油菜中主要色素的提取和分离
1、实验目的
1）通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法；
2）通过薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理；
3）从油菜中提取出叶绿素、胡萝卜素、叶黄素等色素并加以分离。
2、实验原理
油菜，又叫油白菜，苦菜，是十字花科植物油菜的嫩茎叶，原产我国，颜色深绿，属十字花科白菜变种。油菜中含有蛋白质、脂肪、维生素、尼克酸等营养成分，还含有胡萝卜素、叶绿素、叶黄素等色素。
叶绿素a和叶绿素b为吡咯衍生物与金属镁的配合物；胡萝卜素是一种橙色天然色素，属于四萜类，为一长链共轭多烯，有α、β、γ三种异构体，其中，β异构体含量最多。叶黄素为一种黄色色素，与叶绿素同存在于植物体中，是胡萝卜素的羟基衍生物，较易溶于乙醇，在乙醚中溶解度较小。根据它们的化学特性，可将它们从油菜叶片中通过连续回流提取出来，并通过薄层色谱方法将它们分离开来。
胡萝卜素、叶绿素、叶黄素的结构式如图1：
索氏提取器如图2，其工作原理是：完成一次溶剂提取后，溶液被加热，挥发的溶剂经过冷凝管冷凝，重新进入提取的环境，开始新的一次提取过程；如此循环下去，直至停止提取。这比直接用溶剂回流提取省溶剂，也剩下了很多后期
去除溶剂的时间；但是要求提取物有比较好的稳定性。
薄层层析是快速分离和定性分析微量物质的一种极为重要
的实验技术，具有设备简单、操作方便而快速的特点。它是将固定
相支持物均匀地铺在玻片上制成薄层板，将样品溶液点加在起点
处，置于层析容器中用合适的溶剂展开而达到分离的目的。用此法
氏提取器分离时几乎不受温度的影响，可采用腐蚀性显色剂，而且可在高温
下显色，特别适用于挥发性小或在较高温度下易发生反应的物质，
样品袋同时也常用来跟踪有机反应或监测有机反应完成的程度。
柱色谱（柱上层析）常用的有吸附色谱和分配色谱两类。吸
附色谱常用氧化铝和硅胶作固定相；而分配色谱中以硅胶、硅藻土
和纤维素作为支持剂，以吸收较大量的液体作固定相，而支持剂本
身不起分离作用。吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大经过图
2活化的多孔性或粉状固体吸附剂。 当待分离的混合物溶液流过吸
附柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脱的速度也不同，于是形成了不同层次，即溶质在柱中自上而下按对吸附剂的亲和力大小分别形成若干色带，再用溶剂洗脱时，已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集；或将柱吸干，挤出后按色带分割开，再用溶剂将各色带中的溶质萃取出来。
3、实验仪器和试剂
仪器:烧杯、量筒(100 mL, 10 mL) 、抽滤装置、色谱柱、梨形漏斗、带胶塞的玻璃棒、锥形瓶、滤纸
试剂:硅胶, 羧甲基纤维素钠水溶液，中性氧化铝,乙醇( 95% ,分析纯) , 石油醚(60～90℃) ,正丁醇,新鲜的油菜叶
4、实验步骤
1、薄层板的制备
①湿板的制备（硬板）：可用于硅胶、聚酰胺、氧化铝等薄层板的制备，但最常用的是硅胶硬板。在烧杯中放入2g硅胶G，加入5～6 ml 0.5℅的羧甲基纤维素钠水溶液，调成糊状。将调制好的浆料倾注到清洁干燥的载玻片上，拿在手中轻轻的摇晃，使其表面均匀平滑，在室温下晾干后进行活化。
②干板的制备（软板）：多用于氧化铝薄层的制备。在一块5 cm ×15 cm 的边缘整齐的玻璃板上，撒上一层氧化铝，取一物品顶住玻璃的右端。两手紧握铺板玻璃棒两端，放在合适的位置，将两拇指指甲盖紧玻璃边缘，在玻璃板上平稳的移动涂布器进行涂布（厚度为0.2 ～0.3 mm），取下涂好薄层的玻璃板，置水品台上于室温下晾干。
2、薄层板的活化
