微卫星标记

鳗及其近交后代微卫星分子标记研究

RAPD指纹方面的初步研究，但采用微卫星分子标记进行分析的研究还相对较少。而微卫星分子标记方法在动植物育种上己经作为一种育种辅助标记广泛应用。

2遗传标记的发展及应用

遗传标记 (GelleticMarkers)是指与目标性状紧密连锁，同该性状共同分离可

以明确反映遗传多态性的生物特征，是基因型特殊的可识别的表现形式，它是生物分类学、育种学、遗传学和物种起源与进化等研究的主要技术指标之一。广义的遗传标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质，狭义的遗传标记概念只是指 DNA分子标记(Parke:。tal.，1998)。理想的遗传标记一般必须达到以下几个要求:

(1)具有高度的多态性;(2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合

和纯合基因型;(3)能明确辨别等位基因;(4)遍布整个基因组;(5)除特殊位

点的标记外，要求分子标记的位点均匀分布于整个基因组;(6)选择中性，即无基

因多效性;(7)检测片段简单、快速，实验程序易自动化;(8)开发成本和使用

成本尽量低廉;(9)在实验室内和实验室间重复性好，便于数据交换。但是，目前

发现的任何一种分子标记均不能满足以上所有要求(贾继增，1996;邱芳等，1998;

赵淑清等，2000)。遗传标记已作为一种辅助育种标记广泛应用于动、植物及其它领域。从不同层次水平上看，它可分为形态学标记、细胞学标记、生化标记、分子标记四种

2.1形态学标记

形态学标记(MO甲 hologicalmarkers)是指那些从表型上看显示遗传多态性的特

征，即生物特征，如鱼的体高、体长、体色等。由于形态学标记易观察、识别，因此它一直是选种、育种的重要标记，也是孟德尔遗传学创立的重要基础。由自发突变或物理化学诱变均可获得具有特定优良性状的形态特征，通过人工选育工作使那些优良胜状稳定遗传下来，从而达到选育的目的和效果，自上个世纪80年代，我国科研工作者就开始采用形态学方法对鱼类种质资源鉴定进行研究，李思发等(1990) 对长江、珠江、黑龙江鳞、墉、草鱼种质资源进行了调查和研究。但是形态学标记易受环境因素、自身发育、基因显隐性、形态学标记数量少等因素的影响，因此采用形态学标记进行研究所需要时间长，并且所得到的数据和结论不是非常准确可靠。因此，目前育种工作者通常采用其它的分子标记与形态学标记一起进行研究工作。

2.2细胞学标记

细胞学标记的研究目前通常是对细胞染色体组，染色体结构与组成，染色体数

目等方面的研究。细胞遗传学家发现染色体的变异会造成表型的变异，因而染色体

第一章文献综述

1引言

鲍(场，咖thalmichthx:molitr动属鲤形目，鲤科，鳝亚科，是我国四大家鱼

之一，广泛分布于黑龙江、长江和珠江流域，它具有食物链短、易饲养、成本低和能调节水质等优点，是我国淡水养殖的主要对象。近年来，由于环境污染和缺乏科学的保种，制种，造成鲍生长缓慢，抗病力差及其它优良性状严重退化。因此，获得抗病力强、生长快等具有优良经济性状的鲍新品系在养殖过程中成了首要任务。但是由于维性成熟时间长，一般需要3~4年，采用常规选育方法需要很长时间才能达到选育目的。雌核发育技术能快速建立纯系，要构建一个纯系只需要连续3~4代的单性发育世代就可以了。因此采用人工雌核发育技术选育优良品种不但可以节省时间，而且可以节约大量的人力，物力和财力。

中国水产科学研究院长江水产研究所自1987年就开始了对鲍的人工雌核发育研

究，以长江鳃为原始选育材料，迄今为止，已经连续诱导出了三代雌核发育维(潘光碧，1988;潘光碧等，2004)。并在对人工雌核发育鲍与养殖鳞的形态学进行比

较研究中发现，雌核发育鳞的生长性能优于普通维:在相同生长条件下，雌核发育鳝比标准鳃体重大10.6%~31.9%，平均大巧.6%;雌核组比普通鲍组体长增长快

3.7%~25.3%，体重增长快6.7%~90.1%。罗相忠等(2003)以雌核发育鳝各系与普

通维进行生长对比实验，表明雌核发育鲍比普通鲍生长快，而且体型也比普通鲍肥厚。这些研究结果证明:雌核发育鲍的生长性能优于普通鳗，这给选育工作带来了很大的潜力，同时也给选种育种工作者带来了希望。

人工雌核发育是采用人工操作方法促使失活的精子进入卵内与卵子结合，精子

不参与遗传，只起诱导作用，卵子完全在雌核控制下发育成子代，子代的遗传物质全部来自母本，因此雌核发育产生的后代全部为雌性，只具有母本的性状。但是由于人工操作，自然因素等其它因素的影响，人工雌核发育产生的后代出现少量雄性个体。邹桂伟等(2004)用RAPD方法对人工雌核发育鳞遗传多样性分析发现雌核

发育鳝后代含有少数与父本相同的特异性带，而母本没有。张海发等(1995)对异

精激发彭泽螂雌核发育产生的子一代及双亲进行RAPD分析，发现异育彭泽螂子一代中含有少数与父本相同而与母本相异的特异条带。尖鳍鲤、须螂激发产生的异育彭泽螂后代与彭泽螂母本相似率分别为94.96%、94.70%;与尖鳍鲤、须螂父本相似率分别为23.46%、21.05%。结果表明，从基因水平检验，彭泽螂已不再是完全的母性遗传，异育彭泽螂基因组DNA中可能带有部分异源父本基因组DNA。对雌核发育维的研究，从遗传学角度来看，有助于了解雌核发育机理，了解群体遗传结构和遗传多样性情况。目前对雌核发育鱼类的研究比较多，有形态学、同工酶、蛋白质、华中农业大学2007届硕士学位论文

变异情况可以做为一种分子标记，可确定与性状相连锁基因所在的染色体和位置。最常用的方法就是对染色体核型分析，由于不同物种在染色体数目和结构存在差异，从而造成细胞学标记具有丰富的多态性。近年来，由于染色体显带技术与分子杂交技术的发展，使染色体变异分析发生了很大的突破，对生物体进行核型分析的研究也越来越多。由于细胞学标记不受环境因素的影响，进化比较保守，因此细胞学标记广泛应用与生物起源和进化、系统分类、遗传多样性等方面研究。但是由于它进化保守，变异缓慢，造成细胞学标记数目有限，因此找出多的细胞学标记需要大量的材料，需要花费大量的人力和财力进行培育材料，而且对一个物种单纯采用细胞学标记研究得出遗传多样性数据不是很准确。Dai等(1989)对对虾染色体组型分析发现，对虾染色体大多是中部、亚中部着丝粒染色体，少数是亚端部着丝粒染色体。

2.3生化标记

生化标记 (Biochemicalmarkers)指采用电泳技术对生物大分子如蛋白质、酶进

行分析的一种方法，由于不同种、属具有不同的基因型，从而在蛋白质水平反映生物的多样性。它主要是指同工酶标记，同工酶是指具有同一功能但具有不同分子形式的一类酶，具有组织、发育及物种的特异性。其基本原理是根据电荷性质及分子量的差异，利用蛋白质电泳和专门的染色反应显示出同工酶的不同形式，由于同工酶是基因的产物，生物在长期的进化过程中，基因在不断发生突变，从而造成该基因编码的蛋白质中氨基酸数目和结构的改变，进而在电泳中出现相对迁移率不同的条带，形成各种不同的酶谱，从而鉴别出不同的基因型(胡能书等，1985)。由于

其能稳定遗传、杂合体共显性、等位基因及基因频率可以直接计算、易于操作等特点，广泛应用于物种遗传多样性，遗传图谱构建，亲缘关系鉴定，基因定位，种质鉴定等领域研究。李思发等(1990)对长江四大家鱼原种的10种同工酶的电泳分析

表明，青鱼、草鱼、鳞、缩的乳酸脱氢酶(LDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)及超氧

化物歧化酶 (SOD)条带清析稳定，重复性稳定，可以采用这几种同工酶谱作为四大家鱼种质鉴定标准。众ut等(1999)用四种酶(葡萄糖磷酸变位酶、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸磷酸酶和葡萄糖异构酶)来检测22个欧洲鳌龙虾不同种群的遗传变异，结果发现，这些群体之间变异程度较大。邹桂伟等(1997)对大口站和贴鱼4种组织酷酶(EST)和苹果酸脱氢酶(MDH)比较研究发现其均能特异性表达且存在物种特

异性，有些特异性条带可以作为区分这两个品系的同工酶标记。但是由于同工酶标记只能检测到编码蛋白质的基因，对不编码蛋白质的基因无法检测，可利用的标记数目较少，同时实验结果受个体发育的影响，因此其应用受到一定程度的限制。周裕华人工雌核发育鲍及其近交后代微卫星分子标记研究

2.4分子标记

分子标记技术是继形态学标记、细胞遗传学标记、生化标记后的一种新型标记

技术，实现了从表型选择到基因型选择的飞跃。20世纪80年代以来，随着分子生物学的快速发展，DNA重组技术的日趋完善，特别是PCR扩增技术和新的电泳技术的产生，使各种分子标记应运而生如:RApD、RFLP、SSR、AfLp等，由于分子标记具有:直接以DNA的形式出现;不受环境和其它因素的影响;多态性丰富;表现为

