598
doi:10．3969／j．issn．1009－0002．2009．04．041
LETTERS IN BIOTECHNOLOGY
生物技术通讯
Vol．20No．4July, 2009
综述
实时荧光定量PCR 的发展和数据分析
纪冬1,2，辛绍杰1,2
1．解放军军医进修学院，北京100853；2．解放军第302医院，北京100039
［摘要］
实时荧光定量PCR 技术是基因时代一项用于检测mRNA 的常用技术，是临床检测和基础研究中不可缺少的重要
研究方法，包括绝对定量PCR 和相对定量PCR 。该技术的特点是可以减少PCR 后操作，在比较不同浓度的mRNA 方面具有非常宽的动力学范围。我们就目前实时荧光定量PCR 的发展及数据的分析进行综述。［关键词］
实时荧光PCR ；定量分析；方法学
［中图分类号］
Q789［文献标识码］A ［文章编号］1009－0002(2009)04－0598－03
Development and Data Analysis of Real－TimeFluorescent Quantitative PCR
JI Dong 1,2, XIN Shao－jie1,2
1．Military Postgraduate Medical School, Beijing 100853; 2．The 302Hospital of PLA, Beijing 100039; China
［Abstract ］
The real－time,fluorescence－basedreverse transcription polymerase chain reaction is one of the enabling tech-plays important roles in
nologies of the genomic age and has become the method of choice for the detection of mRNA, lute and relative quantification．
clinical examinations and basic theory research．Two different methods of presenting quantitative gene expression are abso-Several factors have contributed to the transformation of this technology into a mainstream
research tool:it avoids the need for post－PCRprocessing; it has a wide dynamic range which allows straightforward com-parison between RNAs that differ widely in their abundance; and it realises the inherent quantitative potential of the PCR, making it a quantitative as well as qualitative assay．In this article, the development and data analysis of real－timefluo-rescent quantitative PCR were overviewed．
［Key words ］
real－timePCR; quantification; methodology
后是相同的。实际上，不同样本的平台期是不一样的，通过反应终点浓度进行的定量分析，可以将反应效率中很小的差别放大出来。因此，此方法目前仅在基因剔除研究中表示双向关系（表达／不表达）时使用[7]。
以上这些原因促进了实时定量PCR 的发展。实时定量PCR 技术是在反转录技术上发展起来的，可以对基因表达水平进行常规和精确定量。此技术的产生得益于Taq DNA 聚合酶5＇→3＇外切酶活性的发现和荧光共振能量转移（fluorescence resonance
自从1983年Kary Mullis 发明了聚合酶链反应（polymerase
chain reaction ，PCR ）技术以来，生物技术发展迅猛。早期的PCR
定量方法都是依赖于产物的终点浓度进行分析的，而随着实时（real－time）PCR 的发明，定量技术才得以发挥重要作用[1－4]。
1
1．1
实时荧光定量PCR 的发展
核酸定量分析的重要性
生物的生长、发育、衰老和病变通常由基因在不同阶段和部
energy transfer ，FRET ）的应用[8]，它通过对PCR 的每个循环的扩
增产物进行实时检测，克服了终点法定量的不准确性，也减少了终点检测带来交叉污染的机会。目前实时定量PCR 已被广泛应用于生命科学研究。
位的差异表达来决定。基因表达差异最终表现为蛋白质合成量的差异，并在一定程度上决定细胞的激活、增殖、分化、病变和凋亡。定量分析mRNA ，是了解机体生长发育调控和病变机理的一个重要方面[5]。
