中国医科大学学报第41卷第1期2012年1月JournalofChinaMedicalUniversityVol.41No.1Jan.2012
·21·
神经干细胞分化为功能性运动神经元的检测
刘欣春，朱悦
（中国医科大学附属第一医院骨科，沈阳１１０００１）
摘要目的观察神经干细胞分化形成的运动神经元能否与骨骼肌细胞形成功能性突触。方法分离培养小鼠神经干细胞及
骨骼肌细胞，将神经干细胞与骨骼肌细胞进行共同培养。用免疫荧光方法检测神经干细胞的分化情况及其与骨骼肌细胞形成突触结构的情况，用药理学方法检测突触结构的功能性。结果
神经干细胞在与骨骼肌细胞的共同培养中分化为运动神经元样
神经干细胞
细胞，表达胆碱能细胞标志物，可见乙酰胆碱受体沿神经元轴突排列。药理学实验证明功能性突触的存在。结论在与骨骼肌细胞的共同培养中分化为运动神经元，并能与骨骼肌细胞形成功能性突触结构。关键词doi
神经干细胞；骨骼肌细胞；突触；分化
R329
文献标志码
A
文章编号
0258-4646（2012）01-0021-03
中图分类号网络出版地址
CNKI:21-1227/R.20120113.1028.027
http://www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20120113.1028.027.html
InvestigationonFunctionalMotorNeuronDifferentiationfromNeuralStemCellsLIUXin-chun，ZHUYue
（DepartmentofOrthopedics，TheFirstHospital，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110001，China）
AbstractObjectiveToexploretheformationoffunctionalneuromuscularsynapseinacoculturesystemofneuralstemcellsandmuscleNeuralstemcellsandskeletalmusclecellswereprimaryisolatedfrommouse.Thentheywereputintoacoculture
Motorneuron-like
skeletalcells.Methods
system.Thedifferentiationofneuralstemcellsandtheformationofneuromuscularsynapsewereobservedviaimmunofluorescencemicro－scope.Pharmacologicalapproacheswereusedtotestthefunctionalcharactersoftheneuromuscularsynapse.ResultsPharmacologicalapproachesshowedthefunctionofthesynapse.Conclusionmusclecoculturescouldformfunctionalsynapsewithskeletalmusclecells.Keywords
neuralstemcell；skeletalmusclecell；neuromuscularsynapse；differentiation
cellswereobservedinthecocultures.Cholinergiccellwerealsodetected.AchRclusterswereobservedarrangedalongneuronalprocess.
Motorneuronsdifferentiatedfromneuralstemcellandskeletal
神经干细胞具有培养中连续扩增并保持分化潜能的特性，在一定的条件下能够分化为神经系统的主要细胞类型，如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，是修复神经系统损伤的理想的种子细胞。为使神经干细胞正确发挥治疗作用，需要调控使之向目的细胞类型分化。运动神经元是中枢神经系统中分化路径研究相对清楚的神经元类型之一，目前已有研究集中在干细胞向运动神经元诱导分化上。我们在前期研究中诱导神经干细胞分化为HB9阳性本研究中进一步将神经干细胞与的运动神经元［1］，
骨骼肌细胞共同培养，观察分化的运动神经元能否
基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金资助项目
（[1**********]005）
作者简介：刘欣春（1978-），男，副教授，博士.通讯作者：朱悦，E-mail：[email protected]收稿日期：2011-10-27
网络出版时间：2012-01-1310:28
与骨骼肌细胞形成功能性突触。1材料与方法1.1
神经干细胞的分离培养
参考我们已发表的文献［1，2］分离培养神经干细胞，方法简述如下：新生昆明小鼠（中国医科大学实验动物中心提供），用乙醇浸泡处死后取端脑，置于4°CD-Hanks（美国GIBCO公司）溶液平皿中剪成小于1mm3的碎块，移入离心管中，去除D-Hanks溶液后用0.125%胰蛋白酶（美国GIBCO公司）在37°C、5%CO2条件下振荡消化20min，加入胎牛血清）终止消化，然后用Pasteur管轻（美国HyClone公司
