固定化脂肪酶性质及其应用研究

第5卷第1期　

2007年2月

生物加工过程

Chine se Jou r nal o f B ioprocess Eng ineeri n g

Feb . 2007 　45

固定化脂肪酶性质及其应用研究

曾淑华, 杨江科, 闫云君

(华中科技大学　生命科学与技术学院, 武汉430074)

摘　要:利用以四甲氧基硅烷(T M O S ) 和甲基三甲氧基硅烷(M TM S ) 为前驱体的溶胶-凝胶法(so l -gel ) 固定洋葱假单胞菌属脂肪酶, 考查了固定化酶和游离酶的酶学性质及催化不同油脂酯交换合成生物柴油的情况。结果表明, 80℃以下固定化酶能保持80%以上的酶活, 而游离酶在50℃以后活力急剧下降, 到80℃残余酶活约为10%;固定化酶在体积分数50%的甲醇中处理48h 能保持85%的酶活, 在体积分数90%的乙醇中处理48h 能保持31%的酶活, 而游离酶残余酶活只有69%和0; 在酯交换反应中固定化酶的催化效率比游离酶高10%～20%,且固定化酶重复使用11次后仍能保持60%的酶活。结果显示, 酶经过固定化后稳定性和催化活性显著提高。关键词:脂肪酶; 固定化; 稳定性; 酯交换

中图分类号:Q 814. 2, Q 814. 9　　　　文献标识码:A 　　　　文章编号:1672-3678(2007) 01-0045-05

Studies on stab ility of m i m ob ilized li p ase and its appli cati on

ZENG Shu -hua , YANG Jiang -ke , YAN Yun -jun

(Co ll ege of L ife Science and T echno logy , Huazhong Un i ve rsit y o f Sc i ence and Techno l ogy , W uhan 430074, China )

Abst ract :Lipase fr o m P seudo m onas ce pacia w as entrapped in hybrid o r ganic -i n or ganic so l -ge l powde r

pr epared by base -ca tal y zed po l y m erizati o n o f te tra m ethoxysilane (T MOS ) and m e t h yltr e i m e t h oxysila (MT M S ) . Its charac t e ristics and application in t h e transeste rifica ti o n of d ifferen t o ils w ere studied . The r esu lts sho w ed that i m m ob ilized lipase r e m a i n ed over 80%o f its activ ity when the te m perature w as be l o w

80℃w hile the r e sidua l activity of free ones w as dec r eased rapidly when t h e te mperature w as over 50℃,and on l y 10%w as r e m ained w hen the te m pera t u re w as 80℃. A fte r incuba ti o n 48h in 50%m ethanol so l -vent , the residual acti v it y of i m m ob ilized li p ase and fr ee one we r e 85%and 69%respective l y and a ft e r i n cubation 48h i n 90%e t h ano l so lvent , t h e residual ac tiv it y of i m m obilized lipase and free one w ere 31%and 0respective ly . M oreover , in t h e transesterification r eacti o ns , t h e ca talyzing e fficiency of i m m o -b ilized lipase w as 10%～20%h i g he r t h an t h at o f the free one . A fter continuousl y used for 11ti m es , 60%residual activity of i m m ob ilized lipase w as re m ained . These resu lts indicated the stabilit y and ac tiv i -t y of li p ase w hen i m m ob ilized w ere high l y i m proved . K ey w ords :lipase ; i m m obilization ; stability ; transesterification 　　脂肪酶(lipase , EC 3. 1. 1. 3) 是一类特殊的酰基水解酶, 能够在油-水界面上催化酯水解、酯合成、酯交换、内酯合成、多肽合成、高聚物合成及立体异构

体拆分等化学反应, 是目前被广泛研究的一种酶催化剂, 洋葱假单胞菌属脂肪酶由于其良好的稳定性和较高的催化活力, 被广泛地应用于生物柴油的制

*收稿日期:2006-11-05

基金项目:国家高技术研究发展计划(“863”计划) 项目(2003AA214061); 湖北省科技攻关资助项目作者简介:曾淑华(1980-), 女, 湖北汉川人, 硕士研究生, 研究方向:脂肪酶的固定化及应用。, , , E -m j un @t o m.