在分子生物学领域，很多方法都可以用来进行靶基因的定量研究，这些方法包括Northern ／Southern 杂交、高效液相色谱（HPLC ）、PCR－ELISA、RNA 酶保护分析、原位杂交等。但这些方法均存在耗时、费力、敏感性差、需要运用放射性元素或潜在交叉污染的可能性等缺陷[6]。基于凝胶电泳终点的定量PCR 技术也有着明显的限制：①扩增出来的DNA 产物需要通过琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭（EB ）染色后才可以显示出来，这些都消耗时间并且不易于定量；②由于酶动力学的特点，PCR 反应过程中存在指数期、线性期和平台期，理论上来说所有样本的DNA 扩增量最
1．2实时荧光定量PCR 的原理及类型
实时荧光定量PCR 技术是指在PCR 反应体系中加入荧光
基团（染料或探针），利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程。荧光染料能特异性掺入DNA 双链，发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR 产物增加完全同步。荧光探针是在探针的
5＇端标记一个荧光报告基团（R ），3＇端标记一个淬灭基团（Q ），两
［收稿日期］［基金项目］［作者简介］［通信作者］
2008－12－01
国家自然科学基金面上项目（30700713）纪冬（1975－），男，主治医师，博士研究生辛绍杰，（E－mail）xsj302＠yahoo．com．cn
纪冬等：实时荧光定量PCR 的发展和数据分析
者可构成能量传递结构，即5＇端荧光基团所发出的荧光可被淬灭基团吸收或抑制，当两者距离较远时，抑制作用消失，报告基团荧光信号增强，荧光监测系统可收到荧光信号。
定量的原理：靶基因初始拷贝数越多，所产生的循环阈值（cycle threshold ，C T ）越小。这里有2个问题需要明确：①荧光阈值的设定：在定量PCR 中，需要经过数个循环后荧光信号才能够被检测到，一般以前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号；
599
1．4．3
细菌、病毒、真菌载量的测定
实时荧光定量PCR 可以在
DNA 混合样本中识别特异性序列，因此可以用来检测样本中病
原特异性或其他独特的序列[15]。
1．4．4
（SNP ）
通过熔解曲线检测突变或进行单核苷酸多态性分析在熔解曲线分析中，随着温度的上升，供体引物会游离
出来从而引起荧光的下降。如果在杂交区存在突变，供体引物与模板结合的紧密程度下降，会以较低的温度游离出来，因此突变可以通过PCR 产物熔点的变化而轻松区别开来。这种方法也可用来进行基因分型[16－17]。
②C T 值为PCR 过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时
所经过的循环次数。根据荧光产生的原理，可将实时荧光定量
PCR 分为不同类型[9]（表1）。
表1实时荧光定量PCR 技术分类
技术
供应商
荧光信号
多重PCR 熔解曲线不可可可可可
必需不需不需必需必需
2
2．1
实时荧光定量PCR 的数据分析
数据分析的方法
随着技术的发展，实时荧光定量PCR 的数据分析也上升到
SYBR Green Ⅰ多个Taqman Applied Biosystems Light cycle Roche 分子信标Sigma－Aldrich，IDT LUX Invitrogen
DNA 内部掺入水解探针
双杂交探针
发卡样杂交探针荧光引物
了一个新的水平。绝对定量常用于临床诊断，对特定靶基因（如
HBV DNA ），此方法可以高通量地准确定量，对于疾病的诊断、
治疗具有指导意义。相对定量的结果一般为靶基因经处理与未处理的表达差异倍数，在生命科学理论研究中，相对定量方法使用较多，因为更加容易实施，并且对于疾病状态的检测更加有意义。但是，相对定量的数据分析经常被研究者所忽视[18－19]。
在使用相对定量时，首先要考虑的是数据如何呈现。需要注意的是，C T 值是指数关系，而不是线性关系，不能用于t 检验或方差分析（ANOVA ）这些需要正态分布的统计分析方法。有些研究者直接使用原始C T 值进行统计学分析，这在方法学上是错误的。统计数据时应将原始C T 值进行2－CT 转换，从而达到线性关系。
相对定量常用的方法是比较C T 值法（2－ΔΔC T 法）。此方法基于
1．3实时荧光定量PCR 的特点
实时荧光定量PCR 最大的特点就是对于核酸定量具有非常
宽的动力学范围（至少5log 单位）。与之而来的还有如下优点：①极高的敏感度，可以对小于5拷贝的靶基因序列进行定量分析；
②可以分析极其微小的基因表达差异；③可以相对快速、高通量
地自动分析；④在密闭的反应器中进行反应，不需要PCR 后操作，可以最小化交叉污染的可能性。
