摘 要：从水稻中克隆得到病程相关蛋白10a基因的启动子PR10aP，构建该启动子驱动的可溶性绿色荧光蛋白基因（smGFP）的植物表达载体p3300-PR10aP-GFP，并用农杆菌介导法将其导入烟草，检测转基因植株经水杨酸（SA）诱导前后GFP的表达水平。序列分析表明PR10aP长度为1182bp，与已经报道的序列存在4个碱基的差别，含已报道序列的顺式作用元件，如水杨酸相关的W-box、ACGT序列等，也有增强子as-a-like元件及CAAT、TATA等常见应答元件。PCR检测结果显示，成功地获得了转基因烟草，荧光检测表明启动子PR10aP在正常条件下不表现活性，而在水杨酸诱导下GFP表达，证明新获得的水稻病程相关蛋白10a的启动子PR10aP具有水杨酸诱导性。
关键词：水稻；病程相关蛋白10a 启动子；水杨酸；绿色荧光蛋白
中图分类号：S435.11 文献标识码：A
水稻是我国最重要的粮食作物之一，中国的水稻面积占总粮食面积的30%，但总产量却占粮食总产量的40%。中国是世界上最大的水稻生产国，常年稻谷总产量占世界稻谷总产量的39%以上。水稻不仅保证中国的粮食需求，而且在国民经济中占有重要地位。因此，选育出优良的水稻良种，直接决定着水稻产量和水稻的抗病性。转基因技术为水稻育种提供了新的育种技术。
启动子是植物基因表达的重要调控元件，启动子可分为组成型启动子和特异型启动子，组成型启动子如：来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子、来源于玉米泛素基因的Pubi启动子、来源于水稻肌动蛋白的Pactin1启动子，其特点是组成型启动子启动其下游功能基因在植物的整个生长周期及各个器官中均有表达。特异型启动子又可分为组织特异性启动子和诱导型启动子，组织特异性启动子是控制功能基因在植株特定部位表达，诱导型启动子是控制功能基因在植株发育的特定阶段或特定条件下表达。
在转基因植物的研究中，提高植物抗逆性是一个重要的研究方面，植物抗逆性可分为对生物胁迫的抗性和对非生物胁迫的抗性。在生物胁迫方面，植物一生中会受到病毒、细菌、真菌、昆虫等伤害，但其伤害往往不是伴随植物一生的，而是发生在植物生长的特定时期，由于组成型启动子驱动功能基因在植物整个生长周期表达，利用转基因技术提高植物对生物胁迫的伤害，如果利用组成型启动子就会造成了能量的浪费，同时也会影响植物自身的正常生长，所以，利用诱导型启动子就显得更适合。
植物在长期的进化过程中，形成了一套对生物胁迫的防卫体系[2]——系统获得性免疫，即植物在被病原体侵害或水杨酸诱导时，诱导合成出一系列病程相关（PR）蛋白[3]，如几丁质酶[]等，这些蛋白具有广谱的植物抗病作用。
本实验从水稻品种“吉农大858”中克隆了病程相关蛋白10a基因的启动子PR10aP，并构建了由其驱动的绿色荧光蛋白（GFP）植物表达载体，采用农杆菌Boletus介导转化法，得到再生烟草植株，通过水杨酸诱导试验证明新获得的PR10aP启动子具有水杨酸诱导条件下的特异启动功能，为该启动子的进一步利用奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料
水稻品种“吉农大858”由吉林农业大学农学院提供；烟草保存于吉林省农科院生物技术实验室。
1.1.2 菌株和质粒
从福州晶泰生物技术有限公司购买了宿主菌（Escherichia coli）Trans1-T1，从上海科兴生物科技有限公司购买了pGM-T克隆试剂盒，在吉林省农科院生物技术实验室保存了根癌农杆菌（Agrobactium tu）EHA105及植物表达载体p3300-GFP。
1.1.3 试剂
从北京赛百盛生物工程公司购买了连接酶、限制性内切酶，从北京全式金生物工程公司购买了TransTaq DNA Polymerase High Fidelity （HiFi） Taq酶，从成都福际生物技术有限公司购买了胶回收试剂盒。从加拿大MBI公司购买了分子量标准200bp ladder。
1.2 方法