轻吹打组织，1000r/min离心5min后，弃上清，细胞用含20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、20ng/mL表皮生长因子、N2添加剂以及DMEM-F12（1∶1，美国GIBCO公司）的生长培养基重悬浮，调整细胞浓度至1×105/mL，每5×105个细胞接种到无包被的培
·22·
中国医科大学学报第41卷
养瓶中，置于孵箱中，在37°C、5%CO2条件下培养，每隔1d加入新的碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子及N2，每4d半量换液1次。1.2
骨骼肌细胞的分离培养
参考我们已发表的文献［3］分离培养骨骼肌细胞，并将方法作简单修改，简述如下：取新生昆明小鼠的后肢肌，去除骨骼，肌组织用刀片切成糊状，然后用0.2%的胶原酶Ⅺ（美国Sigma公司）在37°C下消化1h，再用0.1%的胰蛋白酶消化30min。然后离心收集肌细胞（离心机Eppendorf5810RV3.9，3500r/min离心5min），用含20%胎牛血清的F10培养基（美国GIBCO公司）生长培养基重悬浮，并将肌细胞接种到瓶底涂Ⅰ型胶原的培养瓶中。根据细胞贴壁特性的不同，采用预贴壁法（preplate，PP）分离不同群体的肌肉来源细胞。PP1代表在接种后第1小时内贴壁的细胞；贴壁的细胞弃去，没贴壁的细胞种入另一瓶中即为PP2；再孵育2h之后，PP2中没贴壁的细胞种入新瓶中即为PP3；PP3孵育18h之后没贴壁的细胞种入新瓶中即为PP4；之后以24h为间隔进行预贴壁直至PP5，PP5接种到置有包被Ⅰ型胶原盖玻片的6孔培养板中，培养24h后与神经干细胞进行共培养。1.3
神经干细胞与骨骼肌细胞的共同培养离心收集原代培养8~10d的神经干细胞，用含5%胎牛血清及B27添加剂（美国GIBCO公司）的Neurobasal培养基（美国GIBCO公司）重悬浮。PP5用Neurobasal培养基洗2遍后，取3mL培养基（含有大约8~14神经球）加入到PP5的中央，以后每2d半量换液1次。7d后，共培养用于药理学以及免疫细胞化学分析。1.4
免疫细胞化学
细胞爬片用0.01mol/LPBS简单冲洗后用4℃、4%多聚甲醛固定30min，然后用间接免疫荧光染色进行检测。所有的步骤均在室温下进行，正常山羊血清以及一抗、二抗均用含1%牛血清白蛋白、0.25%TritonX-100的0.01mol/LPBS稀释，冲洗用PBS浓度为0.01mol/L（pH7.2）。标本洗3次（每次5min）后，用10%正常山羊血清封闭1h，然后与一抗孵育过夜。所用一抗及浓度如下：鼠抗MAP2（1∶200）、兔抗N-AChR（1∶200）以及兔抗ChAT（1∶50）（武汉博士德公司）。标本洗3次（每次5min）后，与适合的二抗孵育2h。二抗及其浓度如下：Cy3标记羊抗鼠IgG（1∶50，美国Sigma公司），FITC标记羊抗兔IgG（1∶50，武汉博士德公司）。用抗淬灭封片剂封片。
1.5共培养的药理学分析
共选取10个共培养用于药理学分析。将骨骼
肌细胞与神经干细胞共培养的盖玻片置于玻璃浴槽中并置于倒置显微镜下进行观察，用人工脑脊液冲去剩余的培养液并灌满浴槽。人工脑脊液构成如下：127mmol/LNaCl、3mmol/LKCl、2mmol/LCaCl2、1mmol/LMgSO4、26mmol/LNaHCO3、1.25mmol/LNaH2PO4、10mmol/LD-glucose（pH7.45，310mOsm）。选取非自动收缩的肌细胞用来做药理学分析，将谷氨酸钠（美国Sigma公司）和乙酰胆碱（美国Sigma公司）溶于人工脑脊液中，终浓度为500μmol/L，通过玻璃微管注到这些肌细胞旁，中间间隔注入人工脑脊液的作为阴性对照。22.1
结果
神经干细胞与骨骼肌细胞共同培养的显微镜神经球加入到骨骼肌细胞培养后开始贴壁，细胞从神经球向四周迁移（图1A），并逐渐分化形成神经系统细胞形态，其中包括运动神经元样细胞，突起沿骨骼肌细胞表面分布排列（图1B）。7d后进行免疫荧光检测，发现在共培养系统中有ChAT+的运动神经元样细胞（图1C），同时发现MAP2+的神经元轴突和AChR+的乙酰胆碱受体紧密接触，提示神经肌连接的形成（图1D~F）。
观察与免疫细胞化学检测
ABC
DEF
A，phasecontrastimageofacocultureonthesecondday（Scalebar=100μm）；B，phasecontrastimageofacocultureontheseventhday（Scale）incoculturesbar=50μm）；C，immunostainingofChAT+cells（green（Scalebar=50μm）；D-F，immunostainingofneuromuscularsynapseformedincocultures（D，MAP2-red；E，nicotinicAChR-green；F，mergedimageofDandE；Scalebars=50μm）.