中性标记;有许多分子标记为共显性;有些分子标记所需样品量少能够用来分析微

量DNA和古化石等优点，因而广泛应用在生物起源进化、亲缘关系、基因图谱构建等各个领域研究。

2.4.1RFLP

20世纪80年代，遗传学家Boestein发现了第一个DNA分子水平上的遗传标记，即限制性片段长度多态性 (restdctionrra脚 entlengthpolymo印hism，RFLP)，其基本原理是利用限制性内切酶酶切不同个体基因组DNA后，产生不同长度的片段，再与同位素或非同位素标记的探针杂交，从而显示与探针含同源顺序的酶切片段在长度上的差异。由于所检测的DNA序列中的碱基发生替换、重排、缺失、插入等，导致限制性酶切位点的改变，产生限制性片段的差异性，其为限制性片段多态性的原因。 RFLP标记呈孟德尔遗传、不受环境因素影响、是一种共显性标记、重复性好等这些优点使RF廿标记广泛应用于生物体间的遗传变异度分析、亲缘关系、遗传图谱构建，物种起源与进化分析。在鱼类种质的研究中，目前多是进行mtDNA酶切，检测其多态性。Knox等(1991)利用限制性片段长度多态性方法对养殖与野生的大西洋蛙群体的mtDNA酶切分析，从来区分这两个种群。单淇等(2006)采用RFLP分子标记对采自江西瑞昌、湖南长沙的天然缩鱼群体以及天津宁河的人工繁殖缩鱼群体进行研究发现，缩鱼瑞昌群体和长沙群体可能是两个隔离的独立群体，亲缘关系比较远。但其多态性与选用的内切酶有很大的关系，同时操作复杂，所需成本较高;另外，

进行mtDNA的RF廿分析，由于mtDNA呈母性遗传方式，检测不到父本的遗传信息，因此，其应用也存在一定程度的限制。

2.4.2RAPD

随机扩增片段长度多态性标记 (RandomlyAmplifiedpolymo印 hieDNA)即

RApD。RApD技术由Winiams和Welsh首先提出，是利用一个随机序列的寡核普酸作引物，通常为10个核昔酸，以生物的基因组DNA作模板进行PCR扩增反应，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、染色来检测DNA变异，由于基因中碱基片段发生丢失，突变等因素造成扩增序列在长度大小方面发生改变，从而造成扩增产物的多态性

华中农业大学2007届硕士学位论文

变异情况可以做为一种分子标记，可确定与性状相连锁基因所在的染色体和位置。

最常用的方法就是对染色体核型分析，由于不同物种在染色体数目和结构存在差异，从而造成细胞学标记具有丰富的多态性。近年来，由于染色体显带技术与分子杂交技术的发展，使染色体变异分析发生了很大的突破，对生物体进行核型分析的研究也越来越多。由于细胞学标记不受环境因素的影响，进化比较保守，因此细胞学标记广泛应用与生物起源和进化、系统分类、遗传多样性等方面研究。但是由于它进化保守，变异缓慢，造成细胞学标记数目有限，因此找出多的细胞学标记需要大量的材料，需要花费大量的人力和财力进行培育材料，而且对一个物种单纯采用细胞学标记研究得出遗传多样性数据不是很准确。Dai等(1989)对对虾染色体组型分析发现，对虾染色体大多是中部、亚中部着丝粒染色体，少数是亚端部着丝粒染色体。

2.3生化标记

生化标记 (Biochemicalmarkers)指采用电泳技术对生物大分子如蛋白质、酶进

其能稳定遗传、杂合体共显性、等位基因及基因频率可以直接计算、易于操作等特点，广泛应用于物种遗传多样性，遗传图谱构建，亲缘关系鉴定，基因定位，种质鉴定等领域研究。李思发等(1990)对长江四大家鱼原种的10种同工酶的电泳分析表明，青鱼、草鱼、鳞、缩的乳酸脱氢酶(LDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)及超氧

异性，有些特异性条带可以作为区分这两个品系的同工酶标记。但是由于同工酶标记只能检测到编码蛋白质的基因，对不编码蛋白质的基因无法检测，可利用的标记数目较少，同时实验结果受个体发育的影响，因此其应用受到一定程度的限制。周裕华人工雌核发育鳗及其近交后代微卫星分子标记研究

2遗传标记的发展及应用

遗传标记 (GelleticMarkers)是指与目标性状紧密连锁，同该性状共同分离可

(1)具有高度的多态性;(2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合

和纯合基因型;(3)能明确辨别等位基因;(4)遍布整个基因组;(5)除特殊位

点的标记外，要求分子标记的位点均匀分布于整个基因组;(6)选择中性，即无基

因多效性;(7)检测片段简单、快速，实验程序易自动化;(8)开发成本和使用

成本尽量低廉;(9)在实验室内和实验室间重复性好，便于数据交换。但是，目前

发现的任何一种分子标记均不能满足以上所有要求(贾继增，1996;邱芳等，1998;

2.1形态学标记

形态学标记(MO甲 hologicalmarkers)是指那些从表型上看显示遗传多态性的特

2.2细胞学标记

细胞学标记的研究目前通常是对细胞染色体组，染色体结构与组成，染色体数

目等方面的研究。细胞遗传学家发现染色体的变异会造成表型的变异，因而染色体 1引言

鲍(场，咖thalmichthx:molitr动属鲤形目，鲤科，鳝亚科，是我国四大家鱼

中国水产科学研究院长江水产研究所自1987年就开始了对鲍的人工雌核发育研

较研究中发现，雌核发育鳞的生长性能优于普通维:在相同生长条件下，雌核发育鳝比标准鳃体重大10.6%~31.9%，平均大巧.6%;雌核组比普通鲍组体长增长快

3.7%~25.3%，体重增长快6.7%~90.1%。罗相忠等(2003)以雌核发育鳝各系与普

人工雌核发育是采用人工操作方法促使失活的精子进入卵内与卵子结合，精子

发育鳝后代含有少数与父本相同的特异性带，而母本没有。张海发等(1995)对异

精激发彭泽螂雌核发育产生的子一代及双亲进行RAPD分析，发现异育彭泽螂子一

代中含有少数与父本相同而与母本相异的特异条带。尖鳍鲤、须螂激发产生的异育彭泽螂后代与彭泽螂母本相似率分别为94.96%、94.70%;与尖鳍鲤、须螂父本相似率分别为23.46%、21.05%。结果表明，从基因水平检验，彭泽螂已不再是完全的母性遗传，异育彭泽螂基因组DNA中可能带有部分异源父本基因组DNA。对雌核发育维的研究，从遗传学角度来看，有助于了解雌核发育机理，了解群体遗传结构和遗传多样性情况。目前对雌核发育鱼类的研究比较多，有形态学、同工酶、蛋白质、华中农业大学2007届硕士学位论文

(WilliamsetaL， 1990;Welshetal.，1990)。RApD分子标记技术最大优点在于:(1) 快速简便，随机设计引物;(2)经济实用，用一个引物就可扩增出许多片段，检测

灵敏、方便、多态性强;(3)该项技术无须预先了解基因组DNA序列，对模板DNA 需求量少，且可用引物数多;(4)不受环境因素的影响，且呈显性遗传等。由于它

具有诸多优点，近年来该技术在陆生动植物的研究中已被广泛应用(王文等，1994; 兰宏等，1996;周喻萍等，1994;汪小全等，1996;惠东威等，1996)。刘萍等(2000)

采用RAPD分子标记对中国对虾黄渤海沿岸群亲本及子一代分析，并比较了两个家系的遗传差异，研究结果进一步证实，子代之间的遗传距离比其父、母与子代之间更小，遗传变异程度更低。对雌核发育鱼的RApD研究也很多，张桂蓉等(2005)

采用RAPD技术对两个人工雌核发育系鳞近交Fl遗传多样性研究中发现的两个人工雌核发育鲍近交FI个体后代具有很高的遗传相似度，保持较高的纯度。邹桂伟等 (2004)采用RApD技术对连续二代人工雌核发育鲍的遗传多样性及异源遗传物质

的整入进行了分析，结果表明:一代雌核发育鲍，个体间遗传相似度为0.945~0.9956，多样性指数为0.175;二代雌核发育鲍，个体间遗传相似度为0.9615~1.000，平均为 0.98犯，多样性指数为0.062。研究揭示经过连续二代人工雌核发育后，其遗传多样性明显减少，种质进一步纯化。通过对雌核发育鲍二代、亲本鳝和雄鲤的RAPD扩增比较，发现雌核发育鲍含有少数与父本相同的特异DNA扩增带，而亲本鳝没有，在基因水平上表明雌核发育鳞整入了雄鲤的遗传物质。周莉等(2003)采用RAPD

分子标记对两个人工雌核发育鲍家系进行分析表明，两个群体内个体间遗传相似度高，但是两个群体间遗传距离较远，遗传相似度较低。RAPD分子标记与其它分子标记相比有其自身的优点，但也有其缺点:重复性差、可比性不强等，因而，限制其在动植物方面的广泛应用，如采用与其它技术相配合可以克服那些不足。

2.4.3AFLP

AFLP(AmplifiedFragmenLengthPolymorphism)即扩增片段长度多态性，该技

术是zebean和Vos等(1995)发明的一项技术，其原理是将DNA进行限制性酶切，再将特定的接头连接在酶切片段的两端，形成一个带接头的特异性片段，以此为模板，以接头序列和限制性内切酶的切点序列为基础设计引物，进行PCR扩增，接着在有高分辨的测序胶上分开这些扩增产物，用放射法、荧光法或银染染色法均可检测之。这种技术又称为“选择性限制性片段扩增” (v05etal.，1995)。其特点是:信息量大、多态性丰富、灵敏度高、显性遗传，不需预先知道所研究生物的遗传背景，既克服了RFLP技术复杂、RA卫D稳定性差、标记呈显隐性遗传的缺点，同时又兼有两者之长，但是采用的成本高，操作没有RAPD简便。AFLP分子标记同其它分子标记一样，在遗传多样性，亲缘关系，进化分析等方面广泛应用。王志勇等(2002)

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其成本高，一般实验室很难开展这方面的研究。目前，SNP最主要的检测技术是基因芯片技术。基因芯片技术是指将许多特定的，长度不一的寡核昔酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，形成DNA微阵列，然后与待测标记样