1.2.1 克隆PR10a启动子片段并进行该片段的序列分析
模板选用水稻品种“吉农大858”基因组DNA，扩增用根据已发表的PR10a启动子序列（Genbank GQ487632.1）设计的引物。此引物序列为：
PR10aPF： 5'-GCCCTACAGCAAATACACGTTCTTA-3'
PR10aPR： 5'-CACTGAAGATATAATCTAACTAG-3'
PCR程序：94℃ 5min；94℃ 30s ，57.4℃ 30s，72 ℃ 90s ，32个循环；72℃10min。PCR产物纯化后连入克隆载体pGM-T，测序由北京百迈客生物科技有限公司，并用VectorNTISuite和DNASIS 软件对其进行序列分析。
1.2.2 p3300-PR10aP-GFP 植物特异性诱导表达载体的构建
用EcoR I切下pGM-T-PR10aP上的PR10aP启动子，将其与用相同酶切的p3300-GFP大片段上连接，之后进行EcoR I酶切与PCR验证，将正确的载体命名为p3300-PR10aP-GFP。
1.2.3 农杆菌介导烟草的遗传转化
1.2.3.1 菌液和外植体无菌烟草小块的准备
在农杆菌EHA105中，通过液氮冻融法[4]转入名为p3300-PR10aP-GFP的载体。将该载体在液体LB培养基培养至OD600值在0.6～1.0之间，要求此配培养基中利福平卡和那霉素的浓度50μg/mL、pH值为7.0，在离心机中，采用4000r/min的速度，离心10min后，收集菌体。在附加2g/L MES，pH5.8的MS培养基（也称侵染培养基）中重悬至OD600为1.0，之后在28℃的条件下，温浴2～4h以备使用。 选取灭菌的烟草苗叶子，最好是从心向外数的第2片和第3片，将其切成6mm×6mm的小块备用，该小块即为外植体。
1.2.3.2 烟草转化
在制备好的农杆菌悬液中，浸入准备好的外植体（无菌烟草叶片小块），每隔3～4min轻轻晃动，浸泡10min即可。之后将外植体捞出吸干，为防止污染，吸干需用无菌滤纸，将干的外植体接种到含有2g/L MES的MS共同培养基上，在室温25℃暗光或弱光共培养。
在共同培养3d后，需要抑菌，抑菌需要将烟草叶片小块转入含有2mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、500mg/L头孢霉素的MS培养基上，上述培养基亦成为抑菌培养基。在抑菌培养基上培养7d后，将烟草叶片小块转入含有2mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、2mg/L Basta、250mg/L头孢霉素的MS培养基上，即为筛选培养基。每隔1周用此培养基继代1次。剪下待筛选继代过程生出不定芽的3～4片小叶，转入含有5mg/L Basta、250mg/L头孢霉素的MS培养基，及生根培养基中。过10d左右，上述不定芽生根，从而获得再生烟草植株。
1.2.4 转化再生植株的PCR检测
选用北京天根植物DNA提取试剂盒从再生烟草植株的叶片中提取基因组DNA，将提取的基因组DNA稀释至100ng/mL作为模板，阳性对照选择载体p3300-PR10aP-GFP，阴性对照选择未转化的烟草植株，PCR扩增选用GFP基因的特异性引物，引物序列分别为：
GFPR：5-AGATTGTGTGGACAGGTAATGGTTG-3′
GFPF：5-GTAAGGGAGAAGAACTTTTCACTGG-3′
PCR 扩增条件为：94℃ 5min；94℃ 30s，56.1℃ 30s，74℃ 80s，30个循环；74℃10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像系统分析。
1.2.5 PR10a启动子活性鉴定
选择含有0.25mg/L水杨酸的MS培养基，即诱导培养基，将经PCR检测的转基因植株（处理组）和未转化植株（对照组）分别转入其中，并在暗光中诱导72h。处理之前剪下叶片在84nm紫外灯下观察[5]，同样在处理后剪下叶片在84nm紫外灯下观察，并照相记录其结果。在处理组和对照组中，都设定非转基因阴性对照。