将涂布好的薄层板置于室温晒干后，放在电热干燥箱内加热活化，活化条件根据需要而定。硅胶板一般在干燥箱中渐渐升温，维持105～110℃ 活化30 min。活化后的薄层板放在干燥器内保存待用。
3、样品的制备
将滤纸卷成圆筒状，其直径略小于索氏提取器提取筒的内径，一端用线扎紧。 称取一定量的新鲜油菜叶片, 剪碎。将新鲜油菜叶放入索氏提取器的滤纸筒中，在原地烧瓶中加入石油醚- 无水乙醇( 3：2, V/ V) 混合溶液,水域加热提取，直至提取器颜色较浅为止，待凝液刚刚虹吸下去时即可停止加热。将提取液转入分液漏斗, 分2 次加入等体积蒸馏水洗去水溶性物质及乙醇, 将含色素的石油醚层于暗处浓缩备用。
4、点样
先用铅笔在距薄层板一端 1 cm 处轻轻划一横线作为起始线，然后用毛细管吸取样品，在起始线上小心点样，斑点直径一般不超过2 mm 。若样品溶液太稀，可重复点样，但必须待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，造成扩散等现象，而影响分离效果。若在同一板上点几个样，样点距离应为 1。点样要轻，不可划破薄层。
5、展开
薄层色谱的展开，需在密闭容器中进行。如图 3 是薄层板在不同层析缸中的展开方式。为使溶剂蒸汽迅速达到平衡，可在展开槽内衬一滤纸。在层析缸中加入配好的展开溶剂，使其高度不超过1 cm 。将点好的薄层板小心放入层析缸中，点样一端朝下，浸入展开剂中。盖好瓶盖，观察展开剂前沿上升到一定高度时取出，尽快在板上标上展开剂前沿位置。晾干，观察斑点位置，计算 Rf值。
展开剂纱布
条
图3
纸薄层条
6、柱色谱分离
待色素全部进入柱体后, 在柱顶小心加1.5 cm 高度的洗脱剂
一9∶1( 体积比) 石油醚—丙酮, 然后在层析柱上面装一滴液
漏斗, 内装15 ml 洗脱剂, 打开上下两个活塞, 让洗脱剂逐滴放
出, 层析即开始进行, 用锥型瓶收集。 当第一个有色圈( 橙黄
溶剂色) 将滴出时, 取另一锥形瓶收集, 它就是胡萝卜素, 约用洗
脱剂40 ml。 用7∶3( 体积比) 石油醚—丙酮作洗脱剂, 绿色圈
沙层下端呈黄色,再加20 ml 洗脱剂洗脱, 颜色分层更明显, 但速度
附剂很慢, 总共用去洗脱剂约100 ml。 分出第二个黄色带, 它是叶芯层
黄素. 再用3∶1∶1( 体积比) 丁醇—乙醇—水作洗脱剂, 洗脱
叶绿素, 速度很快, 用洗脱剂约60 ml。
5、实验结果及要求
图4 柱色谱装置
序号
1
2
3
4 颜色 桔黄 蓝绿 草绿 黄色 色素名称 -胡萝卜素 R值 — — — — 叶绿素a 叶绿素b 叶黄素
6、实验注意事项
1、滤纸筒的大小要紧贴器壁，既能取放方便，其高度不得超过虹吸管；滤纸包油菜叶时要严密，纸套上面要折成凹形。
2、可以不用索氏提取器提取色素，可直接用萃取方法进行，但效率较低。
3、薄层板的制备是整个实验的关键，薄层应均匀且厚度固定。
4、点样时，必须待溶剂挥发后再重新点样。
7、参考文献
【1】果秀敏, 翟彤宇，牛延锋等，薄层色谱法分离菠菜叶片中色素的研究。河北农业大学学报，2000年4月，第23 卷第2 期
【2】马骏，王超，李秀妹等，绿色植物色素的提取和色谱分离。化工时刊，2009 年10 月，第23卷第10期。
【3】李好样，冯轶雪，菠菜色素的提取与分离。太原师范学院学报( 自然科学版)，2004 年9 月，第3 卷第3 期
【4】傅正生，薛华丽，王长青等，薄层色谱法和柱层析法分离兰州红心萝卜色素的研究。 食品科学，2004, Vol. 25, No. 6 ，49-52
【5】陈红兵, 张金桐, 李锐等，薄层色谱法分离叶色素实验技术的改进，实验室科学，2010年10 月，第13期第5 期。
【6】贾关荣，赵文恩，申红山等，西瓜中类胡萝卜素的柱色谱法分离分析，安徽农业科学，Jou rn al ofAnhu iAgr.i Sc.i 2008, 36( 20) : 8416- 8418, 8501