品的基因进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，应用计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而快速获得所要的生物信息 (StiPP，1997)。

3微卫星分子标记在水产遗传育种中的应用

微卫星分子标记和传统的血型，蛋白质及同工酶以及RFLP，RA卫D，AfLP等其它标记相比具有许多优点:按孟德尔方式分离、呈共显性遗传方式、高度多态性、

引物通用性较强、操作简单、重复性强、不受环境、生长发育和年龄等因素的影响，等等。因此在遗传多样性分析、遗传连锁图谱的构建、种质鉴定和遗传育种，亲缘关系、Q几定位等方面广泛应用。目前，鱼类微卫星DNA的分离和构建在发展很快，已研制出大量的包括大西洋蛙(Salmosala;)、虹蹲(Oncorhychusmy无沽S)、大西

洋鳍鱼(俞血:mo动ua)、罗非鱼(。r己口认romis脚)、鲤鱼(匀， rinusea，io)、

鳝(双沙 othalmichthysmolitr众 )(LiaoetaL，2007)、扇贝(Plae叩 ectemmagellanieus)、宽帆鳄 (PoecilialatiPinna)、棘胸鱼(万叩 lotehusatlanticus)、大鳞大麻哈鱼

(Oncorhynchustsha””声tch。)、三棘刺鱼(Gasterosteusac“leatus)、牙鲜(Paralic材妙s 口左v口ceus)、中国对虾仔乞儿 neroPenaeuschinensis)(刘萍等，2004)和斑马鱼

(Brachydaniorerio)(杜长斌等，2000)、大菱鲜你叩人 thalmusmaximus)(pardoer

al.，2005)、晶裙 (Sebastesrastrelliger)(westermanetal.，2005)等多种海水和淡

水动物的微卫星标记，其中罗非鱼的微卫星DNA座位己达到60多个(o’co皿ell。t。l.， 1997)，并对虹蹲(William。 tal.， 1998;Sakamotoetal.，2000)、斑马鱼和尼罗罗非鱼 (Thomasetal.，1998)、鲤鱼(孙效文等，2000)构建出了以微卫星为主的遗传

连锁图谱。

3.1遗传多样性分析

由于SSR的多态性丰富，分辨率高，条带清晰，因此广泛用于种群鉴别和遗传

多样性分析。梁利群等(2004)等利用微卫星分子标记技术对乌苏里江哲罗鱼遗传

多样性的分析结果表明，乌苏里江哲罗鱼等位基因频率为0.0455一0.7857，多态信息含量(PIC)为0.2801~0.6351，杂合度(H)为0.3368一0.6563。初步表明乌苏里江

哲罗鱼的遗传多样性程度处于中等偏下水平。同时，结合资源量下降的事实，建议在保护遗传多样性的前提下对其采取人工繁殖和放流的方法增加。McConnel等

(1995)利用微卫星技术研究了加拿大东海5个大西洋鲜群体的遗传多样性和群体结周裕华人工雌核发育鳝及其近交后代微卫星分子标记研究

构。廖小林等(加05)利用已发表的鲤微卫星引物对长江水系草鱼遗传多样性分析，结果有5对引物(6个座位)能成功扩增并且有较高多态性，等位基因数在3~7个之间。遗传距离分析表明四川群体与洞庭湖群体遗传距离最远，而嘉鱼群体与都阳湖群体遗传距离较近。鲁翠云等(2005)采用磁珠富集法筛选了鳃的微卫星分子标记，获得微卫星序列138个，通过软件设计引物81对。Liao等(2006)设计了22对微卫星标记引物并用来分析了在长江荆州段捕获的32尾野生维和7尾野生墉的遗传多样性。

3.2遗传连锁图谱的构建

微卫星引物具有通用性强的特点，根据微卫星两端的保守序列设计的引物可以

扩增同一物种或不同物种的微卫星片段，使不同种动植物比较遗传图谱构建成为可能，微卫星标记的呈共显性，多态性丰富，因此作出的遗传图谱覆盖面比较广。 Posilethwait等(1998)利用微卫星分子标记以单倍体遗传法绘制了斑马鱼的图谱。

到目前为止，己建成的鱼类微卫星图谱还有虹蹲、尼罗罗非鱼和鲤鱼(孙效文等， 2000)等。

3.3亲缘关系和种群鉴定

微卫星分子标记技术与其它标记相比更能得出可靠、准确的数据。借助分子遗

传标记技术，通过物种群体遗传结构和多样性分析进行分子遗传图谱的构建、物种演化和亲缘关系等方面的研究，可以得出它们之间的亲缘关系，能够对不同物种进行精确的系统学区分，并能精确地确定物种的进化途径和分类学地位。刘萍等(2004) 根据建立的中国对虾部分基因组文库，对筛选的含微卫星序列的克隆设计了引物，并选择了8对多态性引物对中国对虾进行了PCR扩增电泳，结果得出中国对虾黄渤海群体、朝鲜半岛西海岸群体和朝鲜半岛南海岸群体3个野生群的亲缘关系的远近。董仕等(2003)应用微卫星DNA检测技术，鉴别出了纯合种、雌核发育二倍体、与海产香鱼的杂交种和混入本克隆的其它种。周莉等(2001)应用微卫星分子标记对雌核发育银卿遗传多样性研究，反映了不同系之间的亲缘关系，并鉴定出可有效区分这几个雌核发育系的分子标记。Jefteys等(1985)用southem杂交获得DNA指纹图谱: 应用人类卫星DNA核心序列为探针，与不同物种的高度可变区(即重复DNA)杂交，能够识别多个微卫星DNA位点，显示出较高的灵敏度，从区分不同的个体，因此表明利用此方法可以进行个体鉴别和家系鉴定。Alderson等(1999)用微卫星标记对褐头牛鹏进行了亲子鉴定，成功地为43只遗传关系未知的幼鸟确定了父母。

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3.4辅助鱼类遗传育种

遗传育种的目的就是选育出生长快且体型大，肉质好，抗病强等优良的品种，

传统育种采用形态标记进行选育，采用传统的选育方法，周期长，准确性差，对低遗传力的性状选育效率低，需要消耗大量的人力、物力和财力。而采用分子标记辅助选择的方法却可以克服那些缺点，准确的选育出优良的新品种。采用微卫星分子标记技术分析繁育群体遗传背景，了解遗传变异的大小，从而制定科学的管理措施，防止人工繁殖过程中进行遗传背景相似品系交配所造成遗传多样性下降，使那些与优良胜状相关的基因丢失，造成优良品质的逐步退化。因此，分子标记辅助育种是育种计划中的有力工具。近10年来国际上遗传育种研究趋向与分子标记相结合的分子标记辅助育种。另外，通过人工雌核发育选育，能够快速获得纯系，采用微卫星分子标记技术研究雌核发育群体，从分子水平上揭示遗传机制和它们的遗传背景，从而快速选育出具有好的表型特征的新品系。刘静霞等(2002)利用包含CA重复单元的普通鲤鱼(O尹 rinuscarpio)的8个微卫星DNA标记，对从锦鲤(O， rinuscarPio L.)的红白、大正与昭和3个不同品系中所获得的4个不同人工雌核发育家系的20尾个体进行PCR扩增，对锦鲤不同人工雌核发育家系进行比较分析，以此评价人工雌核发育的效果，探讨锦鲤色斑遗传多样性的机制，所鉴定的微卫星标记成为进行锦鲤分子标记育种的有用工具。

3.5用于QTL定位方面研究

Q几定位即确定控制生物表型性状的QTL在基因组上的位置，包括制作遗传图谱，物理图谱等，在此基础上进行标记辅助育种是各国育种学家研究的热点，在育种领域中有广泛的前景。由于微卫星广泛分布在基因组中，且多态性丰富等特点，因此采用微卫星分子标记进行QTL定位是最理想的工具。Avner等(2003)采用微卫星分子标记对两个不同品种的罗非鱼杂交FZ代中影响抗寒和体型大小的两个QTL的定位。

4人工诱导雌核发育

4.1人工诱导雌核发育原理

雌核发育是鱼类一种重要的单性生殖方式，与孤雌生殖、两性生殖不同，雌核

发育过程中需要近缘种精子进行激发卵子发育，但精子只起激活卵子作用，是一种

无融合或假配合的生殖方式(葛伟等，1989)。最早在鱼类上发现了雌核发育现象的是Hubbe等(1932)在墨西哥湾河流中发现的天然雌核发育的鱼类美洲的阿马逊花鳄(美洲鳄 )(Poeciliaformosa)，随后对银卿的细胞学研究以及Kanman在美洲帆周裕华人工雌核发育鳝及其近交后代微卫星分子标记研究

对福建官井洋大黄鱼野生种群和2个养殖群体进行5对选择性引物(共37个标本)的舒LP分析，结果表明养殖群体的遗传多样性水平较低，遗传变异相对贫乏。Chong 等(2000)运用AFLP和RAPD技术研究了来自5个地区的鳃鱼的遗传变异，其中4组 158个AFLP标记、9组42个RAPD标记，这些标记可对各种鳃鱼进行分类及鉴定，分析表明AFLP比RAPD更能有效地分析基因型。

2.4.4微卫星分子标记

微卫星(Mierosatellite)分子标记是继RFLP技术之后的第二代分子标记技术。

Skiimer等(1974)便在寄居蟹中发现了这种短重复序列，1986年Ali等人首次用合成的微卫星寡核普酸作为探针用于人的DNA指纹分析。Jeffreys等(1988)进一步研究并发展成为新的DNA分子标记系统。

微卫星(microsatellite)又称简单序列重复 (Simplese明 eneerepeats，ssR)、短

串联重复 (shorttandemrepeats)、简单序列长度多态性 (Slinplese叨 eneelength polymo印hisn，55廿)，是由核心序列 (eoresequenee)和两端侧翼序列构成，一般