图１Ｆｉｇ．１
神经干细胞细胞与骨骼肌细胞共培养Ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ-ｍｙｏｂｌａｓｔｃｏｃｕｌｔｕｒｅ
2.2共培养的药理学分析
共培养7d后，选择非自发收缩的骨骼肌细胞
做药理学分析，局部注入乙酰胆碱能够直接引起骨
第１期刘欣春等．神经干细胞分化为功能性运动神经元的检测
·23·
骼肌细胞的收缩，而谷氨酸盐只能通过兴奋突触前运动神经元来引起肌肉收缩，人工脑脊液在二者之人工脑脊液的注间注入作为阴性对照。结果发现，
入不能够引起肌细胞的收缩，一些肌细胞在谷氨酸盐和乙酰胆碱注入时均有反应，一些肌细胞只对乙酰胆碱注入有反应，对谷氨酸盐注入有反应的细胞都对乙酰胆碱的注入有反应，大部分肌细胞对谷氨酸盐和乙酰胆碱的注入都没有反应（表1）。对灌注有反应的肌细胞都集中在分化的神经球附近，而距分化神经球较远的肌细胞对灌注无反应。
表１
Ｔａｂ．１
共培养中骨骼肌细胞对药物的反应
列，这不仅提示着神经肌连接的形成，还间接证明有运动神经元的分化。
本研究进一步采用药理学方法［6］来证明神经肌连接能够将冲动从运动神经元传递到肌细胞，谷氨酸盐和乙酰胆碱作为激动剂在共培养中进行局部灌注。因为骨骼肌细胞上没有谷氨酸盐受体，所以谷氨酸盐只能通过突触前的运动神经元来诱发骨骼肌收缩，与之相反，乙酰胆碱可以通过直接与骨骼肌细胞上的N-AchR相结合来诱发骨骼肌收缩。如前所述，谷氨酸盐的灌注能够引起一些肌细胞收缩，说明共培养中有功能性突触存在；一些细胞只对乙酰胆碱灌注有反应，可能是因为虽然乙酰胆碱受体已经聚集但尚不具备功能；对灌注有反应的肌细胞都集中在分化的神经球附近，是由于分化细胞能够提
Ｒｅａｃｔｉｏｎｏｆｍｙｏｂｌａｓｔｓｉｎｔｈｅｃｏｃｕｌｔｕｒｅｔｏｄｒｕｇｓ
Glutamate
+40
-1885
Acethlcholine
+-
5］
供乙酰胆碱受体聚集所需的诱导信号［4，。
因此，我们认为神经干细胞在与骨骼肌细胞共同培养时不但能够分化为运动神经元，还能够与骨骼肌细胞形成功能性突触结构。
参考文献：
［1］刘欣春，朱悦.新生小鼠端脑神经干细胞可诱导分化为运动神经
Nonspontaneouslycontractingmyoblastsincocultureswereperfusedwithagonistacethlcholineorglutamate.Myoblaststhatcontractedinand‘-’ontheresponsetoagonistperfusionwererecordedas‘+’contrary.Thecellnumbersareshowninthetable.
