肝癌细胞培养
一、 培养基
1、 RPMI-1640+10%胎牛血清培养基
2、 DMEM+15%胎牛血清培养基
成分表
二、 实验前准备工作:
操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用酒精消毒。用紫外线消毒实验室空气、工作台面和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿。进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射30min进行消毒。紫外线照射60min可以消灭空气中大部分细菌。
1、玻璃器皿的清洗灭菌（5％盐酸溶液、重鉻酸钾120ml、硫酸200ml、蒸馏水200ml）：
（1）浸泡:新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。
（2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后经行烘干。
（3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。清洁液具有极强酸蚀作用，操作过程需戴防护用具。
（4）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次，将清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。
（5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。
2、橡胶制品清洗消毒：
0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用
3、塑料制品的清洗消毒（瓶盖、离心管）：
使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备用。
三、细胞复苏：
冻存细胞保存管保存在液氮中（-196℃），取出保存管后必须快速冷冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，致使细胞死亡。在冻存细胞的保存管中含有对细胞有毒害的成分DMSO,故在解冻应马上将其去除。在冷冻活化前应在无菌台上将细胞培养液配好，然后将保存管从液氮中取出，放于37℃的温水中快速使细胞解冻。解冻后悬液快速移入培养液中混匀，离心去掉上清液，再加入细胞培养液。
实验人员穿上无菌实验室操作服用酒精喷于手上消毒，然后就位用酒精棉球擦拭实验台
（1）取一15ml离心管用滴管在其内滴加5--9ml培养液（取8ml）。
（2）从液氮罐中取出冻存管，并迅速放入37℃水浴，不时摇动，使其急速融化，30～60s内完成。
（3）冻存管用70％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液转移入上述离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来）。
（4）低速离心(1000r／min) 5min，去上清后再用8ml培养液再清洗离心一次。
（5）离心后倒掉上清液，在离心管中滴加3ml培养液（RPMI-1640），混匀（可用滴管轻柔吹打）。
（6）将离心管中的混合液转移到培养瓶中，并在培养瓶中滴加15滴10%小牛血清，盖上瓶盖，标好细胞种类和日期、培养人姓名等，将培养瓶平放，置于37°C培养箱中培养。2-3天换一次培养基。
四、细胞传代：
当观察到培养瓶中细胞铺满度为90%时（细胞生长处于对数期时），解冻复活成功后的细胞要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中培养的过程称之为传代培养。传代细胞细胞株的最大利处在于提供了大量持久的实验材料，便于实验。
（1）试验台的消毒工作准备好，弃去旧培养液，用PBS液（不含钙，镁离子）洗1-2次，以免剩余培养液影响胰蛋白酶活性。（细胞贴壁生长）。
（2）向瓶内加入1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mEDTA），置于37℃孵箱或室温（25℃温度）下进行消化，1--3min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化（将培养瓶翻转过来，以保证细胞没有脱壁）。
备注：若细胞没有脱壁，生长良好，则直接倒掉消化液，加培养液8ml，离心收集细胞；若发现很多细胞已解离已脱壁（即解离过度），则直接加培养液进行离心收集细胞。
（4）倒出消化液，向瓶内用滴管加入培养液少量（约2ml），轻轻转动培养瓶，把残留胰蛋白液消化液冲掉，然后再加3ml培养液+15滴小牛血清。
（5）使用吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞。
（6）将准备好的细胞悬液转入离心管中，离心(1000r／min) 5min。
（7）将离心后离心管中液体倒掉，在离心管中加入3ml培养液，并反复吹打细胞，制成细胞悬液。
（8）取3个无菌培养瓶，酒精棉球擦拭消毒，并在酒精灯下过火消毒。
（9）在培养瓶中各加入1ml细胞悬液、2ml培养液（用移液枪）、15滴小牛血清，加好后酒精灯下过火加塞。
（10）细胞培养换液时间应根据细胞生长的状态和实验要求来确定。一般2～3d后应换一次生长液。待细胞铺满器皿底面，即可使用；也可继续传代扩大培养或换成维持液。
五、细胞冻存：