长几十至几百个bP。核心序列为1一6bp的核着酸序列多次串联重复序列，而两端的侧翼序列是相对保守的单拷贝序列。由于核心序列中重复次数不同及重复程度不同而造成了每个基因座上等位基因的多态性。微卫星分子标记是在PCR基础上发展起来的新的分子标记技术，在应用中可以根据两端侧翼保守序列设计一对引物，经PCR 扩增，琼脂糖或聚丙烯酞胺凝胶电泳后，即可显示出不同基因型个体间的多态性和特异性。Tautz等(1989)报道了微卫星广泛存在于真核生物中，且具有丰富的多态性。关于它具有多态性的产生机理，可能是由于DNA复制和修复过程中滑动错配或染色体单体不均等交换的结果(孙乃恩，1990)。它可提供分辨率可达一个碱基对差异的信息，且等位基因的条带容易识别和解释，比当前所有的分子标记带来更多的信息量和更可靠的信息质量，是一种用途广泛的分子标记。微卫星分子标记与其它标记相比，具有许多方面的优点:标记数量多，广泛存在于整个基因组;重复性好，稳定性强;呈共显性遗传方式，多态性丰富;对DNA的质量要求不高等。

2.4.5单核昔酸多态

单核普酸多态(SNP)被称为第三代遗传作图DNA分子标记，其原理指在基因

组DNA水平上由于单个核普酸的变异引起的DNA序列多态性，是由于单碱基的转换、颠换、插入及缺失等造成的(orosse。t。1.， 1999:Thorissonetal.，2003)。它具有标记数量多、多态性丰富、分布广等特点很受研究工作者的喜爱，广泛应用于基因作图，基因定位等方面的研究。由于其可以检测到基因中每个核普酸的变异情况，因此在基因诊断，疾病基因定位分析，基因治疗方面的研究有广泛的前景，但由于周裕华人工雌核发育鲍及其近交后代微卫星分子标记研究

鱼中进行的组织移植技术实验都进一步证实了雌核发育的现象(杨桂军等，加04)。目前研究发现自然界中天然雌核发育的鱼类有:银螂 (Carssiusauratusgibelio)，关东系银螂 (Cauratuslan岁d娇i)，银汉鱼 (Menidiaclarkhubbsi)，胎生贝湖鱼

(comePhoru:baicolensis)等种类。天然雌核发育鱼类的共同特征是:产生的卵子

具有与母本完全相同的染色体组型;卵子需经与近缘种的雄性精子受精刺激开始发育;产生的后代与母本性状相同。鱼类雌核发育主要涉及两个重要机制，一、染色体倍性的保持机制;二、在受精细胞学上，精卵遗传物质是否发生融合。目前对这

方面的研究有了共同的认识，在染色体倍性方面主要有以下几种方式:(1)减数分裂前核内发生有丝分裂而形成染色体多倍化，而胞质不分裂，并连接进行一次染色体复制，如三倍体花鳄属(Cimino。 tal.，1972)。(2)省略了第一次减数分裂，如日本银螂;或者有的雌核发育鱼类卵子基本上不发生减数分裂。(3)减数分裂照常进行，但第一次卵裂为核内有丝分裂而二倍化，无细胞质分裂，如二倍体雌核生殖银螂(周嘉申等，1983)。(4)第二极体不排出并与雌性原核结合。(5)减数分裂

前排出父本染色体组，如二倍体花鳄属(Cherfa:。 tal.，1966)。在受精细胞学方面，一般认为:精核始终受到抑制而不能形成雄性原核，保持固缩状态，直至保持到准备第一次分裂前。精核在银鲤卵质中不能形成雄性原核是由于银螂卵质促使精核核膜解体的功能异常，使覆盖精子头部的核膜不能像两性融合受精卵子那样进行崩解，所以精核不能进一步发育成雄性原核(俞豪祥，1982;崔悦礼，1982;周嘉申，1983)。而桂建芳等(1995)在三倍体银螂人工繁殖群体中发现了极少数的异源四倍体异育银螂。这一现象说明，在特定的条件下，精核有可能发生解凝，参与发育过程。蒋一硅等(1983)在利用异源精子对银鲤进行雌核发育，发现子代性状发生了明显的生物学效应，由此提出了“异精效应”。邹桂伟等(2004)用RApD方法对雌核发

育维研究发现雌核发育子代存在有和对照鲤相同的带，而在母本中不存在的带，因此认为可能存在“异精生物学效应”。

4.2人工诱导雌核发育

随着对雌核发育机理的研究，人们对天然雌核发育的机理有了全面的认识，开

始提出了人工诱导雌核发育，即进行精子处理使其遗传物质失活、再用遗传失活的精子人工诱导卵子发育，随后诱导被激活卵的染色体二倍化，从而实现两性繁殖物种的雌核发育。根据天然雌核发育原理，人工雌核发育需要解决两个重要问题:一、精子遗传物质失活，与卵子受精，刺激卵子发育;二、染色体加倍，实现正常发育。周裕华人工雌核发育鳝及其近交后代微卫星分子标记研究

第二章人工雌核发育第三代鳞遗传多样性的微卫星分析

目前对鳝的研究有形态学、同工酶、mtDNA等方面的研究，对雌核鳞的研究也

有形态学、同工酶、RAPD等方面的研究，但是还没有对雌核发育鳝及其近交几进行微卫星研究的报道。本研究采用12对具有多态性的鳞微卫星引物对人工雌核发育鲍进行遗传多样性分析，并以养殖鲍、野生鲍和雄鲤做对照，进一步分析它们的遗传特征及差异，寻找特异性分子标记，进一步探讨雌核发育机理，同时为开展优良品种选育及品种保存提供理论依据。

1方法

1.1实验材料

长江野生鲍雌鱼产出的卵，与经紫外线照射遗传灭活的鲤鱼精子“受精”，通过抑制第二极体排出，成功诱导出5000多尾存活雌核发育二倍体鲍鱼苗(潘光碧， 1988)，经养殖和自然淘汰，培育成性成熟的第一代雌核发育鳝(简称 GSCGl)200 尾;19%年从中选取2尾性成熟的第一代雌核发育维，采用同样方法，进行第二次雌核发育诱导，获得第二代雌核发育维3000尾(简称 GSCGZ)，并培育至性成熟; 2000年从第二代雌核发育鲍性成熟个体中选择1尾性状更优的个体，再进行第三次雌核发育诱导，获得第三代雌核发育维鱼苗3500尾，经养殖和自然淘汰，培育成性成熟的第三代雌核发育鳃120尾(简称 GSCG3)，从中随机取GSCG3个体22尾，(编号为 GSCG3i一22其中 GSCG38，GSC场22为雄个体，由于GSCG;是由长江野生维卵子经雄鲤的灭活精子诱导，进行雌核发育而产生的后代，因此本实验选取采自湖北石首市江段的野生鳝7尾，荆州人工繁殖的普通鲍30尾和雄鲤10尾为对照组。

长长江野生鲍鲍

第第一代雌核发育鲍 (GscGl)))

第第二代雌核发育鳝 (GSCGZ)))

第第三代雌核发育鲍 (GSCG3)))

图2.1雌核发育鳞场材料来源示意图

Fig.2.1ThesourceofartifieialgynogeneticSilverCarpG3

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为构建维鱼SSR遗传连锁图谱及QTL定位奠定了基础;(4)为尽快建立纯系提供分子依据。(5)为开展种质保存、品种选育、品系评估、品系鉴定及其开发利用等具有重要的意义。

6本研究的总体设计和技术路线

本研究采用Uao等(2007)筛选出来的鲍微卫星引物，对人工雌核发育鲍及其

近交凡与养殖鲍、野生鲍、雄鲤进行微卫星分析，进一步分析它们的遗传多样性，群体间的遗传变异及亲源关系，试图寻找群体特异性分子标记，深入探讨雌核发育机理，同时为开展优良品种选育及品种保存提供理论依据。整个实验技术路线见图

1.1。

实验鱼样的采集

丰

雌核发育鲍，普通鳝，长江鳝，普通鲤

的DNA的提取

DNA浓度的检测

选取合适的鳝微卫星引物作为

扩增样品鱼的微卫星引物

确确定合适浓度的 DNAAA

为为模板 DNAAA

PCR扩增

聚聚苯烯酞胺凝胶电泳泳

照照相，微卫星分析，数据统计计

图Ll本研究技术思路

Fig.1.1Thetechniealrouteoftheresearch

周裕华人工雌核发育鲍及其近交后代微卫星分子标记研究

子激活卵子，启动卵子的发育后，阻止卵子的第二次成熟分裂，抑制第二极体的排出，从而使染色体加倍。通过抑制第二极体的排出实现雌核发育已有许多成功的例子(thssen。t。l.，1990)，经这种方法处理产生的雌核发育子代个体的基因型是高度纯合的，但少数个体存在杂合型。由于卵子在第一次减数分裂时，同源染色体之间发生了交换，所以不能产生纯系。第二种方法是抑制卵子的第一次减数裂，让第二极体排出，这种方法处理产生的雌核发育子代个体的基因型是完全纯合的，所以经过两代雌核发育就可以获得遗传背景完全一致的纯系，streisinger等(1981)采用

静水压法和热休克法抑制第一次卵裂。最早获得纯合的人工雌核发育斑马鱼。

4.3人工诱导雌核发育的意义

人工诱导鱼类雌核发育在育种上有很重要的意义，一、可以快速建立纯系，加快

育种步伐，采用传统育种方法构建一个纯系需要经过几代杂交，几代近交才能完成，但采用雌核发育方法构建一个纯系只需要连续3~4代的单性发育世代就可以了，这相当于10代同胞交配(刘祖洞，1991)。二、可以稳定优良性状，淘汰劣质基因，采