剪下转基因植株的叶片，将叶片放在含有0.25mg/L水杨酸的MS培养基中，进行浸泡处理，分别取经过0、6、12、24、72、120、168h浸泡处理的叶片，加入液氮后研磨成粉末，按照1份粉末加2份PBS缓冲液（137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/L KH2PO4）的比例混匀，采用冰浴的方法至其完全融化。用漩涡振荡器进行漩涡30s；在4℃、用离心机，在15000r/min的速度下，离心20min，取上清液。
提取浸泡在分别含有0、0.0025、0.01、0.025、0.1、0.25、1、2.5mg/L水杨酸的MS培养基的烟草叶片中的总蛋白，用包被液把蛋白样品稀释至原来的200倍。将绿色荧光蛋白标准样稀释到100、50、10、5、1、0.1、0.05μg/mL，所采用的包被液标准为1.59g/L Na2CO3，2.93 g/L Na2CO3，根据此数据绘制标准曲线。
将上述稀释液各取150μl，分别置于酶标板中，在4～5℃的温度下包被过夜。第2日将各样品溶液倒掉，选择PBST（3含1% Tween20的PBS）作为缓冲液，洗涤酶标板4min，重复进行3次，之后加入200uL含有10%脱脂奶粉的PBS的封闭液，在37℃的条件下，封闭2h；将封闭液倒掉，再次运用上述方法进行洗涤，然后加入用封闭液稀释的一抗（兔抗GFP）工作液150μL，在37℃条件下包被1h；将一抗工作液倒掉，运用前述洗涤方法洗涤，加入用封闭液稀释的二抗（羊抗兔）150μL，包被1h；将二抗封闭液倒掉，继续用上述同样方法洗涤后，加入150μL显色剂，在室温及暗光的条件中反应15min，进行终止反应时加入100μL 2mol/L H2SO4，在酶标仪450nm处读取吸光值。根据吸光值在不同浓度的绿色荧光蛋白标准样的数值绘制标准曲线，选取标准曲线中R2>0.978的部分，根据该数据计算出各个对应样品中绿色荧光蛋白含量。
同样方法，将置于附加0.25mg/L水杨酸的MS培养基中浸泡0、6、12、24、48、72、120、168h的叶片提取总蛋白按照上述测定各个样品中绿色荧光蛋白含量。
2 结果分析
2.1 克隆PR10a启动子片段与其序列分析
2.1.1 克隆 PR10a启动子片段
以水稻DNA为模板用PR10aP上下游引物（PR10aPF、PR10aPR）PCR扩增出了约1.18k的DNA片度，该扩增的长度与试验预期的情况相同（图1a）。TA克隆载体pGM-T在插入回收的片段后，运用PCR检测上述扩增的DNA片度为1.18k，该鉴定采用以EcoRⅠ酶切，释放的DNA片度（图1b）为1.18k，命名该重组质粒为pGM-T-PR10aP。
图1 PR10a启动子的克隆和酶切鉴定
（a） PR10a启动子的PCR扩增 M：分子量标准200bp的DNA；1-2：PCR 产物；3：ddH2O
（b）鉴定重组质粒pGM-T-PR10aP M：DNA分子量标准200bp ladder；1-2：鉴定pGM-T-PR10aP的EcoRⅠ酶切；3-4：鉴定PCR
2.1.2 PR10a启动子的序列分析
所获得的PCR扩增产物PR10aP序列的长度为1182bp，它有4个碱基的差异与已经报道的序列，其同源性为99.7%（见图2）。由于在PCR反应时使用的Taq酶为高保真的，且根据生物数据库，发现全序列中所有顺式作用元件未表现差异，故可认为出现的4个碱基差异为个体间差异（见图2）。 图2 PR10a启动子序列
W-box用“ ”标出；as-1-like元件用“ ”标出；TAAATG-box用“ ”标出；CAAT-box用“ ”标出；
glyco-box用“ ”标出；CAC-box用“ ”标出；TATA-box用“ .”标出
2.2 构建名为p3300-PR10aP-GFP的植物特异性诱导表达载体
