实验九 表达质粒的构建与诱导表达
第一节 原核表达概述
基因工程的研究一方面是获得基因的表达产物，另一方面是研究基因结构与功能的关系，最终都涉及目的基因的表达问题。表达载体（express vector）是指本身携带有宿主细胞基因表达所需的调控序列，能使克隆的基因在宿主细胞内进行转录与翻译的载体。也就是说，克隆载体只是携带外源基因，使其在宿主细胞内扩增；表达载体不仅使外源基因扩增，还使其表达。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用。外源基因在宿主（受体）细胞内是否表达以及表达水平受到许多因素（调控元件）的制约：
1．正确的阅读框架
为了获得正确编码的外源蛋白，外源基因编码区在插入表达质粒中原核基因编码区时，阅读框架应保持一致。阅读框架是由每三个核苷酸为一组连接起来的编码序列，外源基因只有在它与载体DNA的起始密码相吻合时，才算处于正确的阅读框架之中，从而表达融合蛋白，使外源蛋白与宿主蛋白相融合。
2．目的基因有效转录的启动子
启动子(promoter) 是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，
它是基因表达不可缺少的重要调控序列。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成的，分别称为 一35区和 一10区。一35区的序列为TTGACA，一10区序列为TATAAT。此两序列之间的最佳间距为17 bp。可与RNA聚合酶结合，并指导该酶在正确的转录部位开始合成mRNA。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体必须用原核启动子带动真核基因在原核生物中转录。原核表达载体启动子的转录常常是可以控制的，即一般情况下不转录，而受诱导剂诱导时就能转录，带动外源基因的高效表达。 目前常用的启动子：如大肠杆菌的lac启动子是乳糖操纵子的启动子，受lacⅠ编码的阻遏蛋白调节控制；trp等启动子是色氨酸操纵子启动子，受trp R编码的阻遏蛋白调节控制；tac启动子，由lac启动子的一l0区和trp启动子的一35区融合而成，汇合了lac和trp两者优点，是一个很强的启动子，受lacⅠ编码的阻遏蛋白调节；lacUV 5启动子是经紫外线诱变改造后的lac启动子，该启动子失去CAP和cAMP的正调控，只要有乳糖或IPTG存在时就能够启动转录；噬菌体的λPL、R启动子是λ噬菌体左、右向启动子，是一个温度敏感的阻遏蛋白受温度调控的很强的启动子；T7噬菌体启动子，比大肠杆菌启动子强得多，并且十分专一，只被T7 RNA聚合酶所识别；SV40启动子、多角蛋白启动子以及花椰菜花叶病毒（CaMV）启动子。
3．转录终止子
构建表达载体时，为了稳定载体系统，防止克隆的外源基因干扰表达载体的稳定性，一般要在多克隆位点的下游插入一段很强的核糖体RNA转录终止子(terminator)。否则合成的
mRNA过长，不仅消耗细胞内的底物和能量，而且容易使mRNA形成妨碍翻译的二级结构。原核基因的转录终止序列包括依赖Rho蛋白和不依赖Rho蛋白两种。不依赖Rho的终止信号序列都含发夹结构，末端为一连串T及YRTCTG。
4．mRNA有效翻译的SD序列
在原核生物中，mRNA分子上有两个核糖体结合位点(ribosome binding site，RBS)也调节着mRNA的翻译，一个是起始密码 (AUG或GUG)，另一个是位于起始密码上游3～11个核苷酸处的由3～9个核苷酸组成的一段保守序列AGGAGGU，这段序列富含嘌呤核苷酸，称为SD序列。而核糖体和mRNA的结合是由SD序列以及与起始密码子AUG之间的距离决定的。因此，SD序列和它的起始密码子AUG之间的距离是影响外源基因在原核生物中表达量高低的重要因素。SD序列与AUG间隔9个碱基最为合适，其间距离过长或过短都会影响目的基因的表达，有时由于这种距离的影响，蛋白质合成水平会相差2 000倍以上。且SD序列与AUG之间的碱基最好是A或U，一3位最好是A。
5．转录、翻译后的适当修饰和加工
真核生物基因表达的产物往往需要进行适当的修饰加工，但由于大肠杆菌本身的蛋白质翻译后修饰加工系统相当不完善，表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或糖基化修饰。并且不同宿主其修饰系统也不一样，所以选择宿主时应注意。
6．信号序列(signal sequence)
在原核细胞中，合成的蛋白能否分泌到细胞外与mRNA编码区上游的一段信号序列有关。这段编码序列翻译的15～30个氨基酸为蛋白质N端的信号肽，它能携带蛋白质跨膜并分泌到细胞外。脂双层和负电荷的质膜通过和信号肽的疏水相互作用以及电荷的吸引是信号肽能跨膜分泌的主要原因。当信号肽携带后面的蛋白质跨膜分泌后，信号肽即被质膜上的信号肽酶切除得到有功能的成熟蛋白质。
因此根据不同的需要，人们构建了不同的在原核细胞中高效表达的载体，这些载体通常具有以下几个特点：①有一个强的原核启动子及两侧的调控序列；②位于读码框上游的SD序列与起始密码子AUG之间有合适的距离；③在外源基因和启动子之间有正确的阅读框架；④外源基因下游应加入不依赖ρ因子的转录终止区。一般表达载体都具有多克隆位点，对表达载体和外源基因用相同的两种酶双酶切后，再用T4 DNA连接酶把外源片段连入表达载体中，通过酶切、PCR鉴定，如果插入的片段大小和方向与外源基因一致，则成功构建了重组子。
将克隆的基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
原核表达载体通常为质粒，典型的原核表达载体应具有以下几种元件：
（1）选择标记的编码序列；
（2）可控转录的启动子；
（3）转录调控序列 (转录终止子，核糖体结合位点)；
（4）一个多种单一限制性内切酶位点序列；
（5）宿主体内自主复制的序列
原核表达的一般程序：
1 获得目的基因
2 准备表达载体
3 将目的基因插入表达载体中（测序验证）——表达质粒的构建
4 表达质粒转化相应的宿主菌
5 外源基因的诱导表达（诱导靶蛋白的表达）
6 表达蛋白的分析
原核表达的基本操作步骤举例：
一、试剂准备
1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中, 0.22 μm 滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤
（一）获得目的基因
1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
（二）构建重组表达质粒
1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。
（三） 获得含重组表达质粒的表达菌种
1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
（四）诱导表达
1、 挑取含重组质粒的菌体单斑至2 ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。
2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300 ml培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0（最好0.6，大约需3 h）。
3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4 mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。
4、分别取菌体1ml, 离心12000g×30 S收获沉淀，用100μL 1%SDS重悬，混匀, 70℃10 min。
5、离心12000g×1min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。
三 、注意事项
1、选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达； 如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。
2、在构建表达质粒时，要注意使外源基因与载体DNA的起始密码相吻合时，使其处于正确的阅读框架之中。
3、融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。
四、评议
1．表达质粒的构建的实验操作基本上与扩增质粒的构建相同，只是构建表达质粒时为了高
效表达外源基因，一般目的基因应与载体的相关DNA片段相融合。融合蛋白在大肠杆菌中的表达的优点如下：融合蛋白N端由正常的大肠杆菌本身序列所控制。容易获得高效表达；融合蛋白往往不被大肠杆菌视为异己蛋白，更为稳定。
2．表达载体与目标基因在体外重组完成后，必须导人特定的受体细胞如：BL21(DE3)，使之无性繁殖，直接改变其遗传性状。
3．在外源基因克隆到表达载体时，应注意其序列的ORF的正确与否，它直接决定其编码
的氨基酸序列，并且直接影响蛋白质的功能。如果ORF内碱基对发生缺失突变或插入突变，即插入或缺失非3的倍数的碱基对，那么ORF就可能发生改变，而得到一个截然不同的蛋白质产物，这种变化就是移码突变。如果发生突变形成了终止密码子，就会产生提前终止的、不完整的蛋白质，即无意义突变。其可分三种情况：琥珀突变(amber)，原来的密码子突变为UAG；赭石突变(ochre)，原来的密码子突变为UAA；乳白石突变(opal)，原来的密码子突变为UGA。
4．为了使外源基因在原核细胞中高效表达应利用蛋白酶缺陷型的宿主，如用lon营养缺陷
型减少外源蛋白的降解。因为黄嘌呤核苷(1on)是大肠杆菌合成蛋白酶的主要底物。lon营养缺陷型宿主不能合成黄嘌呤核苷，从而不能合成蛋白酶。
第二节 外源基因的诱导表达
一、实验目的
了解诱导外源基因表达的基本原理，学习和掌握诱导外源基因表达的常用的方法，为SDS-PAGE分析做准备。
二、实验原理