油菜中主要色素的提取和分离
1、实验目的
1）通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法；
2）通过薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理；
3）从油菜中提取出叶绿素、胡萝卜素、叶黄素等色素并加以分离。
2、实验原理
油菜，又叫油白菜，苦菜，是十字花科植物油菜的嫩茎叶，原产我国，颜色深绿，属十字花科白菜变种。油菜中含有蛋白质、脂肪、维生素、尼克酸等营养成分，还含有胡萝卜素、叶绿素、叶黄素等色素。
叶绿素a和叶绿素b为吡咯衍生物与金属镁的配合物；胡萝卜素是一种橙色天然色素，属于四萜类，为一长链共轭多烯，有α、β、γ三种异构体，其中，β异构体含量最多。叶黄素为一种黄色色素，与叶绿素同存在于植物体中，是胡萝卜素的羟基衍生物，较易溶于乙醇，在乙醚中溶解度较小。根据它们的化学特性，可将它们从油菜叶片中通过连续回流提取出来，并通过薄层色谱方法将它们分离开来。
胡萝卜素、叶绿素、叶黄素的结构式如图1：
索氏提取器如图2，其工作原理是：完成一次溶剂提取后，溶液被加热，挥发的溶剂经过冷凝管冷凝，重新进入提取的环境，开始新的一次提取过程；如此循环下去，直至停止提取。这比直接用溶剂回流提取省溶剂，也剩下了很多后期
去除溶剂的时间；但是要求提取物有比较好的稳定性。
薄层层析是快速分离和定性分析微量物质的一种极为重要
的实验技术，具有设备简单、操作方便而快速的特点。它是将固定
相支持物均匀地铺在玻片上制成薄层板，将样品溶液点加在起点
处，置于层析容器中用合适的溶剂展开而达到分离的目的。用此法
氏提取器分离时几乎不受温度的影响，可采用腐蚀性显色剂，而且可在高温
下显色，特别适用于挥发性小或在较高温度下易发生反应的物质，
样品袋同时也常用来跟踪有机反应或监测有机反应完成的程度。
柱色谱（柱上层析）常用的有吸附色谱和分配色谱两类。吸
附色谱常用氧化铝和硅胶作固定相；而分配色谱中以硅胶、硅藻土
和纤维素作为支持剂，以吸收较大量的液体作固定相，而支持剂本
身不起分离作用。吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大经过图
2活化的多孔性或粉状固体吸附剂。 当待分离的混合物溶液流过吸
附柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脱的速度也不同，于是形成了不同层次，即溶质在柱中自上而下按对吸附剂的亲和力大小分别形成若干色带，再用溶剂洗脱时，已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集；或将柱吸干，挤出后按色带分割开，再用溶剂将各色带中的溶质萃取出来。
3、实验仪器和试剂
仪器:烧杯、量筒(100 mL, 10 mL) 、抽滤装置、色谱柱、梨形漏斗、带胶塞的玻璃棒、锥形瓶、滤纸
试剂:硅胶, 羧甲基纤维素钠水溶液，中性氧化铝,乙醇( 95% ,分析纯) , 石油醚(60～90℃) ,正丁醇,新鲜的油菜叶
4、实验步骤
1、薄层板的制备
①湿板的制备（硬板）：可用于硅胶、聚酰胺、氧化铝等薄层板的制备，但最常用的是硅胶硬板。在烧杯中放入2g硅胶G，加入5～6 ml 0.5℅的羧甲基纤维素钠水溶液，调成糊状。将调制好的浆料倾注到清洁干燥的载玻片上，拿在手中轻轻的摇晃，使其表面均匀平滑，在室温下晾干后进行活化。
②干板的制备（软板）：多用于氧化铝薄层的制备。在一块5 cm ×15 cm 的边缘整齐的玻璃板上，撒上一层氧化铝，取一物品顶住玻璃的右端。两手紧握铺板玻璃棒两端，放在合适的位置，将两拇指指甲盖紧玻璃边缘，在玻璃板上平稳的移动涂布器进行涂布（厚度为0.2 ～0.3 mm），取下涂好薄层的玻璃板，置水品台上于室温下晾干。
2、薄层板的活化
