质体制备和培养是不利的，例如在甜菜原生质体制备时由
于某些酶的活性增强使得形成类脂过氧化物(lipidperoxides) ，结果引起原生质膜的氧化损伤。而对马铃薯原生质体活力的损伤乃是由于乙烯产生所致(PerlAetal.,1991) 。
✧许多次生化谢产物被认为是植物在抵御物理、化学和生物侵袭等不良环境中起
重要作用，因此胁迫因子不可诱导其合成。
✧Dicosmo 证明真菌诱发因子对于刺激或诱导一些培养物产生植物毒素最有效。例
罂粟中的血根碱、茜草科中的蒽醌，长春花中的吲哚生物碱。诱发因子包括高压灭菌的菌丝悬浮液。
✧Rokem 试验中发现添加真菌丝体对三角叶薯芋悬浮培养物中薯芋皂苷含量影响
✧✧✧✧✧✧✧✧✧✧✧✧✧✧✧✧✧显著。产量日对照约134mg/L增至230mg/L。2．修复机理原生质体分离时会丢失一些不同的细胞结构。使原生质体中细胞骨架的组分、结构、方向发生变化，最常见的是引起细胞极性的改变(SimmondD H., 1991) ，同时也会干扰质膜的蛋白质系统。原生质体修复其质膜及其中的蛋白质组分的能力，细胞壁再生的能力及细胞骨架的修复修复和调整能力都对它们能否进一步发育有很大影响。3．细胞脱分化与细胞分裂分离的原生质体原来的细胞状态常常会影响脱分化的进行。细胞在培养初期的一些变化，如液泡消失、细胞体积增加、细胞质变浓，核蛋白体增加等，与此同时DNA 开始复制，随后染色质变浓，原生质体脱分化成为类似分生组织状态的细胞。原生质体培养初期的细胞分裂至少涉及到以下多个因子：细胞壁的再生、细胞骨架的修复与调整、原生质体分离时细胞所处的周期（G2期细胞具有较高的分裂频率）。另外，细胞壁的再生与DNA 的合成协调与否也会影响细胞分裂。五、原生质体研究的趋势低密度和单个原生质体培养；原生质体衍生系统如微小原生质体、胞质体、核质体的利用；单倍配子体如花粉原生质体培养；计算机控制系统、流式细胞光度计等技术的应用。思考题1．原生质体、亚原生质体、微小原生质体和原生质球的概念。2．为什么原生质体要培养在等渗培养基中？3．影响原生质体培养的主要因素。4．原生质体的培养方法有哪些？各有何优缺点。5．性细胞原生质体的种类、分化途径及应用领域。6．为什么说原生质体培养系统是现代生物技术的载体？