　　46 备

[1-3]

生物加工过程

[4]

第5卷第1期

、手性化合物的拆分、油脂改性

[5]

等方面震荡5s , 然后轻轻震荡, 看到凝胶颗粒在数秒内形成。将反应物置于空气中, 经37℃干燥后, 刮下白色凝胶, 用10m L Tris -HC l buffer (p H 7. 0, 0. 05m ol L ) 震荡洗涤2h , 除去未固定和结合松散的酶, 离心, 收集上清液, 分析得酶的固定化效率

为94%。将固体颗粒分别用10mL 丙酮、10m L 正己烷洗涤、冻干, 置于-20℃下保存备用。1. 4. 2　酶水解活力的测定

采用水解p NPP 法

[10]

-1

的研究。但由于酶的价格昂贵、难以回收且在反应过程中易失活等原因, 很大程度上限制了它在工业

化生产中的应用。酶通过固定化后可以提高活力和稳定性, 而且易于回收重复使用, 因此酶固定化技术被广泛地应用, 以降低生产成本、提高生产效率。

溶胶-凝胶法(so l -ge l ) 固定化脂肪酶由于具有优异的综合性能, 如制备工艺简单、力学性能稳定、生物相容性好等, 已成为当今酶固定化的热点研究领域之一。采用so l -ge l 法对来源于洋葱假单胞

菌属的脂肪酶进行了固定化, 研究其固定前后的酶学性质和在催化不同油脂合成生物柴油过程中的应用表现。

[6-9]

测定脂肪酶的活性, 规定

每分钟释放1μm o l pNP 为一个酶活单位。1. 4. 3　酶的最适温度和热稳定性

最适温度测定:将固定化酶和游离酶分别置于不同的温度下, 测定其活力(p H 控制在7. 5)。

热稳定性比较:将固定化酶和游离酶在不同温度下的T ris -HC l bu ffer (p H 7. 5, 0. 05m ol L ) 中保

-1

1　材料与方法

1. 1　实验材料

脂肪酶Lipase PS 购于日本Am ano 公司; 大豆

油(精炼一级) 购于南海油脂工业有限公司, 橄榄油, 分析纯; 茶油、桐油、棉油、炸棉油、菜油均为市售油。

1. 2　试剂

甲醇为分析纯, 购于国药集团化学试剂有限公司; 四甲氧基硅烷(T MOS )、甲基三甲氧基硅烷(M T -M S )、氟化钠等其他试剂均为国产分析纯。1. 3　仪器

高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器总厂); 紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司); 恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司); Delta 320-S p H 计(梅特勒-托利多仪器有限公司); 79-2双向磁力加热搅拌器(金坛市正基仪器有限公司); 摇床(金坛市新航仪器厂); 电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司); 气相色谱仪GC -9790(温岭福立分析仪器有限公司); 漩涡混匀器(Sc ientificI ndustries 公司)。

1. 4　实验方法

1. 4. 1　脂肪酶的固定化

在15m L falcon t u be 中加入200m g Li p ase PS 和

2. 16m L Tris -HC l buffe r (p H

-1

育1h , 在37℃、Tris -H C l buffe r (p H 7. 5, 0. 05m o l L ) 中测定酶活, 定义未经处理酶的酶活为100%。1. 4. 4　酶的最适p H 和pH 稳定性

最适p H 测定:在37℃下, 改变缓冲液的种类和pH , 在不同的pH 条件下测定固定化酶和游离酶的活力。

pH 稳定性比较:将固定化酶和游离酶在4℃、不同的pH 下保育1h , 在37℃、Tris -HC l buffer (p H 7. 5, 0. 05m o l L ) 中测定酶活, 定义未经处理酶的酶活为100%。