外源基因在原核生物中高效表达除了有适合的载体外，还必须有适合的宿主菌以及一定的诱导因素。宿主菌的选择对外源基因的表达是至关重要的，因为外源基因(特别是真核基因)在细菌中的表达往往不够稳定，常常被细菌中的蛋白酶降解。因此有必要对细菌菌株进行改造，使其蛋白酶的合成受阻，从而使表达的蛋白得到保护。实验中常用的宿主菌是经过改造的JMl09、BL21等大肠杆菌菌株。
通常表达质粒不应使外源基因始终处于转录和翻译之中，因为某些有价值的外源蛋白可能对宿主细胞是有毒的，外源蛋白的过量表达必将影响细菌的生长。为此，宿主细胞的生长和外源基因的表达是分成两个阶段进行的，
第一阶段使含有外源基因的宿主细胞迅速生长．以获得足够量的细胞；第二阶段是启动调节开关，使所有细胞的外源基因同时高效表达，产生大量有价值的基因表达产物。
在原核基因表达调控中，阻遏蛋白与操纵基因系统起着重要的开关调节作用，当阻遏蛋白与操纵基因结合时，阻止基因的转录。加入诱导物后；使其与阻遏蛋白结合，解除阻遏，从而启动基因转录。
根据表达载体的不同，外源基因表达常采用化学诱导与温度诱导两种方法。pET及pBV系列表达载体是近年来被广泛应用的两种诱导方式的代表性原核表达系统。
1．化学诱导
对于pET系列表达载体，当目的基因被克隆在T7转录和翻译信号控制的正确相位后，加入IPTG进行诱导，使宿主菌表达T7 RNA聚合酶，进而诱导目的基因以融合蛋白的形式进行表达，该系统以其独特的优势，在基因表达中应用较为广泛。
载体pET由于
带有来自大肠杆菌
的乳糖操纵子，它
由启动基因、分解
产物基因活化蛋白
(CAP)结合位点、操
纵基因及部分半乳
糖酶结构基因组
成，受分解代谢系
统的正调控和阻遏
物的负调控。正调
控
gene 是通过CAP(catabolite activation
protein)因子和
cAMP来激活启动
子，促使转录；负
调控则是由调节基
因(lacⅠ)产生Iac
阻遏蛋白与操纵子
结合，阻遏外源基
因的转录和表达，
此时细胞大量生长
繁殖。乳糖的存在
可解除这种阻遏，
另外IPTG是β一
半乳糖苷酶底物类
似物，具有很强的
诱导能力，能与阻
遏蛋白结合，使操纵子游离，诱导lac Z启动子转录，于是外源基因被诱导而高效转录和表达。所以可以通过在培养基中添加IPTG诱导基因的表达。
2．温度诱导
pBV系列表达载体，重组插入PL、R启动子下游的目的基因直接表达受温度变化调控，以非融合蛋白的形式进行表达，该系统尤其适合表达对细胞有毒害的蛋白。
当用PL、R启动子构建表达质粒时，PL、R启动子受λ噬菌体cI基因的负调控，cI基因产生的阻遏蛋白结合在操纵基因上，阻止转录的进行。目前利用cI的温度敏感突变基因
(cIts 857)调节这种阻遏。当在28～30℃培养时，该突变体产生有活性的阻遏蛋白，阻遏
PL、R转录，细菌大量生长。在获得足够量菌体后，使温度上升至42℃．造成阻遏蛋白失活， PL、R解除阻遏，启动外源基因的高效转录和表达，从而合成大量有价值的外源蛋白。
三、注意事项
1．在进行诱导实验中要注意应以含有空载体的宿主菌株以及IPTG诱导前的含有重组子的宿主菌株做对照。 t
2．IPTG诱导的最终浓度为0.3～1 mmol／L。 ；
3．诱导后的培养时间一般不超过3 h。 i
4．有些工程菌，在IPTG诱导后，其发酵温度降低为30℃，则可产生诱导蛋白。 !
四、评议 !
1．在配制SDS上样缓冲液中，可用8％的β一巯基乙醇替代其中的400 mmol／L DTT。 ；
2．异源基因融合表达后面临着蛋白质降解问题。在大肠杆菌细胞中有两个结构影响蛋白质的稳定性：①大肠杆菌细胞中，凡蛋白质N端为精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸 (Trp)等残基的稳定性差，半衰期约2min，而N端如果不是这些氨基酸残基，半衰期可长达10 h。②蛋白质N端内部附近如含有赖氨酸残基，其是泛素蛋白的受体，易被依赖于泛素蛋白的蛋白酶降解。 ‘
3．分析被检测基因在细胞中转录和翻译的情况有以下方法：①Northern杂交，检查细胞中是否含有特定的mRNA；②SDS-PAGE分析诱导前后细胞中目的蛋白质的表达水平；③在Western杂交中用特异性抗体分析目的蛋白质的存在及含量；④利用ELISA等免疫学方法，检测基因表达的强度；⑤直接测定目的蛋白的生物活性，根据活性的大小估计蛋白质的表达量⑥也可将报告基因 ( 如lac Z) 克隆在目的基因的下游，根据报告基因的转录或翻译情况，估计目的蛋白的表达量。
4．从目的基因的碱基数目推算其表达的蛋白质的相对分子质量。 ；
计算方法一：Mr一115×n÷3 (其中n是基因的碱基数)。如表达的基因为1.7 kb，其表达蛋白质的相对分子质量大约为：Mr：115×n÷3 = 115×1700÷3 = 64 833≈65×10。
计算方法二：1.0 kb DNA相当于333氨基酸，即相对分子质量大约为37×103的蛋白质。如表达的基因为1.7 kb，其表达蛋白质的相对分子质量大约为：Mr = 1.7×37—63×103。
5．诱导表达蛋白时应注意凋整诱导培养的温度，不同的蛋白可能有不同的要求。
第三节 表达蛋白的SDS--PAGE分析
一、实验目的
利用SDS—PAGE检测表达蛋白，确定蛋白质的相对分子质量，并掌握其原理与方法。
二、实验原理
电泳是带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象，影响泳动速度的因素主要有颗粒的性质、电场强度和溶液的性质等。①颗粒直径、形状以及所带的静电荷量对泳动速度都有较大影响。一般来说，颗粒带净电荷量越大，或其直径越小，或其形状越接近球形，在电场中的泳动速度就越快。反之则越慢。②电场强度对电泳速度起着十分重要的作用。电场强度越高，带电颗粒的泳动速度就越快，反之则越慢。③溶液性质主要是指电极溶液和蛋白质样品溶液的pH、离子强度和黏度等。溶液的pH决定带电颗粒的解离程度，也即决定其净电荷的量。对蛋白质而言，溶液的pH离其等电点愈远，则其带净电荷量就愈大，从而泳动速度就愈快。反之则愈慢。一般溶液的离子强度在0.02～0.2之间时。电泳较合适。若离子强度过高，则会降低颗粒的泳动度。其原因是，带电颗粒能把溶液中与其电荷相反的离子吸引在自己周围形成离子扩散层，这种静电引力作用的结果，导致颗粒泳动度降低，若离子强度过低，则缓冲能力差，往往会因溶液pH变化而影响泳动度的速率。溶液黏度与泳动度成反比例关系。溶液的性质还通过影响带电颗粒的空间构象而影响其电泳行为。
聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是由单体丙烯酰胺 (acrylamide) 和交联共聚单位(双体)
N’N-甲叉双丙烯酰胺 (N，N-methylene-bis-acrylaimide) 为材料，在引发剂过硫酸铵(APS)和增速剂N，N，N’，N’一四甲基乙二胺TEMED (N，N，N’，N-tetramethylene diamine)的作用下聚合交联形成含酰胺基侧链的脂肪族长链，在相邻长链之间通过甲叉桥连接而形成的三维网状结构物质。聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小与链长度和交联度有关，无论丙烯酰胺的量的多少，当N，N-甲又双丙烯酰胺的量为总丙烯酰胺的5％时，其平均孔径最小，因此一般将N，N’-甲又双丙烯酰胺的含量固定于总量的5％，然后通过改变丙烯酰胺的总量来调节孔径的大小，即有效孔径随着丙烯酰胺的总量的增加而减少。
聚丙烯酰胺凝胶的强度好，有弹性、透明化学性质稳定，在不同pH和温度下变化较小，在很多溶剂中不溶，为非离子型。没有吸附和电渗作用，是一种极好的电泳介质。聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分辨率高、上样量大、回收的样品较纯等特点，但它操作麻烦，且不能分离较大的分子。通常用它分析蛋白质以及分析和制备小于1 kb的DNA或RNA片段。主要用于分离蛋白质和测定蛋白质亚基相对分子质量。但应注意丙烯酰胺是一种潜在的神经毒素，其作用效应能积累，操作时应戴手套。
SDS—PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳)，主要用于分离蛋白质和测定蛋白质亚基相对分子质量。SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，它能断裂分子内和分子间的氢键和疏水键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构；强还原剂，如巯基乙醇和二硫苏糖醇则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚成单个亚基。解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成带有负电荷的蛋白质-SDS胶束。所带的负电荷大大超过了蛋白分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。使蛋白质分子的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质或亚基相对分子质量的大小。