3讨论
我们在前期研究中诱导神经干细胞分化为HB9阳性的运动神经元［1］，为了证实这些运动神经元是否具有功能，我们将神经干细胞接种到骨骼肌细胞培养中建立共培养体系，结果神经干细胞贴壁后能够分化成运动神经元样细胞，发出长长的突起，在肌细胞表面爬行延伸，一些神经元样细胞表达胆碱能标志ChAT。然后再检测共培养中N-AChR的表达以验证是否有神经肌连接的形成。在体内，N-AChR位于神经肌连接与运动神经元轴突末梢相近的突触后膜上；在体外，只有当骨骼肌细胞与运动神经元共同培养时，N-AChR才能够汇聚形成
［4，5］
.解剖学报，2010，41（6）：814-817.元［J］
［2］LiuX，ZhuY，GaoW.Isolationofneuralstemcellsfromthespinal
cordsoflowtemperaturepreservedabortuses［J］.JNeurosciMeth－ods，2006，157（1）：64-70.
［3］刘欣春，朱悦.胰岛素样生长因子1对骨骼肌源性干细胞的促增
.解剖学报，2008，39（1）：79-82.殖效应［J］
［4］HarperJM，KrishnanC，DarmanJS，etal.Axonalgrowthofembryon－
icstemcell-derivedmotoneuronsinvitroandinmotoneuron-injuredadultrats［J］.ProcNatlAcadSciUSA，2004，101（18）：7123-7128.［5］MilesGB，YohnDC，WichterleH，etal.Functionalpropertiesofmo－
toneuronsderivedfrommouseembryonicstemcells［J］.JNeurosci，2004，24（36）：7848-7858.
［6］MacDonaldSC，FleetwoodIG，HochmanS，etal.Functionalmotor
neuronsdifferentiatingfrommousemultipotentspinalcordprecursorcellsincultureandaftertransplantationintotransectedsciaticnerve［J］.JNeurosurg，2003，98（5）：1094-1103.
（编辑陈
姜，英文编辑刘宝林）
。在
本研究的共培养体系中N-AChR沿着神经元突起排
中国医科大学学报第41卷第1期2012年1月JournalofChinaMedicalUniversityVol.41No.1Jan.2012
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神经干细胞分化为功能性运动神经元的检测
刘欣春，朱悦
（中国医科大学附属第一医院骨科，沈阳１１０００１）
摘要目的观察神经干细胞分化形成的运动神经元能否与骨骼肌细胞形成功能性突触。方法分离培养小鼠神经干细胞及
骨骼肌细胞，将神经干细胞与骨骼肌细胞进行共同培养。用免疫荧光方法检测神经干细胞的分化情况及其与骨骼肌细胞形成突触结构的情况，用药理学方法检测突触结构的功能性。结果
神经干细胞在与骨骼肌细胞的共同培养中分化为运动神经元样
神经干细胞
细胞，表达胆碱能细胞标志物，可见乙酰胆碱受体沿神经元轴突排列。药理学实验证明功能性突触的存在。结论在与骨骼肌细胞的共同培养中分化为运动神经元，并能与骨骼肌细胞形成功能性突触结构。关键词doi
神经干细胞；骨骼肌细胞；突触；分化
R329
文献标志码
A
文章编号
0258-4646（2012）01-0021-03
中图分类号网络出版地址
CNKI:21-1227/R.20120113.1028.027
http://www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20120113.1028.027.html
InvestigationonFunctionalMotorNeuronDifferentiationfromNeuralStemCellsLIUXin-chun，ZHUYue
（DepartmentofOrthopedics，TheFirstHospital，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110001，China）
AbstractObjectiveToexploretheformationoffunctionalneuromuscularsynapseinacoculturesystemofneuralstemcellsandmuscleNeuralstemcellsandskeletalmusclecellswereprimaryisolatedfrommouse.Thentheywereputintoacoculture
Motorneuron-like
skeletalcells.Methods
system.Thedifferentiationofneuralstemcellsandtheformationofneuromuscularsynapsewereobservedviaimmunofluorescencemicro－scope.Pharmacologicalapproacheswereusedtotestthefunctionalcharactersoftheneuromuscularsynapse.ResultsPharmacologicalapproachesshowedthefunctionofthesynapse.Conclusionmusclecoculturescouldformfunctionalsynapsewithskeletalmusclecells.Keywords
neuralstemcell；skeletalmusclecell；neuromuscularsynapse；differentiation
cellswereobservedinthecocultures.Cholinergiccellwerealsodetected.AchRclusterswereobservedarrangedalongneuronalprocess.