1. 4. 5　酶促酯交换合成生物柴油

在50m L 具塞锥形瓶中, 加入4. 5g 大豆油、适量甲醇和水、一定量的固定化酶, 在摇床转速200r m in 、45℃,密封振荡反应48h , 离心之后取上清液用于甲酯含量分析。1. 4. 6　气相色谱分析方法

取样5μL , 用295μL 正己烷溶解, 加入300μL 内标物(十七碳酸甲酯正己烷溶液), 混匀, 取1μL 样品进样。

1. 4. 7　GC 分析条件

I N NO WAX 毛细管柱, 30m ×0. 25mm ×0. 25μm , 载气N 2, 柱前压0. 1MPa , 一阶程序升温, 温度由200℃升到235℃,升温速率3℃ m in , F I D 检测器, 气化室温度280℃,检测器温度280℃。

1. 4. 8　生物柴油得率计算公式

气相色谱分析得到的脂肪酸甲脂生物柴油的得率×100%

-1

7. 0,

-1

0. 05

m o l L ), 混匀, 加入200μL NaF (1m ol L )、适量PE G 400和异丙醇, 混匀5m in , 再加入2mm ol T ,

　2007年2月曾淑华等:固定化脂肪酶性质及其应用研究　47

10%,这表明经过固定化后酶的热稳定性得到了很

2　实验结果与讨论

2. 1　酶的最适反应温度

在30～70℃的范围内研究了固定化酶和游离酶的最适反应温度, 定义固定化酶和游离酶的最高比活力为100%,结果见图1。图1表明固定化酶和

游离酶的最适反应温度均为45℃,45℃之后随着温度的升高固定化酶的比活力下降速率明显小于游离酶比活力的下降速率, 当达到70℃时, 游离酶的比活力下降到42. 1%,而固定化酶仍能保持70. 2%,这表明酶经过固定化后有更广泛的温度使用范围

。

大的提高。

2. 3　酶的最适反应pH 研究

在p H 3-11的范围内比较了固定化酶和游离酶的最适反应p H 值, 定义固定化酶和游离酶的最高比活力为100%,结果见图3。从图3看出固定化酶的最适反应pH 值比游离酶向碱性方向移动了约0. 5个单位。可能因为有水解产物脂肪酸在固定化酶分子周围累积, 使这个区域的pH 值上升, 导致溶液中需要更多的OH -来抵制这种影响; 另外这种现象也与固

[11]

定化后酶活性中心的咪唑基的暴露有关。

图3　酶的最适p H

F i g . 3　O pti m ized p H of i m mobilized and free

图1　酶的最适反应温度

F ig . 1　O p ti m ized te m pe ra t ure of i m mobilized

and free lipase in reac tions

lipase i n reacti ons

2. 4　酶的p H 稳定性研究

在pH 3～11的范围内比较了固定化酶和游离

酶的p H 稳定性, 结果见图4。从图4看出, 在p H 3时游离酶的残余酶活约为11%,而固定化酶的残余酶活约为56%,在pH 大于7的环境中固定化酶能

2. 2　酶的热稳定性

在10～100℃范围内比较了固定化酶和游离酶

的热稳定性, 结果如图2所示。图2表明固定化酶在80℃以下能保持80%以上的酶活, 而游离酶在50℃以上酶活力急剧下降, 到80℃残余酶活约为

图2　酶的热稳定性

F ig . 2　E ffec t of te m pe ra t ure on stab ility of

m m obilized and free li pase i

图4　酶的p H 稳定性

F ig . 4　E ffec t of p H on st abilit y o f i m m ob ilized

and free lipa se

生物加工过程

第5卷第1期

保持约95%的酶活, 而游离酶却只能保持约90%的酶活, 这表明该酶在偏碱性的条件下有很好的稳定性, 而且酶经过固定化后稳定性得到一定程度提高。2. 5　短链醇对酶活力的影响