SDS电泳成功的关键之一是电泳过程中，特别是样品制备过程中蛋白质和SDS的结合程度。影响它们结合的因素主要有三个：①溶液中SDS单体的浓度。SDS在水溶液中是以单体和SDS一多肽胶束(SDS—polypeptide micelles)混合形式存在的，能与蛋白质分子结合的是单体。单体的浓度与SDS总浓度、温度、和离子强度有关。由于SDS与蛋白质结合是按重量成比例的，即在一定温度和离子强度下，当SDS总浓度增加到某一定值时，溶液中的SDS浓度不再随SDS总浓度的增加而升高。当SDS单体浓度大于1 mmol／L时，大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1：1.4，如果SDS单体浓度降到0.5 mmol／L以下时，二者的结合比仅为1：0.4。这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，也就不能进行相对分子质量测定。为了保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应为1：4或1：3。高温有利于SDS与蛋白质的结合，样品处理时常在沸水浴中保温。②样品缓冲液的离子强度。因为SDS结合到蛋白质分子上的量仅决定于平衡时SDS的单体浓度。不是总浓度，而只在低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较高的平衡浓度。所以SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，常为10～100 mmol／L。③二硫键是否完全被还原。只有二硫键被彻底还原后，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和相对分子质量对数的线性关系。因此电泳时蛋白质分子的迁移速度仅取决于分子的大小，可根据大小蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶中电泳速度不同即可分离蛋白质，并测出它们的相对分子质量。当蛋白质相对分子质量在(12～165)×103之间，蛋白质分子的迁移率与相对分子质量的对数呈直线关系，符合logMr= K－bx。(Mr为相对分子质量，x为迁移率，K、b均为常数)。
SDS—PAGE还有以下特征：
1)浓缩效应：
在不连续缓冲系统中，样品在进入分离胶以前，先经过大孔径浓缩胶的迁移作用而被浓缩至一极窄的区带。其作用原理是在缓冲系统中的弱酸，如甘氨酸，在接近其pKa的pH时，任何时候都只有一部分分子带负电。如样品和浓缩胶均用pH 6.7的Tris～HCl缓冲液，电极液用Tris-甘氨酸缓冲液。此时，甘氨酸很少解离，其有效泳动率很低，而氯离子却有很高的泳动率，蛋白质分子的泳动率介于氯离子和甘氨酸之间。一旦加上电压，作为先导离子的氯离子和作为尾随离子的甘氨酸离子分离开来，并在其后面留下一个导电性较低的区带。由于导电性和电场强度成反比，这一区带便获得较高的电压梯度，并加速甘氨酸的泳动，使其赶上氯离子，建立起甘氨酸和氯离子的电压梯度和泳动率乘积的相等的稳定态，使这些带电颗粒以相同速度泳动，两种离子之间具有明显的边界。当甘氨酸、氯离子界面通过样品进人浓缩胶时，在移动界面前有一低电压梯度，在界面后有一高电压梯度。由于在移动界面前的蛋白质泳动速度比氯离子低，因此氯离子能迅速通过。移动界面后的蛋白质处于较高的电压梯度中，其泳动速度比甘氨酸快。因此，移动的界面将蛋白质分子堆积到一起，浓缩为一狭窄的区带。蛋白质在
移动界面中的浓缩作用进取决于样品和浓缩胶中的Tris—Hcl浓度，而与样品中的蛋白质的最初浓度无关。由于浓缩胶为大孔凝胶，故对样品没有分子筛作用。
2)分子筛效应：
当夹在快离子和慢离子中间的蛋白质由浓缩胶进入分离胶时，pH和凝胶孔径突然改变。分离胶选用pH 8.9的Tris-HCl缓冲液，与甘氨酸的pKa接近，导致甘氨酸的大量解离。此时甘氨酸的有效泳动率增加，使它越过蛋白质并直接在氯离子后移动。随之高电场强度消失。同时由于凝胶孔径变小，使蛋白质分子的迁移率减小。于是，蛋白质样品就在均一的电场强度和pH条件下通过一定孔径的分离胶。当蛋白质的相对分子质量或构型不同时，通过分离胶所受到的摩擦力和阻滞程度就不同，最终表现出的泳动率也不相同，也就是分子筛效应。即使蛋白质的净电荷相似，也会因分子筛效应在分离胶中被分开。
3)电荷效应：
由于每种蛋白质分子所带的有效电荷不同，故泳动率不同，所以样品经过分离胶电泳后，就以带状按电荷顺序排列起来。
缓冲系统的选择：由于SDS对蛋白质的溶解性能以及负电荷的包裹作用，所以在选择SDS电流缓冲系统时要比常规聚丙烯酰胺凝胶电泳简单得多。一般来说，在被分析的蛋白
质稳定的pH范
围，凡不与SDS
发生相互作用的
缓冲液都可以使
用，但缓冲液的
选择对蛋白质的
分离和电泳的速度是非常关键的。
含有SDS的不连续缓冲系统现在被广泛地用于蛋白质亚基相对分子质量以及纯度的测定。其中目前使用最多的缓冲系统是Tris一甘氨酸系统。在SDS不连续电泳中，样品缓冲液和凝胶缓冲液常采用同一种系统，只是pH和离子强度不同。
凝胶浓度的选择：由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度，只取决于分子解聚后SDS一蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓度的正确选择尤为重要。如果凝胶浓度太大，孔径太小，电泳时样品分子不能进入凝胶。如果凝胶浓度太小，孔径太大，则样品中各种蛋白质分子均随着缓冲液流向前推而不能得以很好地分离。不同相对分子质量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。
三、注意事项
1．β-巯基乙醇吞服可致命，吸入或通过皮肤吸收可致伤。高浓度时对黏膜、上呼吸道、皮肤和眼睛有破坏作用。操作时应注意防护措施。
2．两种丙烯酰胺单体及溶液是中枢神经毒物并容易吸附于皮肤，作用有累积性，操作时要
小心并戴手套。如果皮肤接触了丙烯酰胺的粉末或溶液，立即用肥皂水冲洗。未聚合的丙烯酰胺应用过量催化剂以固体废物形式处理。
3．制备浓缩胶中，添加10％APS和TEMED前，应均匀地混合，一旦加入APS和TEMED
后应快速地旋转混合加入制胶层，因为浓缩胶很快就会聚合凝固。
4．将凝胶灌入制备好的平板内，留出灌注浓缩胶所需空间 (梳齿的齿长再加1 cm)。且制备
浓缩胶前，应先准备好梳子。
5．上槽中应加入新鲜的电极缓冲液，而下槽中则可用旧的电极缓冲液。
6．如果没有数目足够的样品，应在加样孔中加上样缓冲液，不要留有空孔，以防止电泳时邻近带的扩散。在加入不同的样品之前，一定要用电泳缓冲液或蒸馏水冲洗注射器。
7．在凝胶与玻璃板之间插入一根长注射针头将水缓缓注入，在注入水的过程中，针头逐渐
向前伸入，使凝胶与玻璃板分离，注意不要损伤胶面。
8．10％ APS尽量使用时现配现用，4℃保存两周内用完，最多不能超过一个月。-20℃可
保存两个月，但一旦解冻后尽快用完。
四、评议
1．根据SDS电泳的原理，样品缓冲液中必须含有3～4倍于蛋白的SDS和足以断裂二硫键
的还原试剂 (2％二硫苏糖醇或5％β-巯基乙醇)。
2．电泳中出现不规则的蛋白质迁移带是因为电泳不稳定，其他原因还包括样品加量太多、
样品中的盐浓度太高、边缘效应。如果在凝胶边缘电泳条带出现“微笑”状的样品(运动速度减慢)，可能是因为凝胶的中间比两侧更热，应降低电压。
3．电泳结束后，在进行染色前可用固定液处理对凝胶进行20 min处理，其SDS—PAGE的
分析效果会更好。固定液：454 mI的50％甲醇水溶液，46 mI的冰醋酸。
4．除了用考马斯亮蓝染色(其灵敏度较差，最低含量为100 n g蛋白质，但操作容易)，还可
用银染色，其灵敏度高，可比考马斯亮蓝染色法提高100倍，可检测2 ng的蛋白质。银染的机制是将蛋白带上的AgNO3 (Ag)还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。用银染蛋白的吸光度对浓度作图呈现不同的斜率，表明染色的程度是与蛋白中的一些特殊基团有关。在银染过程中，蛋白质首先需要被固定。固定有两个作用，第一是把蛋白固定在凝胶中或至少是阻滞它们在凝胶中的扩散，第二是为了去除干扰染色过程的物质，如去污剂，还原试剂和缓冲液的成分(如甘氨酸)。常用的固定剂有戊二醛，乙醇，甲醛、醋酸以及三氯醋酸，然后将凝胶放在银染溶液中染色。
银染色法：
1)将从制胶板上剥下的凝胶放入50 mL甲醛中固定液，旋转摇床中缓慢摇动10 min以上。2)倒去固定液，用水洗两次，每次5 min，缓慢摇动5min。
3)倒去水，凝胶浸泡在0.2 g／L Na2S203溶液中1 min缓慢移动。
4)倒去Na2S203溶液，用水洗胶2次，每次20 s。
5)倒去水，将凝胶浸泡在50 mL 0.1 %的AgNO3中10 min，缓慢移动。
6)倒去AgNO3，用水洗胶，然后用小量体积的硫代硫酸盐显影液洗。
7)将凝胶浸泡在50 mL新配制的硫代硫酸盐显影液中，缓慢摇动，直至获得足够的条带现
色强度(约1min)。
试剂：
1％硝酸银、0.2g／L的 Na2S203。
甲醛固定液：40％甲醇、0.5 mL 37％ 甲醛。
硫代硫酸盐显影液：3% Na2CO3、0．000 4 % Na2S203、0.5 mL 37％的福尔马林(临用前加入)，不加福
尔马林的溶液可于室温中长期保存。 ＋
第四节 原核表达蛋白的分离与纯化
大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在，需要不同的纯化策略。现在，许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能，这些自然需要将蛋白质分离出来后，进行进一步的研究来获得。分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。必须承认，蛋白质纯化比起DNA克隆和操作来是更具有艺术性的，尽管DNA序列具有异乎寻常的多样性（因而它是唯一适合遗传物质的），但它却有标准的物理化学性质，而每一种蛋白质则有它自己的由氨基酸序列决定的物理化学性质（因而它具有执行众多生物学功能的用途）。正是蛋白质间的这些物理性质上的差异使它们得以能进行纯化但这也意味着需要对每一种待纯化的蛋白质研发一套新的方法。所幸的是，尽管存在这种固有的困难，但现已有多种方法可以利用，蛋白质纯化策略也已实际可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的获得已是相当普遍的事。可诱导表达系统特别是Studier等发展的以噬菌体T7 RNA聚合酶为基础的表达系统的出现使人们能近乎常规地获得超表达（overexpression），表达水平可达细胞蛋白2 %以上，有些甚至高达50 %。
一、可溶性产物的纯化（融合T7·Tag的表达蛋白）操作举例
（一）试剂准备
采用T7· Tag Affinity Purification Kit