Motorneuronsdifferentiatedfromneuralstemcellandskeletal
神经干细胞具有培养中连续扩增并保持分化潜能的特性，在一定的条件下能够分化为神经系统的主要细胞类型，如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，是修复神经系统损伤的理想的种子细胞。为使神经干细胞正确发挥治疗作用，需要调控使之向目的细胞类型分化。运动神经元是中枢神经系统中分化路径研究相对清楚的神经元类型之一，目前已有研究集中在干细胞向运动神经元诱导分化上。我们在前期研究中诱导神经干细胞分化为HB9阳性本研究中进一步将神经干细胞与的运动神经元［1］，
骨骼肌细胞共同培养，观察分化的运动神经元能否
基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金资助项目
（[1**********]005）
作者简介：刘欣春（1978-），男，副教授，博士.通讯作者：朱悦，E-mail：[email protected]收稿日期：2011-10-27
网络出版时间：2012-01-1310:28
与骨骼肌细胞形成功能性突触。1材料与方法1.1
神经干细胞的分离培养
参考我们已发表的文献［1，2］分离培养神经干细胞，方法简述如下：新生昆明小鼠（中国医科大学实验动物中心提供），用乙醇浸泡处死后取端脑，置于4°CD-Hanks（美国GIBCO公司）溶液平皿中剪成小于1mm3的碎块，移入离心管中，去除D-Hanks溶液后用0.125%胰蛋白酶（美国GIBCO公司）在37°C、5%CO2条件下振荡消化20min，加入胎牛血清）终止消化，然后用Pasteur管轻（美国HyClone公司
轻吹打组织，1000r/min离心5min后，弃上清，细胞用含20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、20ng/mL表皮生长因子、N2添加剂以及DMEM-F12（1∶1，美国GIBCO公司）的生长培养基重悬浮，调整细胞浓度至1×105/mL，每5×105个细胞接种到无包被的培
·22·
中国医科大学学报第41卷
养瓶中，置于孵箱中，在37°C、5%CO2条件下培养，每隔1d加入新的碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子及N2，每4d半量换液1次。1.2
骨骼肌细胞的分离培养
参考我们已发表的文献［3］分离培养骨骼肌细胞，并将方法作简单修改，简述如下：取新生昆明小鼠的后肢肌，去除骨骼，肌组织用刀片切成糊状，然后用0.2%的胶原酶Ⅺ（美国Sigma公司）在37°C下消化1h，再用0.1%的胰蛋白酶消化30min。然后离心收集肌细胞（离心机Eppendorf5810RV3.9，3500r/min离心5min），用含20%胎牛血清的F10培养基（美国GIBCO公司）生长培养基重悬浮，并将肌细胞接种到瓶底涂Ⅰ型胶原的培养瓶中。根据细胞贴壁特性的不同，采用预贴壁法（preplate，PP）分离不同群体的肌肉来源细胞。PP1代表在接种后第1小时内贴壁的细胞；贴壁的细胞弃去，没贴壁的细胞种入另一瓶中即为PP2；再孵育2h之后，PP2中没贴壁的细胞种入新瓶中即为PP3；PP3孵育18h之后没贴壁的细胞种入新瓶中即为PP4；之后以24h为间隔进行预贴壁直至PP5，PP5接种到置有包被Ⅰ型胶原盖玻片的6孔培养板中，培养24h后与神经干细胞进行共培养。1.3