实时荧光定量PCR 的不足之处：①PCR 的固有缺点，PCR 反应可以被存在于特定样本中的物质所抑制；②RNA 样品易降解；③最大的限制不是PCR 固有缺点，而是人为因素，如不正确的数据分析或未经确认的结果。因此，引物必须进行严谨的设计及验证，以确保结果的特异性和准确性；若用于检测病原，假阳性／假阴性必须考虑；扩增和熔解曲线必须进行双检验以保证结果的准确性；关于mRNA 水平的基因表达分析结果仅仅能提示蛋白水平或功能学的改变，而不是确证[10]。
2个假设：①扩增效率为100％：每个PCR 循环产物的量都翻倍，
这可以通过扩增效率的验证来解决；②有合适的内参以纠正上样量的误差。步骤：①选择合适的内参；②内参与靶基因扩增效率验证；③统计学分析，处理组与未处理组之间经转换后C T 值的比较；④得出结论：相对于未处理组，处理组中靶基因的表达相对于内参的改变倍数。最终计算公式：①改变的倍数（fold
1．4实时荧光定量PCR 的应用
实时荧光定量PCR 应用广泛，涉及生物医药、分子诊断等多
change ）＝2－ΔΔC T ；②ΔΔC T ＝（C T 靶基因－CT 内参）处理组－（C T 靶基因－CT
内参）未处理组[20－23]。
个不同领域[11－13]。2．2
绝对定量是用已知的标准
内参的选择
由于PCR 的高敏感性，不可避免地会出现实验误差，因此正
1．4．1基因表达的相对／绝对定量
曲线来推算未知样本的量，将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR 反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的
确选择内参是必需的。样本间的误差可以干扰数据分析，必需通过1个或多个内参进行标准化。正确选择内参可以平均起始样本质和量的误差，以及反应效率的误差。内参须满足：①在研究中样本之间的表达是相似的；②处理因素不会影响其表达；③与待测基因同时进行相同的扩增。在开始实验之前，须对所选择的内参进行上述分析。常用的内参有3－磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH ）、β－肌动蛋白、β2－微球蛋白、18S 核糖体RNA 、葡萄糖－6－磷酸脱氢酶（G6PDH ）等[24]。
近年来的研究发现，有些实验因素可以改变内参基因的表达，需要引入多个内参进行分析（basket approach ），虽然这样做需要大量的人力和花费，但这种平均化可以减少处理因素对内参基因的影响，并且提高结果的严谨性。Basket 方法在处理因素明显改变所有基因表达或比较不同组织之间的差异是非常有用的。但对于多数既定基因的研究并非必需。作为内参基因的一种替代，可以使用人工合成的已知浓度的标准RNA 。合成的标准
C T 值为纵坐标，绘制标准曲线，对未知样品进行定量时，根据未
知样品的C T 值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。质粒
DNA 和体外转录的RNA 常作为绝对定量的标准品。相对定量指
的是在一定样本中靶基因相对于另一参照基因的量的变化。
1．4．2DNA 芯片结果的验证由于实时荧光定量PCR 的准确
性和敏感性，在基因表达中极微小的差异都可以被检测出来，因此可以迅速、轻松地对大量样本的基因芯片结果进行验证研究。通常情况下，如果待测基因或途径是已知的，那么全基因组的现象研究是不必要的，因此，数据的收集也可以开始于定量PCR 。另外，已经明确的靶基因可以通过定量PCR 进行大样本（1000例）筛查。针对样本的数量和检测基因的数量有不同的研究技术，当检测基因数量下降而样本数量上升时，技术类型就从“发现“（现象）到“证实”[14]。
600
RNA 与靶基因除了中间稍短一些外，其他均相同，可以在PCR
中使用与靶基因相同的引物，并且可以通过大小加以区别。或者，标准RNA 与靶基因在序列上只存在1个点突变，这样在大小、序列、二级结构上二者一致，但需要对PCR 产物进行内切酶处理，从而区分出标准RNA 和靶基因。合成标准RNA 虽然在扩增效率的标准化及绝对或相对定量中非常有意义，但由于RNA 很难合成且降解很快，使得该方法更加昂贵和难于操作[25－26]。
LETTERS IN BIOTECHNOLOGY
生物技术通讯
Vol．20No．4July, 2009
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Curr Ge-Anal Exp Mol
2．3引物／探针资源
随着实时荧光定量PCR 及对应的引物／探针应用的增加，研
究者并不需要自行设计引物及探针，因为这样做会花费很多时间。目前有很多数据库包含了已验证的不同种属数以万计的基因相应的引物及探针，研究者可以使用这些序列或购买成品，这样做可以加快实验进程，并且减少为优化引物／探针而额外做的工作。这些数据库包括Primer Bank （http:∥pga．mgh．harvard．edu／
primerbank ）、QPDO （http:∥web．ncifcrf．gov／rtp ／geVprimerdb ）等。
3结语
PCR 已发明了25年，实时荧光定量PCR 的应用也已20年，