1．T7·Tag抗体琼脂。
2．B/W缓冲液：4.29mM Na2HPO4，1.47 mM KH2PO4，2.7 mM KCl，3. 0.137mM NaCl，1%吐温-20，pH7.3。
4. 洗脱缓冲液: 0.1M柠檬酸，pH2.2。
5. 中和缓冲液：2M Tris，pH10.4。
1. PEG 20000。
（二）操作步骤
1. 100ml 含重组表达质粒的菌体诱导后，离心5000g×5min，弃上清，收获菌体，用10ml预冷的B/W缓冲液重悬。
2. 重悬液于冰上超声处理，直至样品不再粘稠，4℃离心 14000g×30min，取上清液，0.45μm膜抽滤后作为样品液。
3. 将结合T7·Tag抗体的琼脂充分悬起，平衡至室温，装入层析柱中。
4. B/W缓冲液平衡后样品液过柱。
5. 10ml B/W缓冲液过柱，洗去未结合蛋白。
6. 用5ml洗脱缓冲液过柱，每次1ml，洗脱液用含150μl中和缓冲液的离心管收集，混匀后置于冰上，直接SDS-PAGE分析。
7. 将洗脱下来的蛋白放入透析袋中，双蒸水透析24hr，中间换液数次。
8. 用PEG 20000浓缩蛋白。
（三）注意事项
蛋白在过层析柱前，要0.45μm膜抽滤，否则几次纯化后，柱子中会有不溶物。
二、包涵体的纯化
包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。包涵体的主要成分就是表达产物，其可占据集体蛋白的40%～95%，此外，还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质，所以分离包涵体后，还要采用适当的方法（如色谱法）进行重组蛋白质的纯化。
（一）试剂配制
1．缓冲液A：50mM Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100mM NaCl。
2．缓冲液B：50mM Tris-HCl（pH8.0）,1mM EDTA,100 mM NaCl,1%NP-40。
3．缓冲液Ⅰ：50mM Tris-HCl （pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100(V/V),4M脲素。
4．缓冲液Ⅱ：50M Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,3% Triton X-100 。
1．缓冲液Ⅲ：50mM Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100,2M 盐酸胍。
5．缓冲液C：8M脲素，10mMβ-巯基乙醇，100 mM Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA及脱氧胆酸钠。
（二）操作步骤
1．用缓冲液A漂洗菌体细胞（10ml/g）, 离心6000g×15min，收集菌体细胞，重复此步骤，将菌体细胞再在缓冲液A中洗涤一次。
2．将漂洗过的菌体细胞悬浮于缓冲液B中，超声破碎，镜检，破碎率高于95%，离心1500g×30min，收集包涵体沉淀。
3．将包涵体沉淀用缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ、缓冲液Ⅲ分别超声洗涤一次，1500g 离心收集包涵体沉淀。
4．包涵体的溶解：用含高浓度脲素的缓冲液室温放置30min，然后离心1500g×30min，留上清。将溶解后的蛋白质适当稀释，磁力搅拌，透析过夜。
5．溶解后的包涵体蛋白可通过亲和层析进一步纯化。
第五节 水稻瘤矮病毒（RGDV）S10组分的原核表达
一、原理
细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。
二、材料和试剂
1、重组质粒：将RGDV的S10组分，共1198 bp构建到原核表达载体pET-28b（＋）上，得到原核表达质粒pET- S10。
2、将pET- S10转化到BL21(DE3)宿主菌中，进行诱导表达。
3、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O， 37OC溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。
4、1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100 ml。
5、1 M Tris-HCl (pH 6.8)：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100 ml。
6、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶, 浓盐酸调至pH 7.2,定容至100 ml。
7、10⨯电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。 8、10%过硫酸铵（APS）：1g APS加ddH2O至10ml。
9、2⨯SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5 ml，β-巯基乙醇1.0 ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚兰 1.0 ml，ddH2O 3.5 ml。
10、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰（R-250或G-250）0.25 g，甲醇225 ml，冰醋酸 46 ml，ddH2O 225 ml。
11、脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成（也可以用0.5 mol/L的NaCL作为脱色液，在50～60℃脱色0.5～1小时）。
12、观察结果，照相保存。此时的PAGE胶在短时间内可以放在蒸馏水中保存。
三、操作步骤
A 诱导表达
1、 挑取含重组质粒的BL21(DE3)宿主菌单斑至2 ml LB（含Kan 50μg/ml，Cam 34μg/ml）中37℃过夜培养。
2、 按1∶100比例稀释过夜菌，一般是将100μL菌加入到含10 mL LB培养基的培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600
≌0.6~0.8（最好为0.6）（3～4小时）。
3、取部分液体作为未诱导的对照组, 余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mM作为实验组,两组继续37℃诱导培
养3～7小时r。
B SDS-PAGE电泳分析（采用垂直式电泳槽装置）
（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制
1、 分离胶 (12 %)的配制: 10 ml
ddH2O 3.3 ml
30%储备胶 4.0ml
1.5M Tris-HCl（pH 8.8） 2.5ml
10% SDS 0.1ml
10% APS 0.1ml
TEMED 0.004 ml
TEMED: N,N,N’,N’-四甲基乙二胺。
各成分混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面持平。凝胶完全聚合需30～60 min。
2、 层积胶（5%）的配制：5 ml
ddH2O 3.4 ml
30%储备胶 0.83 ml
1M Tris-HCl（pH 6.8） 0.63 ml
10%SDS 0.05ml
10%AP 0.05 ml
TEMED 0.005 ml
分离胶凝固后，将其上的水吸去, 加入积层胶混合液, 立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合 需15-～0min。
（二）样品处理
取经诱导的菌液1.5 ml, 12000g离心1 min收获沉淀，将样品加入一半体积的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3～5min，12000g离心 1min，取上清作SDS-PAGE分析。
（三）上样
取15～20μl诱导与未诱导的处理后的样品用微量注射器加入样品池中,并加入20μl低分子量蛋白标准品作对照。
（三） 电泳
在电泳槽中加入1 电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，积层胶电压80V, 分离胶电压120V, 电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止（约需4hr）。
（四）染色:将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室温4～6 hr。
（五）脱色:将胶从染色液中取出,放入脱色液中,多次脱色至蛋白带清晰，观察有无49 Kda的特异蛋白条带出现。
（六） 凝胶摄像和保存
在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，结果存于软盘中，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。
四、注意事项
1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。
2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10% AP在一周内使用。室温较低时，TEMED的量可加倍。
3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。
五、思考题
1．在基因工程中克隆载体与表达载体各起什么作用?各需要具备哪些基本遗传元件?
2．简述诱导外源基因表达的基本原理。
3．如何确保外源基因在宿主中正常表达?怎样得到好的表达效果？
4．蛋白质电泳制胶要注意哪些方面?