用雌核发育可以提高鱼类的优良形状如生长快，抗病能力强等。罗相忠等(2003) 以雌核发育鳞各系与普通鳝进行生长对比实验，发现雌核鳝生长速度比普通维快。

三、进行性别控制，有些鱼类不同性别、个体具有的性状不一样，如体色、长度等，同时生长速度，抗病能力等优良性状也有所不同，因此可以采用雌核发育进行人工选育，筛选具有优良性状的品种。四、在理论基础研究方面也很重要，如进行家系分析，生物发育机制研究，染色体核型分析等;由于采用雌核发育可以加快育种速度，染色体简单化等特点，使进行理论研究的原材料易于获得和分析。

5研究目的和意义

由于水环境污染严重和缺乏科学的保种、制种方法造成鳃一些优良品质的退化，因此获得抗病强，生长快等优良性状的鳝新品系是育种工作的首要问题。人工雌核发育是一种快速建立纯系的有效手段，常用于优良品种的选育，中国水产科学研究院长江水产研究所从1987年开始进行雌核发育鳞优良品系的选育工作，己获得了连续三代人工雌核发育鲍和雌核发育鳞近交FZ。对雌核发育鲍的研究有形态学(潘光碧等，2004;罗相忠等，2003)，同工酶(邓怀等，1998;杨书婷等，1999)，蛋

白质及RAPD(邹桂伟等，2004;毛晗等，2003)方面的研究，利用微卫星分子标

记对野生鲤群体的遗传多样性研究已有报道(Liao。 tal.，2006)，未曾有对人工雌核发育鲍及其近交几的微卫星分析的研究报道。由于进行人工雌核发育鲍及其近交后代的微卫星标记研究:(1)可以深入了解雌核发育的形成机理，探讨雌核发育是否

是完全的母性遗传方式。(2)明确雌核发育子代与父本、母本之间的亲缘关系;(3)

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4.2.1精子遗传物质失活

目前使精子遗传物质失活的方法主要采用射线照射法和化学处理法，国内主要

采用紫外线照射法。由于核酸比蛋白质对辐射的处理更加敏感，因此，在一定的剂量范围内，照射的作用是破坏精子头部DNA的结构，但并不明显改变精子细胞质的组成和蛋白质的功能;因而对辐射处理过的精子仍保持活动能力，能激发卵子发育 (吴清江，1981)。精子的活力与辐射处理的时间、照射的距离、照射的强度等因素有关，潘光碧(1988)研究发现，当照射距离在6~ncm之间时，距离每增加Icm，照射时间就要增加Zmin左右;当照射距离不变时，用两支30W的紫外灯比用1支灯管的照射时间缩短近一半。叶玉珍等(2003)在鳃人工雌核二倍体群体的产生及其遗

传分析实验中，取兴国红鲤精液，以Hank氏液1:3配比稀释，精液厚度控制在 1.smm，以1支15W的UV灯管照射，波长230.5nln，照射面与灯管垂直距离为16~17cm，照射时间10~20min，成功地诱导了鲍雌核发育并获得3个自然加倍的雌核发育二倍体群体，鲍的单倍体诱导率最高达%.9%。

4.2.2卵子染色体加倍

在鱼类卵子发生过程中，正常排出的卵子正处于第二次减数分裂中期，当精子

入卵后就排出第二极体，此时的卵子仅含有减半的染色体数目，如果与失活精子进行人工授精，精卵不发生融合，遗传物质不加倍，这样情况产生的胚胎会因为出现单倍体综合症，发生死亡，因此必须进行染色体加倍，胚胎才能正常发育(楼允东， 1999)。使染色体组加倍的方法很多，主要有温度休克法(热休克或冷休克)、静

水压休克法和化学休克法(吴清江等，1999;楼允东，1999)。(1)温度休克法就

是用高于或低于卵子的最适发育温度来处理胚胎的技术，通常用来阻止第二极体的排出或抑制第一次卵细胞减数分裂。染色体加倍情况受受精卵所经过温度休克处理的温度高低，时间长短，激活后开始休克的时间等因素的影响。贾方钧等(2002) 通过正交试验确定诱导极体雌核发育的最佳参数为受精后Zmin、40℃热休克处理

Zmin;诱导有丝分裂雌核发育的最佳参数为受精后17min、40℃热休克处理Zmin。 Rougeot等(2005)用同源灭活精子诱导河妒的雌核发育，在受精后smin，30℃热休克处理25min，胚胎的存活率可达到3.4%~46.6%。(2)静水压处理法:它需要专

「〕的设备，但处理的条件容易控制，对胚胎的损伤比温度休克小。因此，静水压处理是比较有效的鱼类染色体组操作方法。streisinger等(1981)采用静水压，并与乙醚相结合，阻止斑马鱼第一次有丝分裂，产生出纯合二倍体雌核发育斑马鱼。(3) 化学休克法:化学物质如细胞松弛素B，秋水仙素等可以用来进行染色体加倍处理。使雌核染色体加倍可在两个不同发育阶段进行，因此产生的雌核发育后代的基

因型就有很大的差别:第一种方法是受精后抑制第二极体外排，即经照射处理的精周裕华人工雌核发育鲍及其近交后代微卫星分子标记研究

10%SDS:称取 109SDS，加热溶解于gomL双蒸水中，定容至loomL，室温

保存。

酚/氯仿/异戊醇(25:24:1):将酚、氯仿、异戊醇按25:24:1体积比混合，放

置于棕色瓶中，贮存于4℃冰箱保存。

氯仿/异戊醇(24:1):将氯仿和异戊醇按24:1体积比混合，棕色瓶装，贮存

于4℃冰箱保存。

蛋白酶K:20mg蛋白酶K溶于lmL双蒸水，一20℃冷冻保存。

花缓冲液 :IMTris一HC以pH二8.0)ZmL， o.SMEDTA(pH二8.0)0.2mL与97.8mL 的双蒸水混匀。

、、尹、、/4‘J了‘‘Z‘、

、，Z、、产、、产了O月 001/‘、了.、/‘、

1.2.3.2琼脂糖凝胶电泳及检测所用的溶液配制

(1)50xTAE储备液:称取 2429Tris碱溶于650mL双蒸水，加入 57.1mLHAc、

加 oml0.5mo呱EDTA(PH二8.0)，加水定容至1000InL。

(2)琼脂糖凝胶上样缓冲液 (6xloadingbuffer):0.09%嗅酚兰，60%甘油，

6Ommol/L混匀，常温保存。

(3)溟化乙锭(EB，10m岁inL):loomL双蒸水中加入 0.19EB，搅拌使完全溶解，

置于棕色试剂瓶，锡箔包裹，常温避光保存。

(4)1%的琼脂糖:称19琼脂糖溶于loomLlx珊E溶液。

1.2.3.3聚丙烯酞胺凝胶电泳和银染过程中所用的溶液配制

(i)lox几E:侧s碱1059、硼酸559、 NaZEDTA.ZHZo9.39，加双蒸水溶解，定容至1000mL，室温下保存。

(2)sx珊E:称取Tris碱549、硼酸27.59、N处ED认· ZHZo4.659，溶于750ml双蒸水，加水定容至1000mL。

(3)10%过硫酸按仍P):称取19过硫酸按溶于5ml双蒸水，定容至10ml。棕色瓶装， 4℃冰箱中保存，二个星期后重新配制新液。

(4)50%丙烯酞胺母液:将2909丙烯酞胺和10酬，N一亚甲基双丙烯酞胺溶于总体积为600mL的水中，磁力搅拌器上搅拌溶解，加水定容至10O0mL，置棕色瓶中，保存于4℃冰箱，可保存数月。

(5)12%聚丙烯酞胺凝胶的配制

30%丙烯酞胺母液 24mL

sxTBE12mL

10%过硫酸钱(”)42助L

仆MEDZ切L

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双蒸水23.58mL

配胶总体积为 60mL

固定/终止液:量取2.smL冰醋酸，加50mL无水乙醇，加双蒸水定容soomL搅

拌，混匀，现配现用。

染色液:称取 19AgN03，加50mL无水乙醇，加2.smL冰醋酸，加双蒸水定容

500mL，搅拌，混匀。

显影液:称取159无水NaZoH，加37%甲醛2.smL，加双蒸水定容soomL，搅

拌，混匀。最好在使用前6小时前配好放于4℃冰箱中保存。

、.了、，r‘U工了了‘、厂‘、

(8)

1.3实验方法

1.3.1样品DNA的提取

采用常规的方法酚氯仿抽提，参考《分子克隆实验指南》(第二版 )(Sambrook

etal.，1989)。

(1)剪取0.59左右的尾鳍组织，用双蒸水洗净尾鳍上沾附的酒精，充分剪碎，放

入1.smL离心管中;

(2)在每个离心管中分别加入60咖LS几缓冲液，4伽L10%SDs，1咖 L20mg/mL 蛋白酶K，混匀，在50℃~54℃之间消化4小时以上，该过程中摇晃离心管2~

3次，直到组织完全消化完;

(3)加入等体积酚一氯仿一异戊醇(体积比为25:24:l)，于机械手上缓慢转动混匀

20min，10000甲m离心10min(4℃)，吸上清液;

(4)加等体积酚一氯仿一异戊醇(体积比25:24:1)，机械手上转动混匀20min以上， loo00rPm离心lomin(4oC)，吸上清液;

(5)再加等体积氯仿一异戊醇(体积比24:1)，机械手上转动混匀20min以上，

1000帅m离心IOmin(4oC)，吸上清液;

(5)加2倍体积的无水乙醇，4℃过夜;

(6)l000orpm离心40min，去上清液，留沉淀于底，温箱干燥或空气干燥;

(7)加5印L双蒸水，溶解2天(4℃保存);

(8)于一20℃保存备用;