这些研究技术在生命科学研究中进一步的发展方向应该包括敏感性、信噪比，以及同时检测多个基因（高通量）等内容。这些技术的进步可以使得实时荧光定量PCR 在相当长的时间内仍然是基因表达分析的主要研究工具之一。
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实时荧光定量PCR 的发展和数据分析
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［摘要］
实时荧光定量PCR 技术是基因时代一项用于检测mRNA 的常用技术，是临床检测和基础研究中不可缺少的重要
研究方法，包括绝对定量PCR 和相对定量PCR 。该技术的特点是可以减少PCR 后操作，在比较不同浓度的mRNA 方面具有非常宽的动力学范围。我们就目前实时荧光定量PCR 的发展及数据的分析进行综述。［关键词］
实时荧光PCR ；定量分析；方法学
［中图分类号］
Q789［文献标识码］A ［文章编号］1009－0002(2009)04－0598－03
Development and Data Analysis of Real－TimeFluorescent Quantitative PCR
JI Dong 1,2, XIN Shao－jie1,2
1．Military Postgraduate Medical School, Beijing 100853; 2．The 302Hospital of PLA, Beijing 100039; China
［Abstract ］
The real－time,fluorescence－basedreverse transcription polymerase chain reaction is one of the enabling tech-plays important roles in
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clinical examinations and basic theory research．Two different methods of presenting quantitative gene expression are abso-Several factors have contributed to the transformation of this technology into a mainstream
research tool:it avoids the need for post－PCRprocessing; it has a wide dynamic range which allows straightforward com-parison between RNAs that differ widely in their abundance; and it realises the inherent quantitative potential of the PCR, making it a quantitative as well as qualitative assay．In this article, the development and data analysis of real－timefluo-rescent quantitative PCR were overviewed．
［Key words ］
real－timePCR; quantification; methodology
后是相同的。实际上，不同样本的平台期是不一样的，通过反应终点浓度进行的定量分析，可以将反应效率中很小的差别放大出来。因此，此方法目前仅在基因剔除研究中表示双向关系（表达／不表达）时使用[7]。
以上这些原因促进了实时定量PCR 的发展。实时定量PCR 技术是在反转录技术上发展起来的，可以对基因表达水平进行常规和精确定量。此技术的产生得益于Taq DNA 聚合酶5＇→3＇外切酶活性的发现和荧光共振能量转移（fluorescence resonance
自从1983年Kary Mullis 发明了聚合酶链反应（polymerase
chain reaction ，PCR ）技术以来，生物技术发展迅猛。早期的PCR
定量方法都是依赖于产物的终点浓度进行分析的，而随着实时（real－time）PCR 的发明，定量技术才得以发挥重要作用[1－4]。
1
1．1
实时荧光定量PCR 的发展
核酸定量分析的重要性
生物的生长、发育、衰老和病变通常由基因在不同阶段和部
energy transfer ，FRET ）的应用[8]，它通过对PCR 的每个循环的扩
增产物进行实时检测，克服了终点法定量的不准确性，也减少了终点检测带来交叉污染的机会。目前实时定量PCR 已被广泛应用于生命科学研究。
位的差异表达来决定。基因表达差异最终表现为蛋白质合成量的差异，并在一定程度上决定细胞的激活、增殖、分化、病变和凋亡。定量分析mRNA ，是了解机体生长发育调控和病变机理的一个重要方面[5]。