5．比较核酸电泳与蛋白质电泳的异同之处。
实验九 表达质粒的构建与诱导表达
第一节 原核表达概述
基因工程的研究一方面是获得基因的表达产物，另一方面是研究基因结构与功能的关系，最终都涉及目的基因的表达问题。表达载体（express vector）是指本身携带有宿主细胞基因表达所需的调控序列，能使克隆的基因在宿主细胞内进行转录与翻译的载体。也就是说，克隆载体只是携带外源基因，使其在宿主细胞内扩增；表达载体不仅使外源基因扩增，还使其表达。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用。外源基因在宿主（受体）细胞内是否表达以及表达水平受到许多因素（调控元件）的制约：
1．正确的阅读框架
为了获得正确编码的外源蛋白，外源基因编码区在插入表达质粒中原核基因编码区时，阅读框架应保持一致。阅读框架是由每三个核苷酸为一组连接起来的编码序列，外源基因只有在它与载体DNA的起始密码相吻合时，才算处于正确的阅读框架之中，从而表达融合蛋白，使外源蛋白与宿主蛋白相融合。
2．目的基因有效转录的启动子
启动子(promoter) 是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，
它是基因表达不可缺少的重要调控序列。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成的，分别称为 一35区和 一10区。一35区的序列为TTGACA，一10区序列为TATAAT。此两序列之间的最佳间距为17 bp。可与RNA聚合酶结合，并指导该酶在正确的转录部位开始合成mRNA。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体必须用原核启动子带动真核基因在原核生物中转录。原核表达载体启动子的转录常常是可以控制的，即一般情况下不转录，而受诱导剂诱导时就能转录，带动外源基因的高效表达。 目前常用的启动子：如大肠杆菌的lac启动子是乳糖操纵子的启动子，受lacⅠ编码的阻遏蛋白调节控制；trp等启动子是色氨酸操纵子启动子，受trp R编码的阻遏蛋白调节控制；tac启动子，由lac启动子的一l0区和trp启动子的一35区融合而成，汇合了lac和trp两者优点，是一个很强的启动子，受lacⅠ编码的阻遏蛋白调节；lacUV 5启动子是经紫外线诱变改造后的lac启动子，该启动子失去CAP和cAMP的正调控，只要有乳糖或IPTG存在时就能够启动转录；噬菌体的λPL、R启动子是λ噬菌体左、右向启动子，是一个温度敏感的阻遏蛋白受温度调控的很强的启动子；T7噬菌体启动子，比大肠杆菌启动子强得多，并且十分专一，只被T7 RNA聚合酶所识别；SV40启动子、多角蛋白启动子以及花椰菜花叶病毒（CaMV）启动子。
3．转录终止子
构建表达载体时，为了稳定载体系统，防止克隆的外源基因干扰表达载体的稳定性，一般要在多克隆位点的下游插入一段很强的核糖体RNA转录终止子(terminator)。否则合成的
mRNA过长，不仅消耗细胞内的底物和能量，而且容易使mRNA形成妨碍翻译的二级结构。原核基因的转录终止序列包括依赖Rho蛋白和不依赖Rho蛋白两种。不依赖Rho的终止信号序列都含发夹结构，末端为一连串T及YRTCTG。
4．mRNA有效翻译的SD序列
在原核生物中，mRNA分子上有两个核糖体结合位点(ribosome binding site，RBS)也调节着mRNA的翻译，一个是起始密码 (AUG或GUG)，另一个是位于起始密码上游3～11个核苷酸处的由3～9个核苷酸组成的一段保守序列AGGAGGU，这段序列富含嘌呤核苷酸，称为SD序列。而核糖体和mRNA的结合是由SD序列以及与起始密码子AUG之间的距离决定的。因此，SD序列和它的起始密码子AUG之间的距离是影响外源基因在原核生物中表达量高低的重要因素。SD序列与AUG间隔9个碱基最为合适，其间距离过长或过短都会影响目的基因的表达，有时由于这种距离的影响，蛋白质合成水平会相差2 000倍以上。且SD序列与AUG之间的碱基最好是A或U，一3位最好是A。
5．转录、翻译后的适当修饰和加工
真核生物基因表达的产物往往需要进行适当的修饰加工，但由于大肠杆菌本身的蛋白质翻译后修饰加工系统相当不完善，表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或糖基化修饰。并且不同宿主其修饰系统也不一样，所以选择宿主时应注意。
6．信号序列(signal sequence)
在原核细胞中，合成的蛋白能否分泌到细胞外与mRNA编码区上游的一段信号序列有关。这段编码序列翻译的15～30个氨基酸为蛋白质N端的信号肽，它能携带蛋白质跨膜并分泌到细胞外。脂双层和负电荷的质膜通过和信号肽的疏水相互作用以及电荷的吸引是信号肽能跨膜分泌的主要原因。当信号肽携带后面的蛋白质跨膜分泌后，信号肽即被质膜上的信号肽酶切除得到有功能的成熟蛋白质。
因此根据不同的需要，人们构建了不同的在原核细胞中高效表达的载体，这些载体通常具有以下几个特点：①有一个强的原核启动子及两侧的调控序列；②位于读码框上游的SD序列与起始密码子AUG之间有合适的距离；③在外源基因和启动子之间有正确的阅读框架；④外源基因下游应加入不依赖ρ因子的转录终止区。一般表达载体都具有多克隆位点，对表达载体和外源基因用相同的两种酶双酶切后，再用T4 DNA连接酶把外源片段连入表达载体中，通过酶切、PCR鉴定，如果插入的片段大小和方向与外源基因一致，则成功构建了重组子。
将克隆的基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
原核表达载体通常为质粒，典型的原核表达载体应具有以下几种元件：
（1）选择标记的编码序列；
（2）可控转录的启动子；
（3）转录调控序列 (转录终止子，核糖体结合位点)；
（4）一个多种单一限制性内切酶位点序列；
（5）宿主体内自主复制的序列
原核表达的一般程序：
1 获得目的基因
2 准备表达载体
3 将目的基因插入表达载体中（测序验证）——表达质粒的构建
4 表达质粒转化相应的宿主菌
5 外源基因的诱导表达（诱导靶蛋白的表达）
6 表达蛋白的分析
原核表达的基本操作步骤举例：
一、试剂准备
1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中, 0.22 μm 滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤
（一）获得目的基因
1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
（二）构建重组表达质粒
1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。
（三） 获得含重组表达质粒的表达菌种
1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
（四）诱导表达
1、 挑取含重组质粒的菌体单斑至2 ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。
2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300 ml培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0（最好0.6，大约需3 h）。
3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4 mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。
4、分别取菌体1ml, 离心12000g×30 S收获沉淀，用100μL 1%SDS重悬，混匀, 70℃10 min。
5、离心12000g×1min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。
三 、注意事项
1、选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达； 如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。
2、在构建表达质粒时，要注意使外源基因与载体DNA的起始密码相吻合时，使其处于正确的阅读框架之中。
3、融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。
四、评议
1．表达质粒的构建的实验操作基本上与扩增质粒的构建相同，只是构建表达质粒时为了高
效表达外源基因，一般目的基因应与载体的相关DNA片段相融合。融合蛋白在大肠杆菌中的表达的优点如下：融合蛋白N端由正常的大肠杆菌本身序列所控制。容易获得高效表达；融合蛋白往往不被大肠杆菌视为异己蛋白，更为稳定。
2．表达载体与目标基因在体外重组完成后，必须导人特定的受体细胞如：BL21(DE3)，使之无性繁殖，直接改变其遗传性状。
3．在外源基因克隆到表达载体时，应注意其序列的ORF的正确与否，它直接决定其编码
的氨基酸序列，并且直接影响蛋白质的功能。如果ORF内碱基对发生缺失突变或插入突变，即插入或缺失非3的倍数的碱基对，那么ORF就可能发生改变，而得到一个截然不同的蛋白质产物，这种变化就是移码突变。如果发生突变形成了终止密码子，就会产生提前终止的、不完整的蛋白质，即无意义突变。其可分三种情况：琥珀突变(amber)，原来的密码子突变为UAG；赭石突变(ochre)，原来的密码子突变为UAA；乳白石突变(opal)，原来的密码子突变为UGA。
4．为了使外源基因在原核细胞中高效表达应利用蛋白酶缺陷型的宿主，如用lon营养缺陷
型减少外源蛋白的降解。因为黄嘌呤核苷(1on)是大肠杆菌合成蛋白酶的主要底物。lon营养缺陷型宿主不能合成黄嘌呤核苷，从而不能合成蛋白酶。
第二节 外源基因的诱导表达
一、实验目的
了解诱导外源基因表达的基本原理，学习和掌握诱导外源基因表达的常用的方法，为SDS-PAGE分析做准备。
二、实验原理