1.3.2样品DNA的琼脂糖检测

(1)制备1.0%琼脂糖凝胶。

(2)吸取和LDNA原液，加入1群L滨酚蓝上样缓冲液，200v稳压电泳10min。

(3)电泳完毕后，取出凝胶置于凝胶成像系统下用紫外光拍照，判断是否有PCR

产物。

周裕华人工雌核发育维及其近交后代微卫星分子标记研究

1.4微卫星PCR

1.4.1微卫星位点

表2.1十二对鳞微卫星引物序列

飞妞 ble2.1twlevemie功 satelliteDNAPrimerPai” ofsilverearP

位点助cus引物序列P咖 erssequence退腐渡Tm

Bl巧

52℃

R:CCCI，CCACG幻人CTGACAAG

F:CGGCACTCAGA声户JGATGGGG

54℃

R:CATGGAGAGCAGGAAGA任叮G

F:CGAGACAA幻叭AGGTTGGAIA

52℃

R:CACAAAGAAACTGGAACAAAGAG

F:CAGA户TCCAGAGCCGTCAG

54℃

R:CACCGAACAGGGAACCAA

52℃

R:TTGC月叮GATGCTGTCCC

F消TGCGAGGGTGG户了G八TGGG

55℃

R:GGAAAGCAAAGCCTGGA口队

F:CCCGACTGGGC以消AC月队

52℃

R:TCA门了GGGAGGCAGACAC

F:TACTG川rACTCCGTCCCCI，

54℃

R:GCACCTG毛U汀CCCA产户丁

F:TGCCGATGT砂汀Grl‘l’IGCT

52℃

R:TGCflGTGGGTGAGI一ffCI，

F:AAGGAAAGTTGGCTGCTC

52℃

R:GGCTCTGAGGGAGA]队CCAC

F:CTCGTCTCGTGCf1GTCA

55℃

R:GGTGGTC戌口J汀CACCAJTCC

F:CCATCAGACAGCCAAAGACAA

R:TGAAGGCAAGGTCAAGGTp门，

48280-25250]9 LLLLLLL工L工L

54℃

注:F:正向引物;R:反向引物

Note:F:PositivePrimer;R:reversePrimer

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1.4.2PCR扩增体系

o.4pe2.sgh﹃0.2gh。﹄10XBuffer

10mmol/LdNTPs

10mol/L上下游Primers

SU/uLTaqDNA聚合酶

50n脚L模板DNA

灭菌去离子水

总体积2匆L

BBBBBBBBBBB

1.4.3扩增程序

先94℃预变性3min;循环设置:94℃变性3min，适应的退火温度下退火lmin

(退火温度见表2.1)，72oC延伸lmin;共30个循环，最后72oC延伸10min。扩增反应在PTC一200型PCR仪上进行。

1.4.4PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测

使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，在凝胶成像系统用紫外光拍照，若有亮带说明有扩增产物，可以进行聚丙烯酞胺凝胶电泳，若没有，则需要从新扩增，再检测。

1.4.5PCR产物的聚丙烯酞胺凝胶电泳和银染检测

1.4.5.112%聚丙烯酞胺凝胶的制备

(1)清洗制胶玻璃板，烘干后，组装好玻璃板，用1.0%的琼脂糖封底;

(2)30%丙烯酞胺母液24mL， 5XTBE12mL，10%过硫酸按(AP)42伽L，几MED 2场L，双蒸水23.58mL混匀。混匀后迅速灌胶;

(3)当胶灌至离玻璃板上缘0.scm时就停止灌胶，插入梳子，注意梳齿下不要有气泡，如有气泡就得想办法除去，室温下聚合1小时;

(4)等凝胶聚合好后，轻轻拔出梳子;

(5)取下玻璃板，然后固定在电泳槽上，倒入电泳缓冲液 1xTBE;

(6)在PCR产物中加入1/3体积上样缓冲液，用微量进样器取6一即L混合液，点到加样孔，同时留出点样孔点分子量标记物Marker;

(7)上样完毕后，打开电泳仪100一150V电压电泳，电泳时间因片断大小而定;

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1.2主要实验仪器，试剂及主要溶液的配制

1.2.1主要仪器及产地

DYY一12型电泳仪

DYY一nl型琼脂糖水平电泳槽

BIO一RAD型凝胶成像分析系统

PTC一200型PCR仪

GZX一DH电热恒温干燥箱

DYCZ一22A垂直板电泳槽

DYCZ一28D垂直板电泳槽

台式高速离心机L13型

低温离心机5415R

WD一9405B水平摇床

Sx一100紫外透射仪

TH一2型恒温振荡器

移液器

北京六一仪器厂

美国SIM公司

美国MJ

上海铁通医疗器械厂

北京六一仪器厂

德国助pendorf公司

德国EPpendorf公司

北京六一仪器厂

上海四星生物技术公司

江苏太仓市实验设备厂

波兰HTL

1.2.2主要试剂

琼脂糖、蛋白酶K、鲍微卫星引物、丙烯酞胺、N，N一亚甲基双丙烯酞胺、rTaq

酶、10xBuffer、dNTP混合物(dATP，dGT卫，dCTP和dTTP各10mmo呱，由TaK滋Ra 公司生产)、澳化乙锭(EB)、10%过硫酸按、住MED、37%甲醛、A酬03、冰醋酸、Na0H。

1.2.3主要溶液的配方

1.2.3.1DNA提取所用到的溶液的配制

iMTris一el:称取121.19而 5base(Mw121.1)碱溶于70OmL双蒸水中，加

浓盐酸调至pH=8.0，定容到1000mL。高压蒸汽灭菌，冷却后室温保存。

0.5mol/LED认:称取 156.19NaZED认·ZHZo溶于700mL双蒸水中，用NaoH 调至pH=8.0，定容到1000mL。高压蒸汽灭菌，冷却后室温保存。

STE:称取 1.179NaCI溶于Zo0L的lmol/LTris一CI储备液，再加 40伽LO.5

mol/LEn认(pH二5.0)，定容至ZoomL。高压蒸汽灭菌15min，贮存于4oC

冰箱保存。

、、尹、/.11，‘Z‘、r/、

(3)

周裕华人工雌核发育鲍及其近交后代微卫星分子标记研究

.4.5.2银染检测

(1)电泳结束后关上电泳议，倒出电泳缓冲液 1xTBE，取出凝胶，放到染色盒中，注意不要弄破胶，然后用双蒸水中漂洗一次;

(2)固定:加入固定液，在摇床上轻摇固定30min，把固定液倒入到一个容器中，

以便做终止使用;用蒸馏水水洗2次，每次lmin，洗的过程中缓慢摇动，倒去

蒸馏水;

(3)染色:加入染色液，在摇床上轻摇染色20min，然后双蒸水迅速漂洗2次，每次不超过305，洗的过程中缓慢摇动，倒去蒸馏水;

(4)显色:加入显色液，在摇床上轻摇显色，观察显色情况，出现比较清晰的条带

时就停止显色，然后双蒸水迅速漂洗2次，洗的过程中缓慢摇动，倒去蒸馏水;

(5)终止显色:把最初使用的显色液加入染色盒中，缓慢摇动smin，倒掉终止液，然后用去离子水洗胶三遍，洗的过程中缓慢摇动，每次lmin;

(6)拍照:在凝胶成相系统上，白光下进行拍照

鳗及其近交后代微卫星分子标记研究

2遗传标记的发展及应用

遗传标记 (GelleticMarkers)是指与目标性状紧密连锁，同该性状共同分离可

(1)具有高度的多态性;(2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合

和纯合基因型;(3)能明确辨别等位基因;(4)遍布整个基因组;(5)除特殊位

点的标记外，要求分子标记的位点均匀分布于整个基因组;(6)选择中性，即无基

因多效性;(7)检测片段简单、快速，实验程序易自动化;(8)开发成本和使用

成本尽量低廉;(9)在实验室内和实验室间重复性好，便于数据交换。但是，目前

发现的任何一种分子标记均不能满足以上所有要求(贾继增，1996;邱芳等，1998;

2.1形态学标记

形态学标记(MO甲 hologicalmarkers)是指那些从表型上看显示遗传多态性的特

2.2细胞学标记

细胞学标记的研究目前通常是对细胞染色体组，染色体结构与组成，染色体数

目等方面的研究。细胞遗传学家发现染色体的变异会造成表型的变异，因而染色体

第一章文献综述

1引言

鲍(场，咖thalmichthx:molitr动属鲤形目，鲤科，鳝亚科，是我国四大家鱼

中国水产科学研究院长江水产研究所自1987年就开始了对鲍的人工雌核发育研

较研究中发现，雌核发育鳞的生长性能优于普通维:在相同生长条件下，雌核发育鳝比标准鳃体重大10.6%~31.9%，平均大巧.6%;雌核组比普通鲍组体长增长快

3.7%~25.3%，体重增长快6.7%~90.1%。罗相忠等(2003)以雌核发育鳝各系与普

人工雌核发育是采用人工操作方法促使失活的精子进入卵内与卵子结合，精子

发育鳝后代含有少数与父本相同的特异性带，而母本没有。张海发等(1995)对异

2.3生化标记

生化标记 (Biochemicalmarkers)指采用电泳技术对生物大分子如蛋白质、酶进

表明，青鱼、草鱼、鳞、缩的乳酸脱氢酶(LDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)及超氧

2.4分子标记

分子标记技术是继形态学标记、细胞遗传学标记、生化标记后的一种新型标记

中性标记;有许多分子标记为共显性;有些分子标记所需样品量少能够用来分析微

量DNA和古化石等优点，因而广泛应用在生物起源进化、亲缘关系、基因图谱构建等各个领域研究。

2.4.1RFLP

进行mtDNA的RF廿分析，由于mtDNA呈母性遗传方式，检测不到父本的遗传信息，因此，其应用也存在一定程度的限制。

2.4.2RAPD

随机扩增片段长度多态性标记 (RandomlyAmplifiedpolymo印 hieDNA)即

华中农业大学2007届硕士学位论文

变异情况可以做为一种分子标记，可确定与性状相连锁基因所在的染色体和位置。

2.3生化标记

生化标记 (Biochemicalmarkers)指采用电泳技术对生物大分子如蛋白质、酶进

2遗传标记的发展及应用

遗传标记 (GelleticMarkers)是指与目标性状紧密连锁，同该性状共同分离可

(1)具有高度的多态性;(2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合

和纯合基因型;(3)能明确辨别等位基因;(4)遍布整个基因组;(5)除特殊位

点的标记外，要求分子标记的位点均匀分布于整个基因组;(6)选择中性，即无基

因多效性;(7)检测片段简单、快速，实验程序易自动化;(8)开发成本和使用

成本尽量低廉;(9)在实验室内和实验室间重复性好，便于数据交换。但是，目前

发现的任何一种分子标记均不能满足以上所有要求(贾继增，1996;邱芳等，1998;