细胞的冻存最常用的方法是液氮冷冻保存法，主要是加入适量的保护剂缓慢的冷冻细胞。由于细胞在不加任何保护剂的情况下，细胞内外水分会很快结成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度升高，PH值改变，部分蛋白质因此变性使细胞内部结构紊乱，溶酶体膜被破坏而放出大量酶将细胞内部结构破坏。因此在细胞冻存时的关键是尽可能减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成，故冻存时采用甘油或DMSO做保护剂，这两种物质分子量较小，溶解度大，易穿透细胞，可使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，对细胞毒害作用小，梯度慢速冷冻可使细胞内水分渗出细胞外，减少形成冰晶对细胞产生的伤害。细胞低温冻存是培养室常规工作和通用技术。细胞冻存在-196℃液氮中，储存时间几乎是无限的。细胞冻存及复苏的原则是慢冻快融。
（1）选对数增生期细胞(细胞铺满度为90%左右时)，在冻存前1d换液。
（2）试验台的消毒工作准备好，倒掉培养瓶内旧培养液。
（3）向瓶内加入1ml 0.25%胰蛋白酶液，以能覆盖培养瓶底为宜。
（4）置37℃孵箱或室温（25℃温度）下进行消化，1--3min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化。
（5）吸出消化液，在吸除胰蛋白液后，直接加入3ml培养液+15滴小牛血清，终止消化。
（6）使用弯头吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞，按常规方法把培养细胞制备成悬液。
（7）将培养瓶中的细胞悬液转移到15ml离心管中，(1200r／min) 6min，去掉上清液。再加3ml培养液按常规方法形成细胞悬液。
（8）配制冻存培养液（培养液7ml，10%小牛血清2ml，10%DMSO 1ml），于离心管中加入1ml细胞悬液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀。
（9）将细胞悬液分装入无菌冻存管中，每管1.5 ml（冻存液要先预冷到4℃）；在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。
（10）冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/ min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入液氮气中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
肝癌细胞培养
一、 培养基
1、 RPMI-1640+10%胎牛血清培养基
2、 DMEM+15%胎牛血清培养基
成分表
二、 实验前准备工作:
操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用酒精消毒。用紫外线消毒实验室空气、工作台面和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿。进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射30min进行消毒。紫外线照射60min可以消灭空气中大部分细菌。
1、玻璃器皿的清洗灭菌（5％盐酸溶液、重鉻酸钾120ml、硫酸200ml、蒸馏水200ml）：
（1）浸泡:新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。
（2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后经行烘干。
（3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。清洁液具有极强酸蚀作用，操作过程需戴防护用具。
（4）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次，将清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。
（5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。
2、橡胶制品清洗消毒：
0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用
3、塑料制品的清洗消毒（瓶盖、离心管）：
使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备用。
三、细胞复苏：
冻存细胞保存管保存在液氮中（-196℃），取出保存管后必须快速冷冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，致使细胞死亡。在冻存细胞的保存管中含有对细胞有毒害的成分DMSO,故在解冻应马上将其去除。在冷冻活化前应在无菌台上将细胞培养液配好，然后将保存管从液氮中取出，放于37℃的温水中快速使细胞解冻。解冻后悬液快速移入培养液中混匀，离心去掉上清液，再加入细胞培养液。
实验人员穿上无菌实验室操作服用酒精喷于手上消毒，然后就位用酒精棉球擦拭实验台
（1）取一15ml离心管用滴管在其内滴加5--9ml培养液（取8ml）。
（2）从液氮罐中取出冻存管，并迅速放入37℃水浴，不时摇动，使其急速融化，30～60s内完成。