神经干细胞与骨骼肌细胞的共同培养离心收集原代培养8~10d的神经干细胞，用含5%胎牛血清及B27添加剂（美国GIBCO公司）的Neurobasal培养基（美国GIBCO公司）重悬浮。PP5用Neurobasal培养基洗2遍后，取3mL培养基（含有大约8~14神经球）加入到PP5的中央，以后每2d半量换液1次。7d后，共培养用于药理学以及免疫细胞化学分析。1.4
免疫细胞化学
细胞爬片用0.01mol/LPBS简单冲洗后用4℃、4%多聚甲醛固定30min，然后用间接免疫荧光染色进行检测。所有的步骤均在室温下进行，正常山羊血清以及一抗、二抗均用含1%牛血清白蛋白、0.25%TritonX-100的0.01mol/LPBS稀释，冲洗用PBS浓度为0.01mol/L（pH7.2）。标本洗3次（每次5min）后，用10%正常山羊血清封闭1h，然后与一抗孵育过夜。所用一抗及浓度如下：鼠抗MAP2（1∶200）、兔抗N-AChR（1∶200）以及兔抗ChAT（1∶50）（武汉博士德公司）。标本洗3次（每次5min）后，与适合的二抗孵育2h。二抗及其浓度如下：Cy3标记羊抗鼠IgG（1∶50，美国Sigma公司），FITC标记羊抗兔IgG（1∶50，武汉博士德公司）。用抗淬灭封片剂封片。
1.5共培养的药理学分析
共选取10个共培养用于药理学分析。将骨骼
肌细胞与神经干细胞共培养的盖玻片置于玻璃浴槽中并置于倒置显微镜下进行观察，用人工脑脊液冲去剩余的培养液并灌满浴槽。人工脑脊液构成如下：127mmol/LNaCl、3mmol/LKCl、2mmol/LCaCl2、1mmol/LMgSO4、26mmol/LNaHCO3、1.25mmol/LNaH2PO4、10mmol/LD-glucose（pH7.45，310mOsm）。选取非自动收缩的肌细胞用来做药理学分析，将谷氨酸钠（美国Sigma公司）和乙酰胆碱（美国Sigma公司）溶于人工脑脊液中，终浓度为500μmol/L，通过玻璃微管注到这些肌细胞旁，中间间隔注入人工脑脊液的作为阴性对照。22.1
结果
神经干细胞与骨骼肌细胞共同培养的显微镜神经球加入到骨骼肌细胞培养后开始贴壁，细胞从神经球向四周迁移（图1A），并逐渐分化形成神经系统细胞形态，其中包括运动神经元样细胞，突起沿骨骼肌细胞表面分布排列（图1B）。7d后进行免疫荧光检测，发现在共培养系统中有ChAT+的运动神经元样细胞（图1C），同时发现MAP2+的神经元轴突和AChR+的乙酰胆碱受体紧密接触，提示神经肌连接的形成（图1D~F）。
观察与免疫细胞化学检测
ABC
DEF
A，phasecontrastimageofacocultureonthesecondday（Scalebar=100μm）；B，phasecontrastimageofacocultureontheseventhday（Scale）incoculturesbar=50μm）；C，immunostainingofChAT+cells（green（Scalebar=50μm）；D-F，immunostainingofneuromuscularsynapseformedincocultures（D，MAP2-red；E，nicotinicAChR-green；F，mergedimageofDandE；Scalebars=50μm）.