2.1形态学标记

形态学标记(MO甲 hologicalmarkers)是指那些从表型上看显示遗传多态性的特

2.2细胞学标记

细胞学标记的研究目前通常是对细胞染色体组，染色体结构与组成，染色体数

目等方面的研究。细胞遗传学家发现染色体的变异会造成表型的变异，因而染色体 1引言

鲍(场，咖thalmichthx:molitr动属鲤形目，鲤科，鳝亚科，是我国四大家鱼

中国水产科学研究院长江水产研究所自1987年就开始了对鲍的人工雌核发育研

较研究中发现，雌核发育鳞的生长性能优于普通维:在相同生长条件下，雌核发育鳝比标准鳃体重大10.6%~31.9%，平均大巧.6%;雌核组比普通鲍组体长增长快

3.7%~25.3%，体重增长快6.7%~90.1%。罗相忠等(2003)以雌核发育鳝各系与普

人工雌核发育是采用人工操作方法促使失活的精子进入卵内与卵子结合，精子

发育鳝后代含有少数与父本相同的特异性带，而母本没有。张海发等(1995)对异

精激发彭泽螂雌核发育产生的子一代及双亲进行RAPD分析，发现异育彭泽螂子一

(WilliamsetaL， 1990;Welshetal.，1990)。RApD分子标记技术最大优点在于:(1) 快速简便，随机设计引物;(2)经济实用，用一个引物就可扩增出许多片段，检测

具有诸多优点，近年来该技术在陆生动植物的研究中已被广泛应用(王文等，1994; 兰宏等，1996;周喻萍等，1994;汪小全等，1996;惠东威等，1996)。刘萍等(2000)

2.4.3AFLP

AFLP(AmplifiedFragmenLengthPolymorphism)即扩增片段长度多态性，该技

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3微卫星分子标记在水产遗传育种中的应用

洋鳍鱼(俞血:mo动ua)、罗非鱼(。r己口认romis脚)、鲤鱼(匀， rinusea，io)、

鳝(双沙 othalmichthysmolitr众 )(LiaoetaL，2007)、扇贝(Plae叩 ectemmagellanieus)、宽帆鳄 (PoecilialatiPinna)、棘胸鱼(万叩 lotehusatlanticus)、大鳞大麻哈鱼

(Oncorhynchustsha””声tch。)、三棘刺鱼(Gasterosteusac“leatus)、牙鲜(Paralic材妙s 口左v口ceus)、中国对虾仔乞儿 neroPenaeuschinensis)(刘萍等，2004)和斑马鱼

(Brachydaniorerio)(杜长斌等，2000)、大菱鲜你叩人 thalmusmaximus)(pardoer

al.，2005)、晶裙 (Sebastesrastrelliger)(westermanetal.，2005)等多种海水和淡

连锁图谱。

3.1遗传多样性分析

由于SSR的多态性丰富，分辨率高，条带清晰，因此广泛用于种群鉴别和遗传

多样性分析。梁利群等(2004)等利用微卫星分子标记技术对乌苏里江哲罗鱼遗传

多样性的分析结果表明，乌苏里江哲罗鱼等位基因频率为0.0455一0.7857，多态信息含量(PIC)为0.2801~0.6351，杂合度(H)为0.3368一0.6563。初步表明乌苏里江

(1995)利用微卫星技术研究了加拿大东海5个大西洋鲜群体的遗传多样性和群体结周裕华人工雌核发育鳝及其近交后代微卫星分子标记研究

3.2遗传连锁图谱的构建

微卫星引物具有通用性强的特点，根据微卫星两端的保守序列设计的引物可以

到目前为止，己建成的鱼类微卫星图谱还有虹蹲、尼罗罗非鱼和鲤鱼(孙效文等， 2000)等。

3.3亲缘关系和种群鉴定

微卫星分子标记技术与其它标记相比更能得出可靠、准确的数据。借助分子遗

华中农业大学2007届硕士学位论文

3.4辅助鱼类遗传育种

遗传育种的目的就是选育出生长快且体型大，肉质好，抗病强等优良的品种，

3.5用于QTL定位方面研究

4人工诱导雌核发育

4.1人工诱导雌核发育原理

雌核发育是鱼类一种重要的单性生殖方式，与孤雌生殖、两性生殖不同，雌核

发育过程中需要近缘种精子进行激发卵子发育，但精子只起激活卵子作用，是一种

2.4.4微卫星分子标记

微卫星(Mierosatellite)分子标记是继RFLP技术之后的第二代分子标记技术。

微卫星(microsatellite)又称简单序列重复 (Simplese明 eneerepeats，ssR)、短

串联重复 (shorttandemrepeats)、简单序列长度多态性 (Slinplese叨 eneelength polymo印hisn，55廿)，是由核心序列 (eoresequenee)和两端侧翼序列构成，一般

2.4.5单核昔酸多态

单核普酸多态(SNP)被称为第三代遗传作图DNA分子标记，其原理指在基因

(comePhoru:baicolensis)等种类。天然雌核发育鱼类的共同特征是:产生的卵子

育维研究发现雌核发育子代存在有和对照鲤相同的带，而在母本中不存在的带，因此认为可能存在“异精生物学效应”。

4.2人工诱导雌核发育

随着对雌核发育机理的研究，人们对天然雌核发育的机理有了全面的认识，开

第二章人工雌核发育第三代鳞遗传多样性的微卫星分析

目前对鳝的研究有形态学、同工酶、mtDNA等方面的研究，对雌核鳞的研究也

1方法

1.1实验材料

长长江野生鲍鲍

第第一代雌核发育鲍 (GscGl)))

第第二代雌核发育鳝 (GSCGZ)))

第第三代雌核发育鲍 (GSCG3)))

图2.1雌核发育鳞场材料来源示意图

Fig.2.1ThesourceofartifieialgynogeneticSilverCarpG3

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6本研究的总体设计和技术路线

本研究采用Uao等(2007)筛选出来的鲍微卫星引物，对人工雌核发育鲍及其

1.1。

实验鱼样的采集

丰

雌核发育鲍，普通鳝，长江鳝，普通鲤

的DNA的提取

DNA浓度的检测

选取合适的鳝微卫星引物作为

扩增样品鱼的微卫星引物

确确定合适浓度的 DNAAA

为为模板 DNAAA

PCR扩增

聚聚苯烯酞胺凝胶电泳泳

照照相，微卫星分析，数据统计计

图Ll本研究技术思路

Fig.1.1Thetechniealrouteoftheresearch

周裕华人工雌核发育鲍及其近交后代微卫星分子标记研究

静水压法和热休克法抑制第一次卵裂。最早获得纯合的人工雌核发育斑马鱼。

4.3人工诱导雌核发育的意义

人工诱导鱼类雌核发育在育种上有很重要的意义，一、可以快速建立纯系，加快

5研究目的和意义

白质及RAPD(邹桂伟等，2004;毛晗等，2003)方面的研究，利用微卫星分子标

是完全的母性遗传方式。(2)明确雌核发育子代与父本、母本之间的亲缘关系;(3)

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4.2.1精子遗传物质失活

目前使精子遗传物质失活的方法主要采用射线照射法和化学处理法，国内主要

4.2.2卵子染色体加倍

在鱼类卵子发生过程中，正常排出的卵子正处于第二次减数分裂中期，当精子

水压休克法和化学休克法(吴清江等，1999;楼允东，1999)。(1)温度休克法就

因型就有很大的差别:第一种方法是受精后抑制第二极体外排，即经照射处理的精周裕华人工雌核发育鲍及其近交后代微卫星分子标记研究

10%SDS:称取 109SDS，加热溶解于gomL双蒸水中，定容至loomL，室温

保存。

酚/氯仿/异戊醇(25:24:1):将酚、氯仿、异戊醇按25:24:1体积比混合，放

置于棕色瓶中，贮存于4℃冰箱保存。

氯仿/异戊醇(24:1):将氯仿和异戊醇按24:1体积比混合，棕色瓶装，贮存

于4℃冰箱保存。

蛋白酶K:20mg蛋白酶K溶于lmL双蒸水，一20℃冷冻保存。

花缓冲液 :IMTris一HC以pH二8.0)ZmL， o.SMEDTA(pH二8.0)0.2mL与97.8mL 的双蒸水混匀。

、、尹、、/4‘J了‘‘Z‘、

、，Z、、产、、产了O月 001/‘、了.、/‘、

1.2.3.2琼脂糖凝胶电泳及检测所用的溶液配制

(1)50xTAE储备液:称取 2429Tris碱溶于650mL双蒸水，加入 57.1mLHAc、

加 oml0.5mo呱EDTA(PH二8.0)，加水定容至1000InL。

(2)琼脂糖凝胶上样缓冲液 (6xloadingbuffer):0.09%嗅酚兰，60%甘油，

6Ommol/L混匀，常温保存。

(3)溟化乙锭(EB，10m岁inL):loomL双蒸水中加入 0.19EB，搅拌使完全溶解，

置于棕色试剂瓶，锡箔包裹，常温避光保存。

(4)1%的琼脂糖:称19琼脂糖溶于loomLlx珊E溶液。

1.2.3.3聚丙烯酞胺凝胶电泳和银染过程中所用的溶液配制

(i)lox几E:侧s碱1059、硼酸559、 NaZEDTA.ZHZo9.39，加双蒸水溶解，定容至1000mL，室温下保存。

(2)sx珊E:称取Tris碱549、硼酸27.59、N处ED认· ZHZo4.659，溶于750ml双蒸水，加水定容至1000mL。

(3)10%过硫酸按仍P):称取19过硫酸按溶于5ml双蒸水，定容至10ml。棕色瓶装， 4℃冰箱中保存，二个星期后重新配制新液。

(5)12%聚丙烯酞胺凝胶的配制

30%丙烯酞胺母液 24mL

sxTBE12mL

10%过硫酸钱(”)42助L

仆MEDZ切L

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双蒸水23.58mL

配胶总体积为 60mL

固定/终止液:量取2.smL冰醋酸，加50mL无水乙醇，加双蒸水定容soomL搅

拌，混匀，现配现用。

染色液:称取 19AgN03，加50mL无水乙醇，加2.smL冰醋酸，加双蒸水定容

500mL，搅拌，混匀。

显影液:称取159无水NaZoH，加37%甲醛2.smL，加双蒸水定容soomL，搅

拌，混匀。最好在使用前6小时前配好放于4℃冰箱中保存。

、.了、，r‘U工了了‘、厂‘、

(8)