如下图3所示，将p3300-GFP中用于启动GFP的35S启动子替换为PR10a，将pGM-T-PR10aP和p3300-GFP分别用EcoRⅠ酶切，回收小片段的pGM-T-PR10aP酶切产物和大片段的p3300-GFP酶切产物，将大肠杆菌用T4 DNA连接酶连接转化。制作菌落PCR时，采用PR10a上游引物（PR10aPF）和GFP下游引物（GFPR），从中选择片段，使该片段能扩增到长度约为1.9k（图4A），将释放出长约1.2k的片段（图4B）用EcoRⅠ酶切鉴定，将测序证实方向正确的重组载体命名为p3300-PR10aP-GFP。
图3 植物表达载体p3300-GFP（A）、p3300-PR10aP-GFP（B）的T-DNA结构
图4 p3300-PR10aP-GFP的PCR和酶切鉴定
M：DNA分子量标准200bp ladder；A：PCR；B： EcoRⅠ酶切p3300-PR10aP-GFP
2.3 转化再生植株的获得及PCR检测
在烟草被侵染15d后，出现了不定芽，在不定芽长出4～5叶时，将叶子剪下，将其转入生根培养基中。大约过2周后，不定芽生根，获得了41株抗性再生植株。运用GFP基因中的上游引物GFPF和下游引物GFPR（两者间距离611bp）进行PCR检测，检测出16棵阳性植株，其阳性率为39.0%（如图5所示）。
A B
C D
图5 烟草抗性植株的获得及PCR检测
A：外植体的分化；B、C：筛选与生根；D：PCR检测
M：DNA分子量标准200bp ladder；+：质粒；-：非转化植株；1-10：部分转化植株
2.4 转基因烟草GFP的表达
在弱光或暗光条件下，将烟草无菌苗用1.5mg/L水杨酸处理。在72h之后，将上述处理的转基因植株叶片和没有处理的转基因植物叶片，在72h后分别剪取水杨酸诱导的转基因植株和未经诱导植株叶片在波长384nm紫外灯下观察，结果（图6A，B）表明，经水杨酸诱导下的PR10a启动子表现出驱动GFP表达的活性，而烟草在未处理的情况下GFP不表达。
通过ELISA法对绿色荧光蛋白在总可溶性蛋白中的含量进行分析，结果显示，在水杨酸质量浓度达到0.25mg/L，处理时间达到72h后GFP的表达量达到最高值。转基因植株中GFP最高占到总可溶性蛋白的0.074%，产率最高可达14.07μg/g*FW（图6C，D）。
图6 转基因植株的GFP表达情况
A： 未诱导时非转基因植株（1）与非转基因植株（2）在自然光（左）和紫外光下（右）均表现一致。B： 诱导后非转基因植株（1）与转基因植株（2）在自然光（左）表现一致，但紫外光下（右）转基因植株有绿色荧光发出而非转基因植株没有。C.不同诱导时间下GFP的表达量。 D：不同水杨酸质量浓度条件下GFP的表达量
3 讨论
水稻病程相关蛋白10a启动子作为一个调控水稻病程相关蛋白10a表达的启动子，在超敏反应过程或水杨酸及其类似物处理的植株中均会被诱导表达[6]。本试验从水稻基因组中克隆了1.18kb的PR10aP启动子，经分析，其与已发表的序列有4个碱基的差别，为新基因，其序列中包含有TAAATG-box、TATA-box、ATF_CREB、CAC-box、CAAT-box、glyco-box等顺式元件，也包含有W-box（381bp，1004 bp）水杨酸应答元件，这种结构确保了其水杨酸应答的专一性。该启动子活性相关的GCC-box与已有的报道相同[4]，启动子中848bp处的as-1-like结构为天然状态，在以后的研究中可以考虑按照Rose等[5]研究的方式加以改造以获得更大的诱导表达量。
本研究证实，转PR10a启动子转基因烟草中GFP基因的表达受水杨酸诱导，为该启动子在转基因植物抗病育种中的应用奠定了基础。利用该启动子的诱导性结合位点特异性重组系统，可以构建MAT型[6]（multi-autotransformation）无标记载体，以培育无标记的转基因植物，提高转基因植物的安全性。
参考文献
[1] 张红霞，华子春，沈萍萍.植物防御反应与动物免疫应答的比较及其对应性初探[J].生物工程进展， 2001，21（4）： 46-50.