外源基因在原核生物中高效表达除了有适合的载体外，还必须有适合的宿主菌以及一定的诱导因素。宿主菌的选择对外源基因的表达是至关重要的，因为外源基因(特别是真核基因)在细菌中的表达往往不够稳定，常常被细菌中的蛋白酶降解。因此有必要对细菌菌株进行改造，使其蛋白酶的合成受阻，从而使表达的蛋白得到保护。实验中常用的宿主菌是经过改造的JMl09、BL21等大肠杆菌菌株。
通常表达质粒不应使外源基因始终处于转录和翻译之中，因为某些有价值的外源蛋白可能对宿主细胞是有毒的，外源蛋白的过量表达必将影响细菌的生长。为此，宿主细胞的生长和外源基因的表达是分成两个阶段进行的，
第一阶段使含有外源基因的宿主细胞迅速生长．以获得足够量的细胞；第二阶段是启动调节开关，使所有细胞的外源基因同时高效表达，产生大量有价值的基因表达产物。
在原核基因表达调控中，阻遏蛋白与操纵基因系统起着重要的开关调节作用，当阻遏蛋白与操纵基因结合时，阻止基因的转录。加入诱导物后；使其与阻遏蛋白结合，解除阻遏，从而启动基因转录。
根据表达载体的不同，外源基因表达常采用化学诱导与温度诱导两种方法。pET及pBV系列表达载体是近年来被广泛应用的两种诱导方式的代表性原核表达系统。
1．化学诱导
对于pET系列表达载体，当目的基因被克隆在T7转录和翻译信号控制的正确相位后，加入IPTG进行诱导，使宿主菌表达T7 RNA聚合酶，进而诱导目的基因以融合蛋白的形式进行表达，该系统以其独特的优势，在基因表达中应用较为广泛。
载体pET由于
带有来自大肠杆菌
的乳糖操纵子，它
由启动基因、分解
产物基因活化蛋白
(CAP)结合位点、操
纵基因及部分半乳
糖酶结构基因组
成，受分解代谢系
统的正调控和阻遏
物的负调控。正调
控
gene 是通过CAP(catabolite activation
protein)因子和
cAMP来激活启动
子，促使转录；负
调控则是由调节基
因(lacⅠ)产生Iac
阻遏蛋白与操纵子
结合，阻遏外源基
因的转录和表达，
此时细胞大量生长
繁殖。乳糖的存在
可解除这种阻遏，
另外IPTG是β一
半乳糖苷酶底物类
似物，具有很强的
诱导能力，能与阻
遏蛋白结合，使操纵子游离，诱导lac Z启动子转录，于是外源基因被诱导而高效转录和表达。所以可以通过在培养基中添加IPTG诱导基因的表达。
2．温度诱导
pBV系列表达载体，重组插入PL、R启动子下游的目的基因直接表达受温度变化调控，以非融合蛋白的形式进行表达，该系统尤其适合表达对细胞有毒害的蛋白。
当用PL、R启动子构建表达质粒时，PL、R启动子受λ噬菌体cI基因的负调控，cI基因产生的阻遏蛋白结合在操纵基因上，阻止转录的进行。目前利用cI的温度敏感突变基因
(cIts 857)调节这种阻遏。当在28～30℃培养时，该突变体产生有活性的阻遏蛋白，阻遏
PL、R转录，细菌大量生长。在获得足够量菌体后，使温度上升至42℃．造成阻遏蛋白失活， PL、R解除阻遏，启动外源基因的高效转录和表达，从而合成大量有价值的外源蛋白。
三、注意事项
1．在进行诱导实验中要注意应以含有空载体的宿主菌株以及IPTG诱导前的含有重组子的宿主菌株做对照。 t
2．IPTG诱导的最终浓度为0.3～1 mmol／L。 ；
3．诱导后的培养时间一般不超过3 h。 i
4．有些工程菌，在IPTG诱导后，其发酵温度降低为30℃，则可产生诱导蛋白。 !
四、评议 !
1．在配制SDS上样缓冲液中，可用8％的β一巯基乙醇替代其中的400 mmol／L DTT。 ；
2．异源基因融合表达后面临着蛋白质降解问题。在大肠杆菌细胞中有两个结构影响蛋白质的稳定性：①大肠杆菌细胞中，凡蛋白质N端为精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸 (Trp)等残基的稳定性差，半衰期约2min，而N端如果不是这些氨基酸残基，半衰期可长达10 h。②蛋白质N端内部附近如含有赖氨酸残基，其是泛素蛋白的受体，易被依赖于泛素蛋白的蛋白酶降解。 ‘
3．分析被检测基因在细胞中转录和翻译的情况有以下方法：①Northern杂交，检查细胞中是否含有特定的mRNA；②SDS-PAGE分析诱导前后细胞中目的蛋白质的表达水平；③在Western杂交中用特异性抗体分析目的蛋白质的存在及含量；④利用ELISA等免疫学方法，检测基因表达的强度；⑤直接测定目的蛋白的生物活性，根据活性的大小估计蛋白质的表达量⑥也可将报告基因 ( 如lac Z) 克隆在目的基因的下游，根据报告基因的转录或翻译情况，估计目的蛋白的表达量。
4．从目的基因的碱基数目推算其表达的蛋白质的相对分子质量。 ；
计算方法一：Mr一115×n÷3 (其中n是基因的碱基数)。如表达的基因为1.7 kb，其表达蛋白质的相对分子质量大约为：Mr：115×n÷3 = 115×1700÷3 = 64 833≈65×10。
计算方法二：1.0 kb DNA相当于333氨基酸，即相对分子质量大约为37×103的蛋白质。如表达的基因为1.7 kb，其表达蛋白质的相对分子质量大约为：Mr = 1.7×37—63×103。
5．诱导表达蛋白时应注意凋整诱导培养的温度，不同的蛋白可能有不同的要求。
第三节 表达蛋白的SDS--PAGE分析
一、实验目的
利用SDS—PAGE检测表达蛋白，确定蛋白质的相对分子质量，并掌握其原理与方法。
二、实验原理
电泳是带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象，影响泳动速度的因素主要有颗粒的性质、电场强度和溶液的性质等。①颗粒直径、形状以及所带的静电荷量对泳动速度都有较大影响。一般来说，颗粒带净电荷量越大，或其直径越小，或其形状越接近球形，在电场中的泳动速度就越快。反之则越慢。②电场强度对电泳速度起着十分重要的作用。电场强度越高，带电颗粒的泳动速度就越快，反之则越慢。③溶液性质主要是指电极溶液和蛋白质样品溶液的pH、离子强度和黏度等。溶液的pH决定带电颗粒的解离程度，也即决定其净电荷的量。对蛋白质而言，溶液的pH离其等电点愈远，则其带净电荷量就愈大，从而泳动速度就愈快。反之则愈慢。一般溶液的离子强度在0.02～0.2之间时。电泳较合适。若离子强度过高，则会降低颗粒的泳动度。其原因是，带电颗粒能把溶液中与其电荷相反的离子吸引在自己周围形成离子扩散层，这种静电引力作用的结果，导致颗粒泳动度降低，若离子强度过低，则缓冲能力差，往往会因溶液pH变化而影响泳动度的速率。溶液黏度与泳动度成反比例关系。溶液的性质还通过影响带电颗粒的空间构象而影响其电泳行为。
聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是由单体丙烯酰胺 (acrylamide) 和交联共聚单位(双体)
N’N-甲叉双丙烯酰胺 (N，N-methylene-bis-acrylaimide) 为材料，在引发剂过硫酸铵(APS)和增速剂N，N，N’，N’一四甲基乙二胺TEMED (N，N，N’，N-tetramethylene diamine)的作用下聚合交联形成含酰胺基侧链的脂肪族长链，在相邻长链之间通过甲叉桥连接而形成的三维网状结构物质。聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小与链长度和交联度有关，无论丙烯酰胺的量的多少，当N，N-甲又双丙烯酰胺的量为总丙烯酰胺的5％时，其平均孔径最小，因此一般将N，N’-甲又双丙烯酰胺的含量固定于总量的5％，然后通过改变丙烯酰胺的总量来调节孔径的大小，即有效孔径随着丙烯酰胺的总量的增加而减少。
聚丙烯酰胺凝胶的强度好，有弹性、透明化学性质稳定，在不同pH和温度下变化较小，在很多溶剂中不溶，为非离子型。没有吸附和电渗作用，是一种极好的电泳介质。聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分辨率高、上样量大、回收的样品较纯等特点，但它操作麻烦，且不能分离较大的分子。通常用它分析蛋白质以及分析和制备小于1 kb的DNA或RNA片段。主要用于分离蛋白质和测定蛋白质亚基相对分子质量。但应注意丙烯酰胺是一种潜在的神经毒素，其作用效应能积累，操作时应戴手套。
SDS—PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳)，主要用于分离蛋白质和测定蛋白质亚基相对分子质量。SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，它能断裂分子内和分子间的氢键和疏水键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构；强还原剂，如巯基乙醇和二硫苏糖醇则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚成单个亚基。解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成带有负电荷的蛋白质-SDS胶束。所带的负电荷大大超过了蛋白分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。使蛋白质分子的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质或亚基相对分子质量的大小。