比较了固定化酶和游离酶对甲醇和乙醇耐受性, 分别隔0. 5, 8, 48h 取样测定残余酶活, 结果见表1。从表1看出, 固定化酶在50%的甲醇中处理48h 仍能保持85%的酶活, 而游离酶只剩余69%的酶活; 在体积分数90%的乙醇中处理48h 之后固定化酶残余酶活为31%,而游离酶在处理0. 5h 时已全部失活。该结果表明固定化酶比游离酶有更好的短链醇耐受性。由于在酶催化醇与油合成生物柴油的过程中, 醇用量一般小于50%

[1, 3, 12-13]

90. 7%。该结果与油脂组成和精练程度有关, 其他几种市售的油中由于含有较多的水分和游离脂肪酸, 可能抑制了酯交换反应的进行。另外, 得到的固定化酶催化大豆油生产生物柴油的得率比An -Fei H su 等

[2]

报道的高出约30%,这表明该固定化酶在

生物柴油的合成过程中具有巨大的应用潜力和经济价值。

, 故该

固定化酶在生物柴油合成过程中具有巨大的应用价值。

表1　短链醇对酶活力的影响

Table 1　Effect o f sho rt cha i n a l coho ls on enzym e activ iti e s

浓度溶剂

/%甲醇乙醇

5090204090

[1**********]9

残余酶活/%

0. 5h

固定化酶

游离酶

图5　固定化酶催化不同底物与甲醇的酯交换反应

48h

固定化酶

游离酶

F i g . 5　I mm obilized lipase cata l y zing transest e rifi ca tion o f

69010080

固定化酶游离酶

830100940

[1**********]

760100880

8522998731

diffe rent substrates and m ethano l

2. 8　酶的操作稳定性研究

将固定化酶连续催化大豆油和甲醇酯交换反

-1

应11次, 在8000r m in 下离心30m in 回收, 用异丙醇反复冲洗, 测定其酶活, 结果见图6。图6表明, 固定化酶连续催化底物反应11次后仍能保持约60%的酶活, 这说明固定化酶有较好的操作稳定性。

2. 6　酶促反应动力学参数研究

利用pNPP 为水解底物, 测定了固定化酶和游

离酶的反应动力学参数, 通过Line w eaver -Bur k 作图得固定化酶的K m 值为4. 04mmo l L , V max 值为12. 3mm ol (m in m g ) , 而游离酶的K m 值为13. 64mmo l L , V m ax 值为8. 0mm ol (m in m g ) 。该结果表明, 固定化酶对底物有更好的亲和性, 而且在相同的条件下具有更强的催化能力。导致这种现象可能的原因是溶胶前驱体中疏水性的烷烃基与酶活性中心α-螺旋疏水性的侧链发生疏水作用, 使酶活性中心的“盖子”结构被打开, 出现界面活化现象, 使酶分子的活性得到提高。2. 7　催化不同油脂与甲醇的酯交换反应比较

比较了固定化酶和游离酶催化不同的油脂与甲醇酯交换反应情况, 结果见图5。从图5看出固定化酶的催化效率比游离酶高10%～20%。对于不同的油脂而言, 固定化酶对大豆油的转化率较其

, [14]

-1

图6　固定化酶的操作稳定性

F ig . 6　Operati onal stability o f i mm ob ilized lipa se

3　结　论

脂肪酶的应用是当今生物工程领域研究的热-

　2007年2月曾淑华等:固定化脂肪酶性质及其应用研究　49

PS 与游离Lipase PS 的酶学性质以及其催化油脂合成生物柴油的情况。结论是固定化酶比游离酶有更好的温度稳定性、p H 稳定性和对短链醇的耐受

[15]

性, 而且远高于目前文献报道的根霉、扩展青霉

[16]

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、酵母

[17]

和恶臭假单胞菌

[18]

等属产的脂肪酶

的稳定性; 该酶在催化大豆油和甲醇合成生物柴油的过程中表现出非常高的催化活性, 甲酯的最终得

率可达到96. 33%,而且连续使用11次后仍保持约60%的酶活; 此外, 固定化酶回收方便, 在有机溶剂中的分散性好, 这些优越的性质为该固定化酶在生物合成与转化的工业化应用方面奠定了良好的基础。参考文献:

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