在分子生物学领域，很多方法都可以用来进行靶基因的定量研究，这些方法包括Northern ／Southern 杂交、高效液相色谱（HPLC ）、PCR－ELISA、RNA 酶保护分析、原位杂交等。但这些方法均存在耗时、费力、敏感性差、需要运用放射性元素或潜在交叉污染的可能性等缺陷[6]。基于凝胶电泳终点的定量PCR 技术也有着明显的限制：①扩增出来的DNA 产物需要通过琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭（EB ）染色后才可以显示出来，这些都消耗时间并且不易于定量；②由于酶动力学的特点，PCR 反应过程中存在指数期、线性期和平台期，理论上来说所有样本的DNA 扩增量最
1．2实时荧光定量PCR 的原理及类型
实时荧光定量PCR 技术是指在PCR 反应体系中加入荧光
基团（染料或探针），利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程。荧光染料能特异性掺入DNA 双链，发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR 产物增加完全同步。荧光探针是在探针的
5＇端标记一个荧光报告基团（R ），3＇端标记一个淬灭基团（Q ），两
［收稿日期］［基金项目］［作者简介］［通信作者］
2008－12－01
国家自然科学基金面上项目（30700713）纪冬（1975－），男，主治医师，博士研究生辛绍杰，（E－mail）xsj302＠yahoo．com．cn
纪冬等：实时荧光定量PCR 的发展和数据分析
者可构成能量传递结构，即5＇端荧光基团所发出的荧光可被淬灭基团吸收或抑制，当两者距离较远时，抑制作用消失，报告基团荧光信号增强，荧光监测系统可收到荧光信号。
定量的原理：靶基因初始拷贝数越多，所产生的循环阈值（cycle threshold ，C T ）越小。这里有2个问题需要明确：①荧光阈值的设定：在定量PCR 中，需要经过数个循环后荧光信号才能够被检测到，一般以前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号；
599
1．4．3
细菌、病毒、真菌载量的测定
实时荧光定量PCR 可以在
DNA 混合样本中识别特异性序列，因此可以用来检测样本中病
原特异性或其他独特的序列[15]。
1．4．4
（SNP ）
通过熔解曲线检测突变或进行单核苷酸多态性分析在熔解曲线分析中，随着温度的上升，供体引物会游离
出来从而引起荧光的下降。如果在杂交区存在突变，供体引物与模板结合的紧密程度下降，会以较低的温度游离出来，因此突变可以通过PCR 产物熔点的变化而轻松区别开来。这种方法也可用来进行基因分型[16－17]。
②C T 值为PCR 过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时
所经过的循环次数。根据荧光产生的原理，可将实时荧光定量
PCR 分为不同类型[9]（表1）。
表1实时荧光定量PCR 技术分类
技术
供应商
荧光信号
多重PCR 熔解曲线不可可可可可
必需不需不需必需必需
2
2．1
实时荧光定量PCR 的数据分析
数据分析的方法
随着技术的发展，实时荧光定量PCR 的数据分析也上升到
SYBR Green Ⅰ多个Taqman Applied Biosystems Light cycle Roche 分子信标Sigma－Aldrich，IDT LUX Invitrogen
DNA 内部掺入水解探针
双杂交探针
发卡样杂交探针荧光引物
了一个新的水平。绝对定量常用于临床诊断，对特定靶基因（如
HBV DNA ），此方法可以高通量地准确定量，对于疾病的诊断、
治疗具有指导意义。相对定量的结果一般为靶基因经处理与未处理的表达差异倍数，在生命科学理论研究中，相对定量方法使用较多，因为更加容易实施，并且对于疾病状态的检测更加有意义。但是，相对定量的数据分析经常被研究者所忽视[18－19]。
在使用相对定量时，首先要考虑的是数据如何呈现。需要注意的是，C T 值是指数关系，而不是线性关系，不能用于t 检验或方差分析（ANOVA ）这些需要正态分布的统计分析方法。有些研究者直接使用原始C T 值进行统计学分析，这在方法学上是错误的。统计数据时应将原始C T 值进行2－CT 转换，从而达到线性关系。
相对定量常用的方法是比较C T 值法（2－ΔΔC T 法）。此方法基于
1．3实时荧光定量PCR 的特点
实时荧光定量PCR 最大的特点就是对于核酸定量具有非常
宽的动力学范围（至少5log 单位）。与之而来的还有如下优点：①极高的敏感度，可以对小于5拷贝的靶基因序列进行定量分析；
②可以分析极其微小的基因表达差异；③可以相对快速、高通量
地自动分析；④在密闭的反应器中进行反应，不需要PCR 后操作，可以最小化交叉污染的可能性。
实时荧光定量PCR 的不足之处：①PCR 的固有缺点，PCR 反应可以被存在于特定样本中的物质所抑制；②RNA 样品易降解；③最大的限制不是PCR 固有缺点，而是人为因素，如不正确的数据分析或未经确认的结果。因此，引物必须进行严谨的设计及验证，以确保结果的特异性和准确性；若用于检测病原，假阳性／假阴性必须考虑；扩增和熔解曲线必须进行双检验以保证结果的准确性；关于mRNA 水平的基因表达分析结果仅仅能提示蛋白水平或功能学的改变，而不是确证[10]。