（3）冻存管用70％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液转移入上述离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来）。
（4）低速离心(1000r／min) 5min，去上清后再用8ml培养液再清洗离心一次。
（5）离心后倒掉上清液，在离心管中滴加3ml培养液（RPMI-1640），混匀（可用滴管轻柔吹打）。
（6）将离心管中的混合液转移到培养瓶中，并在培养瓶中滴加15滴10%小牛血清，盖上瓶盖，标好细胞种类和日期、培养人姓名等，将培养瓶平放，置于37°C培养箱中培养。2-3天换一次培养基。
四、细胞传代：
当观察到培养瓶中细胞铺满度为90%时（细胞生长处于对数期时），解冻复活成功后的细胞要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中培养的过程称之为传代培养。传代细胞细胞株的最大利处在于提供了大量持久的实验材料，便于实验。
（1）试验台的消毒工作准备好，弃去旧培养液，用PBS液（不含钙，镁离子）洗1-2次，以免剩余培养液影响胰蛋白酶活性。（细胞贴壁生长）。
（2）向瓶内加入1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mEDTA），置于37℃孵箱或室温（25℃温度）下进行消化，1--3min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化（将培养瓶翻转过来，以保证细胞没有脱壁）。
备注：若细胞没有脱壁，生长良好，则直接倒掉消化液，加培养液8ml，离心收集细胞；若发现很多细胞已解离已脱壁（即解离过度），则直接加培养液进行离心收集细胞。
（4）倒出消化液，向瓶内用滴管加入培养液少量（约2ml），轻轻转动培养瓶，把残留胰蛋白液消化液冲掉，然后再加3ml培养液+15滴小牛血清。
（5）使用吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞。
（6）将准备好的细胞悬液转入离心管中，离心(1000r／min) 5min。
（7）将离心后离心管中液体倒掉，在离心管中加入3ml培养液，并反复吹打细胞，制成细胞悬液。
（8）取3个无菌培养瓶，酒精棉球擦拭消毒，并在酒精灯下过火消毒。
（9）在培养瓶中各加入1ml细胞悬液、2ml培养液（用移液枪）、15滴小牛血清，加好后酒精灯下过火加塞。
（10）细胞培养换液时间应根据细胞生长的状态和实验要求来确定。一般2～3d后应换一次生长液。待细胞铺满器皿底面，即可使用；也可继续传代扩大培养或换成维持液。
五、细胞冻存：
细胞的冻存最常用的方法是液氮冷冻保存法，主要是加入适量的保护剂缓慢的冷冻细胞。由于细胞在不加任何保护剂的情况下，细胞内外水分会很快结成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度升高，PH值改变，部分蛋白质因此变性使细胞内部结构紊乱，溶酶体膜被破坏而放出大量酶将细胞内部结构破坏。因此在细胞冻存时的关键是尽可能减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成，故冻存时采用甘油或DMSO做保护剂，这两种物质分子量较小，溶解度大，易穿透细胞，可使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，对细胞毒害作用小，梯度慢速冷冻可使细胞内水分渗出细胞外，减少形成冰晶对细胞产生的伤害。细胞低温冻存是培养室常规工作和通用技术。细胞冻存在-196℃液氮中，储存时间几乎是无限的。细胞冻存及复苏的原则是慢冻快融。
（1）选对数增生期细胞(细胞铺满度为90%左右时)，在冻存前1d换液。
（2）试验台的消毒工作准备好，倒掉培养瓶内旧培养液。
（3）向瓶内加入1ml 0.25%胰蛋白酶液，以能覆盖培养瓶底为宜。
（4）置37℃孵箱或室温（25℃温度）下进行消化，1--3min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化。
（5）吸出消化液，在吸除胰蛋白液后，直接加入3ml培养液+15滴小牛血清，终止消化。
（6）使用弯头吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞，按常规方法把培养细胞制备成悬液。
（7）将培养瓶中的细胞悬液转移到15ml离心管中，(1200r／min) 6min，去掉上清液。再加3ml培养液按常规方法形成细胞悬液。
（8）配制冻存培养液（培养液7ml，10%小牛血清2ml，10%DMSO 1ml），于离心管中加入1ml细胞悬液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀。
（9）将细胞悬液分装入无菌冻存管中，每管1.5 ml（冻存液要先预冷到4℃）；在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。
（10）冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/ min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入液氮气中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。