SDS电泳成功的关键之一是电泳过程中，特别是样品制备过程中蛋白质和SDS的结合程度。影响它们结合的因素主要有三个：①溶液中SDS单体的浓度。SDS在水溶液中是以单体和SDS一多肽胶束(SDS—polypeptide micelles)混合形式存在的，能与蛋白质分子结合的是单体。单体的浓度与SDS总浓度、温度、和离子强度有关。由于SDS与蛋白质结合是按重量成比例的，即在一定温度和离子强度下，当SDS总浓度增加到某一定值时，溶液中的SDS浓度不再随SDS总浓度的增加而升高。当SDS单体浓度大于1 mmol／L时，大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1：1.4，如果SDS单体浓度降到0.5 mmol／L以下时，二者的结合比仅为1：0.4。这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，也就不能进行相对分子质量测定。为了保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应为1：4或1：3。高温有利于SDS与蛋白质的结合，样品处理时常在沸水浴中保温。②样品缓冲液的离子强度。因为SDS结合到蛋白质分子上的量仅决定于平衡时SDS的单体浓度。不是总浓度，而只在低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较高的平衡浓度。所以SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，常为10～100 mmol／L。③二硫键是否完全被还原。只有二硫键被彻底还原后，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和相对分子质量对数的线性关系。因此电泳时蛋白质分子的迁移速度仅取决于分子的大小，可根据大小蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶中电泳速度不同即可分离蛋白质，并测出它们的相对分子质量。当蛋白质相对分子质量在(12～165)×103之间，蛋白质分子的迁移率与相对分子质量的对数呈直线关系，符合logMr= K－bx。(Mr为相对分子质量，x为迁移率，K、b均为常数)。
SDS—PAGE还有以下特征：
1)浓缩效应：
在不连续缓冲系统中，样品在进入分离胶以前，先经过大孔径浓缩胶的迁移作用而被浓缩至一极窄的区带。其作用原理是在缓冲系统中的弱酸，如甘氨酸，在接近其pKa的pH时，任何时候都只有一部分分子带负电。如样品和浓缩胶均用pH 6.7的Tris～HCl缓冲液，电极液用Tris-甘氨酸缓冲液。此时，甘氨酸很少解离，其有效泳动率很低，而氯离子却有很高的泳动率，蛋白质分子的泳动率介于氯离子和甘氨酸之间。一旦加上电压，作为先导离子的氯离子和作为尾随离子的甘氨酸离子分离开来，并在其后面留下一个导电性较低的区带。由于导电性和电场强度成反比，这一区带便获得较高的电压梯度，并加速甘氨酸的泳动，使其赶上氯离子，建立起甘氨酸和氯离子的电压梯度和泳动率乘积的相等的稳定态，使这些带电颗粒以相同速度泳动，两种离子之间具有明显的边界。当甘氨酸、氯离子界面通过样品进人浓缩胶时，在移动界面前有一低电压梯度，在界面后有一高电压梯度。由于在移动界面前的蛋白质泳动速度比氯离子低，因此氯离子能迅速通过。移动界面后的蛋白质处于较高的电压梯度中，其泳动速度比甘氨酸快。因此，移动的界面将蛋白质分子堆积到一起，浓缩为一狭窄的区带。蛋白质在
移动界面中的浓缩作用进取决于样品和浓缩胶中的Tris—Hcl浓度，而与样品中的蛋白质的最初浓度无关。由于浓缩胶为大孔凝胶，故对样品没有分子筛作用。
2)分子筛效应：
当夹在快离子和慢离子中间的蛋白质由浓缩胶进入分离胶时，pH和凝胶孔径突然改变。分离胶选用pH 8.9的Tris-HCl缓冲液，与甘氨酸的pKa接近，导致甘氨酸的大量解离。此时甘氨酸的有效泳动率增加，使它越过蛋白质并直接在氯离子后移动。随之高电场强度消失。同时由于凝胶孔径变小，使蛋白质分子的迁移率减小。于是，蛋白质样品就在均一的电场强度和pH条件下通过一定孔径的分离胶。当蛋白质的相对分子质量或构型不同时，通过分离胶所受到的摩擦力和阻滞程度就不同，最终表现出的泳动率也不相同，也就是分子筛效应。即使蛋白质的净电荷相似，也会因分子筛效应在分离胶中被分开。
3)电荷效应：
由于每种蛋白质分子所带的有效电荷不同，故泳动率不同，所以样品经过分离胶电泳后，就以带状按电荷顺序排列起来。
缓冲系统的选择：由于SDS对蛋白质的溶解性能以及负电荷的包裹作用，所以在选择SDS电流缓冲系统时要比常规聚丙烯酰胺凝胶电泳简单得多。一般来说，在被分析的蛋白
质稳定的pH范
围，凡不与SDS
发生相互作用的
缓冲液都可以使
用，但缓冲液的
选择对蛋白质的
分离和电泳的速度是非常关键的。
含有SDS的不连续缓冲系统现在被广泛地用于蛋白质亚基相对分子质量以及纯度的测定。其中目前使用最多的缓冲系统是Tris一甘氨酸系统。在SDS不连续电泳中，样品缓冲液和凝胶缓冲液常采用同一种系统，只是pH和离子强度不同。
凝胶浓度的选择：由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度，只取决于分子解聚后SDS一蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓度的正确选择尤为重要。如果凝胶浓度太大，孔径太小，电泳时样品分子不能进入凝胶。如果凝胶浓度太小，孔径太大，则样品中各种蛋白质分子均随着缓冲液流向前推而不能得以很好地分离。不同相对分子质量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。
三、注意事项
1．β-巯基乙醇吞服可致命，吸入或通过皮肤吸收可致伤。高浓度时对黏膜、上呼吸道、皮肤和眼睛有破坏作用。操作时应注意防护措施。
2．两种丙烯酰胺单体及溶液是中枢神经毒物并容易吸附于皮肤，作用有累积性，操作时要
小心并戴手套。如果皮肤接触了丙烯酰胺的粉末或溶液，立即用肥皂水冲洗。未聚合的丙烯酰胺应用过量催化剂以固体废物形式处理。
3．制备浓缩胶中，添加10％APS和TEMED前，应均匀地混合，一旦加入APS和TEMED
后应快速地旋转混合加入制胶层，因为浓缩胶很快就会聚合凝固。
4．将凝胶灌入制备好的平板内，留出灌注浓缩胶所需空间 (梳齿的齿长再加1 cm)。且制备
浓缩胶前，应先准备好梳子。
5．上槽中应加入新鲜的电极缓冲液，而下槽中则可用旧的电极缓冲液。
6．如果没有数目足够的样品，应在加样孔中加上样缓冲液，不要留有空孔，以防止电泳时邻近带的扩散。在加入不同的样品之前，一定要用电泳缓冲液或蒸馏水冲洗注射器。
7．在凝胶与玻璃板之间插入一根长注射针头将水缓缓注入，在注入水的过程中，针头逐渐
向前伸入，使凝胶与玻璃板分离，注意不要损伤胶面。
8．10％ APS尽量使用时现配现用，4℃保存两周内用完，最多不能超过一个月。-20℃可
保存两个月，但一旦解冻后尽快用完。
四、评议
1．根据SDS电泳的原理，样品缓冲液中必须含有3～4倍于蛋白的SDS和足以断裂二硫键
的还原试剂 (2％二硫苏糖醇或5％β-巯基乙醇)。
2．电泳中出现不规则的蛋白质迁移带是因为电泳不稳定，其他原因还包括样品加量太多、
样品中的盐浓度太高、边缘效应。如果在凝胶边缘电泳条带出现“微笑”状的样品(运动速度减慢)，可能是因为凝胶的中间比两侧更热，应降低电压。
3．电泳结束后，在进行染色前可用固定液处理对凝胶进行20 min处理，其SDS—PAGE的
分析效果会更好。固定液：454 mI的50％甲醇水溶液，46 mI的冰醋酸。
4．除了用考马斯亮蓝染色(其灵敏度较差，最低含量为100 n g蛋白质，但操作容易)，还可
用银染色，其灵敏度高，可比考马斯亮蓝染色法提高100倍，可检测2 ng的蛋白质。银染的机制是将蛋白带上的AgNO3 (Ag)还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。用银染蛋白的吸光度对浓度作图呈现不同的斜率，表明染色的程度是与蛋白中的一些特殊基团有关。在银染过程中，蛋白质首先需要被固定。固定有两个作用，第一是把蛋白固定在凝胶中或至少是阻滞它们在凝胶中的扩散，第二是为了去除干扰染色过程的物质，如去污剂，还原试剂和缓冲液的成分(如甘氨酸)。常用的固定剂有戊二醛，乙醇，甲醛、醋酸以及三氯醋酸，然后将凝胶放在银染溶液中染色。
银染色法：
1)将从制胶板上剥下的凝胶放入50 mL甲醛中固定液，旋转摇床中缓慢摇动10 min以上。2)倒去固定液，用水洗两次，每次5 min，缓慢摇动5min。
3)倒去水，凝胶浸泡在0.2 g／L Na2S203溶液中1 min缓慢移动。
4)倒去Na2S203溶液，用水洗胶2次，每次20 s。
5)倒去水，将凝胶浸泡在50 mL 0.1 %的AgNO3中10 min，缓慢移动。
6)倒去AgNO3，用水洗胶，然后用小量体积的硫代硫酸盐显影液洗。
7)将凝胶浸泡在50 mL新配制的硫代硫酸盐显影液中，缓慢摇动，直至获得足够的条带现
色强度(约1min)。
试剂：
1％硝酸银、0.2g／L的 Na2S203。
甲醛固定液：40％甲醇、0.5 mL 37％ 甲醛。
硫代硫酸盐显影液：3% Na2CO3、0．000 4 % Na2S203、0.5 mL 37％的福尔马林(临用前加入)，不加福
尔马林的溶液可于室温中长期保存。 ＋
第四节 原核表达蛋白的分离与纯化
大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在，需要不同的纯化策略。现在，许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能，这些自然需要将蛋白质分离出来后，进行进一步的研究来获得。分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。必须承认，蛋白质纯化比起DNA克隆和操作来是更具有艺术性的，尽管DNA序列具有异乎寻常的多样性（因而它是唯一适合遗传物质的），但它却有标准的物理化学性质，而每一种蛋白质则有它自己的由氨基酸序列决定的物理化学性质（因而它具有执行众多生物学功能的用途）。正是蛋白质间的这些物理性质上的差异使它们得以能进行纯化但这也意味着需要对每一种待纯化的蛋白质研发一套新的方法。所幸的是，尽管存在这种固有的困难，但现已有多种方法可以利用，蛋白质纯化策略也已实际可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的获得已是相当普遍的事。可诱导表达系统特别是Studier等发展的以噬菌体T7 RNA聚合酶为基础的表达系统的出现使人们能近乎常规地获得超表达（overexpression），表达水平可达细胞蛋白2 %以上，有些甚至高达50 %。
一、可溶性产物的纯化（融合T7·Tag的表达蛋白）操作举例
（一）试剂准备
采用T7· Tag Affinity Purification Kit