2个假设：①扩增效率为100％：每个PCR 循环产物的量都翻倍，
这可以通过扩增效率的验证来解决；②有合适的内参以纠正上样量的误差。步骤：①选择合适的内参；②内参与靶基因扩增效率验证；③统计学分析，处理组与未处理组之间经转换后C T 值的比较；④得出结论：相对于未处理组，处理组中靶基因的表达相对于内参的改变倍数。最终计算公式：①改变的倍数（fold
1．4实时荧光定量PCR 的应用
实时荧光定量PCR 应用广泛，涉及生物医药、分子诊断等多
change ）＝2－ΔΔC T ；②ΔΔC T ＝（C T 靶基因－CT 内参）处理组－（C T 靶基因－CT
内参）未处理组[20－23]。
个不同领域[11－13]。2．2
绝对定量是用已知的标准
内参的选择
由于PCR 的高敏感性，不可避免地会出现实验误差，因此正
1．4．1基因表达的相对／绝对定量
曲线来推算未知样本的量，将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR 反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的
确选择内参是必需的。样本间的误差可以干扰数据分析，必需通过1个或多个内参进行标准化。正确选择内参可以平均起始样本质和量的误差，以及反应效率的误差。内参须满足：①在研究中样本之间的表达是相似的；②处理因素不会影响其表达；③与待测基因同时进行相同的扩增。在开始实验之前，须对所选择的内参进行上述分析。常用的内参有3－磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH ）、β－肌动蛋白、β2－微球蛋白、18S 核糖体RNA 、葡萄糖－6－磷酸脱氢酶（G6PDH ）等[24]。
近年来的研究发现，有些实验因素可以改变内参基因的表达，需要引入多个内参进行分析（basket approach ），虽然这样做需要大量的人力和花费，但这种平均化可以减少处理因素对内参基因的影响，并且提高结果的严谨性。Basket 方法在处理因素明显改变所有基因表达或比较不同组织之间的差异是非常有用的。但对于多数既定基因的研究并非必需。作为内参基因的一种替代，可以使用人工合成的已知浓度的标准RNA 。合成的标准
C T 值为纵坐标，绘制标准曲线，对未知样品进行定量时，根据未
知样品的C T 值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。质粒
DNA 和体外转录的RNA 常作为绝对定量的标准品。相对定量指
的是在一定样本中靶基因相对于另一参照基因的量的变化。
1．4．2DNA 芯片结果的验证由于实时荧光定量PCR 的准确
性和敏感性，在基因表达中极微小的差异都可以被检测出来，因此可以迅速、轻松地对大量样本的基因芯片结果进行验证研究。通常情况下，如果待测基因或途径是已知的，那么全基因组的现象研究是不必要的，因此，数据的收集也可以开始于定量PCR 。另外，已经明确的靶基因可以通过定量PCR 进行大样本（1000例）筛查。针对样本的数量和检测基因的数量有不同的研究技术，当检测基因数量下降而样本数量上升时，技术类型就从“发现“（现象）到“证实”[14]。
600
RNA 与靶基因除了中间稍短一些外，其他均相同，可以在PCR
中使用与靶基因相同的引物，并且可以通过大小加以区别。或者，标准RNA 与靶基因在序列上只存在1个点突变，这样在大小、序列、二级结构上二者一致，但需要对PCR 产物进行内切酶处理，从而区分出标准RNA 和靶基因。合成标准RNA 虽然在扩增效率的标准化及绝对或相对定量中非常有意义，但由于RNA 很难合成且降解很快，使得该方法更加昂贵和难于操作[25－26]。
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2．3引物／探针资源
随着实时荧光定量PCR 及对应的引物／探针应用的增加，研
究者并不需要自行设计引物及探针，因为这样做会花费很多时间。目前有很多数据库包含了已验证的不同种属数以万计的基因相应的引物及探针，研究者可以使用这些序列或购买成品，这样做可以加快实验进程，并且减少为优化引物／探针而额外做的工作。这些数据库包括Primer Bank （http:∥pga．mgh．harvard．edu／
primerbank ）、QPDO （http:∥web．ncifcrf．gov／rtp ／geVprimerdb ）等。
3结语
PCR 已发明了25年，实时荧光定量PCR 的应用也已20年，
这些研究技术在生命科学研究中进一步的发展方向应该包括敏感性、信噪比，以及同时检测多个基因（高通量）等内容。这些技术的进步可以使得实时荧光定量PCR 在相当长的时间内仍然是基因表达分析的主要研究工具之一。
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