将涂布好的薄层板置于室温晒干后，放在电热干燥箱内加热活化，活化条件根据需要而定。硅胶板一般在干燥箱中渐渐升温，维持105～110℃ 活化30 min。活化后的薄层板放在干燥器内保存待用。
3、样品的制备
将滤纸卷成圆筒状，其直径略小于索氏提取器提取筒的内径，一端用线扎紧。 称取一定量的新鲜油菜叶片, 剪碎。将新鲜油菜叶放入索氏提取器的滤纸筒中，在原地烧瓶中加入石油醚- 无水乙醇( 3：2, V/ V) 混合溶液,水域加热提取，直至提取器颜色较浅为止，待凝液刚刚虹吸下去时即可停止加热。将提取液转入分液漏斗, 分2 次加入等体积蒸馏水洗去水溶性物质及乙醇, 将含色素的石油醚层于暗处浓缩备用。
4、点样
先用铅笔在距薄层板一端 1 cm 处轻轻划一横线作为起始线，然后用毛细管吸取样品，在起始线上小心点样，斑点直径一般不超过2 mm 。若样品溶液太稀，可重复点样，但必须待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，造成扩散等现象，而影响分离效果。若在同一板上点几个样，样点距离应为 1。点样要轻，不可划破薄层。
5、展开
薄层色谱的展开，需在密闭容器中进行。如图 3 是薄层板在不同层析缸中的展开方式。为使溶剂蒸汽迅速达到平衡，可在展开槽内衬一滤纸。在层析缸中加入配好的展开溶剂，使其高度不超过1 cm 。将点好的薄层板小心放入层析缸中，点样一端朝下，浸入展开剂中。盖好瓶盖，观察展开剂前沿上升到一定高度时取出，尽快在板上标上展开剂前沿位置。晾干，观察斑点位置，计算 Rf值。
展开剂纱布
条
图3
纸薄层条
6、柱色谱分离
待色素全部进入柱体后, 在柱顶小心加1.5 cm 高度的洗脱剂
一9∶1( 体积比) 石油醚—丙酮, 然后在层析柱上面装一滴液
漏斗, 内装15 ml 洗脱剂, 打开上下两个活塞, 让洗脱剂逐滴放
出, 层析即开始进行, 用锥型瓶收集。 当第一个有色圈( 橙黄
溶剂色) 将滴出时, 取另一锥形瓶收集, 它就是胡萝卜素, 约用洗
脱剂40 ml。 用7∶3( 体积比) 石油醚—丙酮作洗脱剂, 绿色圈
沙层下端呈黄色,再加20 ml 洗脱剂洗脱, 颜色分层更明显, 但速度
附剂很慢, 总共用去洗脱剂约100 ml。 分出第二个黄色带, 它是叶芯层
黄素. 再用3∶1∶1( 体积比) 丁醇—乙醇—水作洗脱剂, 洗脱
叶绿素, 速度很快, 用洗脱剂约60 ml。
5、实验结果及要求
图4 柱色谱装置
序号
1
2
3
4 颜色 桔黄 蓝绿 草绿 黄色 色素名称 -胡萝卜素 R值 — — — — 叶绿素a 叶绿素b 叶黄素
6、实验注意事项
1、滤纸筒的大小要紧贴器壁，既能取放方便，其高度不得超过虹吸管；滤纸包油菜叶时要严密，纸套上面要折成凹形。
2、可以不用索氏提取器提取色素，可直接用萃取方法进行，但效率较低。
3、薄层板的制备是整个实验的关键，薄层应均匀且厚度固定。
4、点样时，必须待溶剂挥发后再重新点样。
7、参考文献
【1】果秀敏, 翟彤宇，牛延锋等，薄层色谱法分离菠菜叶片中色素的研究。河北农业大学学报，2000年4月，第23 卷第2 期
【2】马骏，王超，李秀妹等，绿色植物色素的提取和色谱分离。化工时刊，2009 年10 月，第23卷第10期。
【3】李好样，冯轶雪，菠菜色素的提取与分离。太原师范学院学报( 自然科学版)，2004 年9 月，第3 卷第3 期
【4】傅正生，薛华丽，王长青等，薄层色谱法和柱层析法分离兰州红心萝卜色素的研究。 食品科学，2004, Vol. 25, No. 6 ，49-52
【5】陈红兵, 张金桐, 李锐等，薄层色谱法分离叶色素实验技术的改进，实验室科学，2010年10 月，第13期第5 期。
【6】贾关荣，赵文恩，申红山等，西瓜中类胡萝卜素的柱色谱法分离分析，安徽农业科学，Jou rn al ofAnhu iAgr.i Sc.i 2008, 36( 20) : 8416- 8418, 8501