1.3实验方法

1.3.1样品DNA的提取

采用常规的方法酚氯仿抽提，参考《分子克隆实验指南》(第二版 )(Sambrook

etal.，1989)。

(1)剪取0.59左右的尾鳍组织，用双蒸水洗净尾鳍上沾附的酒精，充分剪碎，放

入1.smL离心管中;

(2)在每个离心管中分别加入60咖LS几缓冲液，4伽L10%SDs，1咖 L20mg/mL 蛋白酶K，混匀，在50℃~54℃之间消化4小时以上，该过程中摇晃离心管2~

3次，直到组织完全消化完;

(3)加入等体积酚一氯仿一异戊醇(体积比为25:24:l)，于机械手上缓慢转动混匀

20min，10000甲m离心10min(4℃)，吸上清液;

(4)加等体积酚一氯仿一异戊醇(体积比25:24:1)，机械手上转动混匀20min以上， loo00rPm离心lomin(4oC)，吸上清液;

(5)再加等体积氯仿一异戊醇(体积比24:1)，机械手上转动混匀20min以上，

1000帅m离心IOmin(4oC)，吸上清液;

(5)加2倍体积的无水乙醇，4℃过夜;

(6)l000orpm离心40min，去上清液，留沉淀于底，温箱干燥或空气干燥;

(7)加5印L双蒸水，溶解2天(4℃保存);

(8)于一20℃保存备用;

1.3.2样品DNA的琼脂糖检测

(1)制备1.0%琼脂糖凝胶。

(2)吸取和LDNA原液，加入1群L滨酚蓝上样缓冲液，200v稳压电泳10min。

(3)电泳完毕后，取出凝胶置于凝胶成像系统下用紫外光拍照，判断是否有PCR

产物。

周裕华人工雌核发育维及其近交后代微卫星分子标记研究

1.4微卫星PCR

1.4.1微卫星位点

表2.1十二对鳞微卫星引物序列

飞妞 ble2.1twlevemie功 satelliteDNAPrimerPai” ofsilverearP

位点助cus引物序列P咖 erssequence退腐渡Tm

Bl巧

52℃

R:CCCI，CCACG幻人CTGACAAG

F:CGGCACTCAGA声户JGATGGGG

54℃

R:CATGGAGAGCAGGAAGA任叮G

F:CGAGACAA幻叭AGGTTGGAIA

52℃

R:CACAAAGAAACTGGAACAAAGAG

F:CAGA户TCCAGAGCCGTCAG

54℃

R:CACCGAACAGGGAACCAA

52℃

R:TTGC月叮GATGCTGTCCC

F消TGCGAGGGTGG户了G八TGGG

55℃

R:GGAAAGCAAAGCCTGGA口队

F:CCCGACTGGGC以消AC月队

52℃

R:TCA门了GGGAGGCAGACAC

F:TACTG川rACTCCGTCCCCI，

54℃

R:GCACCTG毛U汀CCCA产户丁

F:TGCCGATGT砂汀Grl‘l’IGCT

52℃

R:TGCflGTGGGTGAGI一ffCI，

F:AAGGAAAGTTGGCTGCTC

52℃

R:GGCTCTGAGGGAGA]队CCAC

F:CTCGTCTCGTGCf1GTCA

55℃

R:GGTGGTC戌口J汀CACCAJTCC

F:CCATCAGACAGCCAAAGACAA

R:TGAAGGCAAGGTCAAGGTp门，

48280-25250]9 LLLLLLL工L工L

54℃

注:F:正向引物;R:反向引物

Note:F:PositivePrimer;R:reversePrimer

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1.4.2PCR扩增体系

o.4pe2.sgh﹃0.2gh。﹄10XBuffer

10mmol/LdNTPs

10mol/L上下游Primers

SU/uLTaqDNA聚合酶

50n脚L模板DNA

灭菌去离子水

总体积2匆L

BBBBBBBBBBB

1.4.3扩增程序

先94℃预变性3min;循环设置:94℃变性3min，适应的退火温度下退火lmin

(退火温度见表2.1)，72oC延伸lmin;共30个循环，最后72oC延伸10min。扩增反应在PTC一200型PCR仪上进行。

1.4.4PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测

1.4.5PCR产物的聚丙烯酞胺凝胶电泳和银染检测

1.4.5.112%聚丙烯酞胺凝胶的制备

(1)清洗制胶玻璃板，烘干后，组装好玻璃板，用1.0%的琼脂糖封底;

(2)30%丙烯酞胺母液24mL， 5XTBE12mL，10%过硫酸按(AP)42伽L，几MED 2场L，双蒸水23.58mL混匀。混匀后迅速灌胶;

(3)当胶灌至离玻璃板上缘0.scm时就停止灌胶，插入梳子，注意梳齿下不要有气泡，如有气泡就得想办法除去，室温下聚合1小时;

(4)等凝胶聚合好后，轻轻拔出梳子;

(5)取下玻璃板，然后固定在电泳槽上，倒入电泳缓冲液 1xTBE;

(6)在PCR产物中加入1/3体积上样缓冲液，用微量进样器取6一即L混合液，点到加样孔，同时留出点样孔点分子量标记物Marker;

(7)上样完毕后，打开电泳仪100一150V电压电泳，电泳时间因片断大小而定;

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1.2主要实验仪器，试剂及主要溶液的配制

1.2.1主要仪器及产地

DYY一12型电泳仪

DYY一nl型琼脂糖水平电泳槽

BIO一RAD型凝胶成像分析系统

PTC一200型PCR仪

GZX一DH电热恒温干燥箱

DYCZ一22A垂直板电泳槽

DYCZ一28D垂直板电泳槽

台式高速离心机L13型

低温离心机5415R

WD一9405B水平摇床

Sx一100紫外透射仪

TH一2型恒温振荡器

移液器

北京六一仪器厂

美国SIM公司

美国MJ

上海铁通医疗器械厂

北京六一仪器厂

德国助pendorf公司

德国EPpendorf公司

北京六一仪器厂

上海四星生物技术公司

江苏太仓市实验设备厂

波兰HTL

1.2.2主要试剂

琼脂糖、蛋白酶K、鲍微卫星引物、丙烯酞胺、N，N一亚甲基双丙烯酞胺、rTaq

酶、10xBuffer、dNTP混合物(dATP，dGT卫，dCTP和dTTP各10mmo呱，由TaK滋Ra 公司生产)、澳化乙锭(EB)、10%过硫酸按、住MED、37%甲醛、A酬03、冰醋酸、Na0H。

1.2.3主要溶液的配方

1.2.3.1DNA提取所用到的溶液的配制

iMTris一el:称取121.19而 5base(Mw121.1)碱溶于70OmL双蒸水中，加

浓盐酸调至pH=8.0，定容到1000mL。高压蒸汽灭菌，冷却后室温保存。

0.5mol/LED认:称取 156.19NaZED认·ZHZo溶于700mL双蒸水中，用NaoH 调至pH=8.0，定容到1000mL。高压蒸汽灭菌，冷却后室温保存。

STE:称取 1.179NaCI溶于Zo0L的lmol/LTris一CI储备液，再加 40伽LO.5

mol/LEn认(pH二5.0)，定容至ZoomL。高压蒸汽灭菌15min，贮存于4oC

冰箱保存。

、、尹、/.11，‘Z‘、r/、

(3)

周裕华人工雌核发育鲍及其近交后代微卫星分子标记研究

.4.5.2银染检测

(1)电泳结束后关上电泳议，倒出电泳缓冲液 1xTBE，取出凝胶，放到染色盒中，注意不要弄破胶，然后用双蒸水中漂洗一次;

(2)固定:加入固定液，在摇床上轻摇固定30min，把固定液倒入到一个容器中，

以便做终止使用;用蒸馏水水洗2次，每次lmin，洗的过程中缓慢摇动，倒去

蒸馏水;

(3)染色:加入染色液，在摇床上轻摇染色20min，然后双蒸水迅速漂洗2次，每次不超过305，洗的过程中缓慢摇动，倒去蒸馏水;

(4)显色:加入显色液，在摇床上轻摇显色，观察显色情况，出现比较清晰的条带

时就停止显色，然后双蒸水迅速漂洗2次，洗的过程中缓慢摇动，倒去蒸馏水;

(5)终止显色:把最初使用的显色液加入染色盒中，缓慢摇动smin，倒掉终止液，然后用去离子水洗胶三遍，洗的过程中缓慢摇动，每次lmin;

(6)拍照:在凝胶成相系统上，白光下进行拍照

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