1．T7·Tag抗体琼脂。
2．B/W缓冲液：4.29mM Na2HPO4，1.47 mM KH2PO4，2.7 mM KCl，3. 0.137mM NaCl，1%吐温-20，pH7.3。
4. 洗脱缓冲液: 0.1M柠檬酸，pH2.2。
5. 中和缓冲液：2M Tris，pH10.4。
1. PEG 20000。
（二）操作步骤
1. 100ml 含重组表达质粒的菌体诱导后，离心5000g×5min，弃上清，收获菌体，用10ml预冷的B/W缓冲液重悬。
2. 重悬液于冰上超声处理，直至样品不再粘稠，4℃离心 14000g×30min，取上清液，0.45μm膜抽滤后作为样品液。
3. 将结合T7·Tag抗体的琼脂充分悬起，平衡至室温，装入层析柱中。
4. B/W缓冲液平衡后样品液过柱。
5. 10ml B/W缓冲液过柱，洗去未结合蛋白。
6. 用5ml洗脱缓冲液过柱，每次1ml，洗脱液用含150μl中和缓冲液的离心管收集，混匀后置于冰上，直接SDS-PAGE分析。
7. 将洗脱下来的蛋白放入透析袋中，双蒸水透析24hr，中间换液数次。
8. 用PEG 20000浓缩蛋白。
（三）注意事项
蛋白在过层析柱前，要0.45μm膜抽滤，否则几次纯化后，柱子中会有不溶物。
二、包涵体的纯化
包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。包涵体的主要成分就是表达产物，其可占据集体蛋白的40%～95%，此外，还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质，所以分离包涵体后，还要采用适当的方法（如色谱法）进行重组蛋白质的纯化。
（一）试剂配制
1．缓冲液A：50mM Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100mM NaCl。
2．缓冲液B：50mM Tris-HCl（pH8.0）,1mM EDTA,100 mM NaCl,1%NP-40。
3．缓冲液Ⅰ：50mM Tris-HCl （pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100(V/V),4M脲素。
4．缓冲液Ⅱ：50M Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,3% Triton X-100 。
1．缓冲液Ⅲ：50mM Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100,2M 盐酸胍。
5．缓冲液C：8M脲素，10mMβ-巯基乙醇，100 mM Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA及脱氧胆酸钠。
（二）操作步骤
1．用缓冲液A漂洗菌体细胞（10ml/g）, 离心6000g×15min，收集菌体细胞，重复此步骤，将菌体细胞再在缓冲液A中洗涤一次。
2．将漂洗过的菌体细胞悬浮于缓冲液B中，超声破碎，镜检，破碎率高于95%，离心1500g×30min，收集包涵体沉淀。
3．将包涵体沉淀用缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ、缓冲液Ⅲ分别超声洗涤一次，1500g 离心收集包涵体沉淀。
4．包涵体的溶解：用含高浓度脲素的缓冲液室温放置30min，然后离心1500g×30min，留上清。将溶解后的蛋白质适当稀释，磁力搅拌，透析过夜。
5．溶解后的包涵体蛋白可通过亲和层析进一步纯化。
第五节 水稻瘤矮病毒（RGDV）S10组分的原核表达
一、原理
细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。
二、材料和试剂
1、重组质粒：将RGDV的S10组分，共1198 bp构建到原核表达载体pET-28b（＋）上，得到原核表达质粒pET- S10。
2、将pET- S10转化到BL21(DE3)宿主菌中，进行诱导表达。
3、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O， 37OC溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。
4、1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100 ml。
5、1 M Tris-HCl (pH 6.8)：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100 ml。
6、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶, 浓盐酸调至pH 7.2,定容至100 ml。
7、10⨯电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。 8、10%过硫酸铵（APS）：1g APS加ddH2O至10ml。
9、2⨯SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5 ml，β-巯基乙醇1.0 ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚兰 1.0 ml，ddH2O 3.5 ml。
10、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰（R-250或G-250）0.25 g，甲醇225 ml，冰醋酸 46 ml，ddH2O 225 ml。
11、脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成（也可以用0.5 mol/L的NaCL作为脱色液，在50～60℃脱色0.5～1小时）。
12、观察结果，照相保存。此时的PAGE胶在短时间内可以放在蒸馏水中保存。
三、操作步骤
A 诱导表达
1、 挑取含重组质粒的BL21(DE3)宿主菌单斑至2 ml LB（含Kan 50μg/ml，Cam 34μg/ml）中37℃过夜培养。
2、 按1∶100比例稀释过夜菌，一般是将100μL菌加入到含10 mL LB培养基的培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600
≌0.6~0.8（最好为0.6）（3～4小时）。
3、取部分液体作为未诱导的对照组, 余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mM作为实验组,两组继续37℃诱导培
养3～7小时r。
B SDS-PAGE电泳分析（采用垂直式电泳槽装置）
（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制
1、 分离胶 (12 %)的配制: 10 ml
ddH2O 3.3 ml
30%储备胶 4.0ml
1.5M Tris-HCl（pH 8.8） 2.5ml
10% SDS 0.1ml
10% APS 0.1ml
TEMED 0.004 ml
TEMED: N,N,N’,N’-四甲基乙二胺。
各成分混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面持平。凝胶完全聚合需30～60 min。
2、 层积胶（5%）的配制：5 ml
ddH2O 3.4 ml
30%储备胶 0.83 ml
1M Tris-HCl（pH 6.8） 0.63 ml
10%SDS 0.05ml
10%AP 0.05 ml
TEMED 0.005 ml
分离胶凝固后，将其上的水吸去, 加入积层胶混合液, 立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合 需15-～0min。
（二）样品处理
取经诱导的菌液1.5 ml, 12000g离心1 min收获沉淀，将样品加入一半体积的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3～5min，12000g离心 1min，取上清作SDS-PAGE分析。
（三）上样
取15～20μl诱导与未诱导的处理后的样品用微量注射器加入样品池中,并加入20μl低分子量蛋白标准品作对照。
（三） 电泳
在电泳槽中加入1 电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，积层胶电压80V, 分离胶电压120V, 电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止（约需4hr）。
（四）染色:将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室温4～6 hr。
（五）脱色:将胶从染色液中取出,放入脱色液中,多次脱色至蛋白带清晰，观察有无49 Kda的特异蛋白条带出现。
（六） 凝胶摄像和保存
在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，结果存于软盘中，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。
四、注意事项
1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。
2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10% AP在一周内使用。室温较低时，TEMED的量可加倍。
3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。
五、思考题
1．在基因工程中克隆载体与表达载体各起什么作用?各需要具备哪些基本遗传元件?
2．简述诱导外源基因表达的基本原理。
3．如何确保外源基因在宿主中正常表达?怎样得到好的表达效果？
4．蛋白质电泳制胶要注意哪些方面?
5．比较核酸电泳与蛋白质电泳的异同之处。