图１Ｆｉｇ．１
神经干细胞细胞与骨骼肌细胞共培养Ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ-ｍｙｏｂｌａｓｔｃｏｃｕｌｔｕｒｅ
2.2共培养的药理学分析
共培养7d后，选择非自发收缩的骨骼肌细胞
做药理学分析，局部注入乙酰胆碱能够直接引起骨
第１期刘欣春等．神经干细胞分化为功能性运动神经元的检测
·23·
骼肌细胞的收缩，而谷氨酸盐只能通过兴奋突触前运动神经元来引起肌肉收缩，人工脑脊液在二者之人工脑脊液的注间注入作为阴性对照。结果发现，
入不能够引起肌细胞的收缩，一些肌细胞在谷氨酸盐和乙酰胆碱注入时均有反应，一些肌细胞只对乙酰胆碱注入有反应，对谷氨酸盐注入有反应的细胞都对乙酰胆碱的注入有反应，大部分肌细胞对谷氨酸盐和乙酰胆碱的注入都没有反应（表1）。对灌注有反应的肌细胞都集中在分化的神经球附近，而距分化神经球较远的肌细胞对灌注无反应。
表１
Ｔａｂ．１
共培养中骨骼肌细胞对药物的反应
列，这不仅提示着神经肌连接的形成，还间接证明有运动神经元的分化。
本研究进一步采用药理学方法［6］来证明神经肌连接能够将冲动从运动神经元传递到肌细胞，谷氨酸盐和乙酰胆碱作为激动剂在共培养中进行局部灌注。因为骨骼肌细胞上没有谷氨酸盐受体，所以谷氨酸盐只能通过突触前的运动神经元来诱发骨骼肌收缩，与之相反，乙酰胆碱可以通过直接与骨骼肌细胞上的N-AchR相结合来诱发骨骼肌收缩。如前所述，谷氨酸盐的灌注能够引起一些肌细胞收缩，说明共培养中有功能性突触存在；一些细胞只对乙酰胆碱灌注有反应，可能是因为虽然乙酰胆碱受体已经聚集但尚不具备功能；对灌注有反应的肌细胞都集中在分化的神经球附近，是由于分化细胞能够提
Ｒｅａｃｔｉｏｎｏｆｍｙｏｂｌａｓｔｓｉｎｔｈｅｃｏｃｕｌｔｕｒｅｔｏｄｒｕｇｓ
Glutamate
+40
-1885
Acethlcholine
+-
5］
供乙酰胆碱受体聚集所需的诱导信号［4，。
因此，我们认为神经干细胞在与骨骼肌细胞共同培养时不但能够分化为运动神经元，还能够与骨骼肌细胞形成功能性突触结构。
参考文献：
［1］刘欣春，朱悦.新生小鼠端脑神经干细胞可诱导分化为运动神经
Nonspontaneouslycontractingmyoblastsincocultureswereperfusedwithagonistacethlcholineorglutamate.Myoblaststhatcontractedinand‘-’ontheresponsetoagonistperfusionwererecordedas‘+’contrary.Thecellnumbersareshowninthetable.
3讨论
我们在前期研究中诱导神经干细胞分化为HB9阳性的运动神经元［1］，为了证实这些运动神经元是否具有功能，我们将神经干细胞接种到骨骼肌细胞培养中建立共培养体系，结果神经干细胞贴壁后能够分化成运动神经元样细胞，发出长长的突起，在肌细胞表面爬行延伸，一些神经元样细胞表达胆碱能标志ChAT。然后再检测共培养中N-AChR的表达以验证是否有神经肌连接的形成。在体内，N-AChR位于神经肌连接与运动神经元轴突末梢相近的突触后膜上；在体外，只有当骨骼肌细胞与运动神经元共同培养时，N-AChR才能够汇聚形成
［4，5］
.解剖学报，2010，41（6）：814-817.元［J］
［2］LiuX，ZhuY，GaoW.Isolationofneuralstemcellsfromthespinal
cordsoflowtemperaturepreservedabortuses［J］.JNeurosciMeth－ods，2006，157（1）：64-70.
［3］刘欣春，朱悦.胰岛素样生长因子1对骨骼肌源性干细胞的促增
.解剖学报，2008，39（1）：79-82.殖效应［J］
［4］HarperJM，KrishnanC，DarmanJS，etal.Axonalgrowthofembryon－
icstemcell-derivedmotoneuronsinvitroandinmotoneuron-injuredadultrats［J］.ProcNatlAcadSciUSA，2004，101（18）：7123-7128.［5］MilesGB，YohnDC，WichterleH，etal.Functionalpropertiesofmo－
toneuronsderivedfrommouseembryonicstemcells［J］.JNeurosci，2004，24（36）：7848-7858.
［6］MacDonaldSC，FleetwoodIG，HochmanS，etal.Functionalmotor
neuronsdifferentiatingfrommousemultipotentspinalcordprecursorcellsincultureandaftertransplantationintotransectedsciaticnerve［J］.JNeurosurg，2003，98（5）：1094-1103.
（编辑陈
姜，英文编辑刘宝林）
。在
本研究的共培养体系中N-AChR沿着神经元突起排