[2] 董霞，李文正，付坚，等.水杨酸诱导的烟草抗性相关序列的分离[J].植物生理学通讯， 2007，43（4）：711-715.
[3] Hofen R， Willmitzer L. Storage of competent cells for Agrobacterium transformation [J ].Nucleic Acids Research，1988，16：9877.
[4] Rose G， Georg S， Artur J. P， et al. Salicylic acid and the hypersensitive response initiate distinct signal transduction pathways in tobacco that converge on the as-1-like element of the PR-10a promoter[J].Biochem. 2003，270：4876–4886.
[5] 王俊杰，宋晔华，范亚军，等.糖皮质激素诱导绿色荧光蛋白在烟草中的表达[J].吉林农业大学学报， 2008，30（4）：427-435.
[6] Lotan T， Ori N， Fluhr R. Pathogenesis-related proteins are developmentally regulated in tobacco flowers[J].The Plant cell 1989，1（9）：881-887.
摘 要：从水稻中克隆得到病程相关蛋白10a基因的启动子PR10aP，构建该启动子驱动的可溶性绿色荧光蛋白基因（smGFP）的植物表达载体p3300-PR10aP-GFP，并用农杆菌介导法将其导入烟草，检测转基因植株经水杨酸（SA）诱导前后GFP的表达水平。序列分析表明PR10aP长度为1182bp，与已经报道的序列存在4个碱基的差别，含已报道序列的顺式作用元件，如水杨酸相关的W-box、ACGT序列等，也有增强子as-a-like元件及CAAT、TATA等常见应答元件。PCR检测结果显示，成功地获得了转基因烟草，荧光检测表明启动子PR10aP在正常条件下不表现活性，而在水杨酸诱导下GFP表达，证明新获得的水稻病程相关蛋白10a的启动子PR10aP具有水杨酸诱导性。
关键词：水稻；病程相关蛋白10a 启动子；水杨酸；绿色荧光蛋白
中图分类号：S435.11 文献标识码：A
水稻是我国最重要的粮食作物之一，中国的水稻面积占总粮食面积的30%，但总产量却占粮食总产量的40%。中国是世界上最大的水稻生产国，常年稻谷总产量占世界稻谷总产量的39%以上。水稻不仅保证中国的粮食需求，而且在国民经济中占有重要地位。因此，选育出优良的水稻良种，直接决定着水稻产量和水稻的抗病性。转基因技术为水稻育种提供了新的育种技术。
启动子是植物基因表达的重要调控元件，启动子可分为组成型启动子和特异型启动子，组成型启动子如：来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子、来源于玉米泛素基因的Pubi启动子、来源于水稻肌动蛋白的Pactin1启动子，其特点是组成型启动子启动其下游功能基因在植物的整个生长周期及各个器官中均有表达。特异型启动子又可分为组织特异性启动子和诱导型启动子，组织特异性启动子是控制功能基因在植株特定部位表达，诱导型启动子是控制功能基因在植株发育的特定阶段或特定条件下表达。
在转基因植物的研究中，提高植物抗逆性是一个重要的研究方面，植物抗逆性可分为对生物胁迫的抗性和对非生物胁迫的抗性。在生物胁迫方面，植物一生中会受到病毒、细菌、真菌、昆虫等伤害，但其伤害往往不是伴随植物一生的，而是发生在植物生长的特定时期，由于组成型启动子驱动功能基因在植物整个生长周期表达，利用转基因技术提高植物对生物胁迫的伤害，如果利用组成型启动子就会造成了能量的浪费，同时也会影响植物自身的正常生长，所以，利用诱导型启动子就显得更适合。
植物在长期的进化过程中，形成了一套对生物胁迫的防卫体系[2]——系统获得性免疫，即植物在被病原体侵害或水杨酸诱导时，诱导合成出一系列病程相关（PR）蛋白[3]，如几丁质酶[]等，这些蛋白具有广谱的植物抗病作用。
本实验从水稻品种“吉农大858”中克隆了病程相关蛋白10a基因的启动子PR10aP，并构建了由其驱动的绿色荧光蛋白（GFP）植物表达载体，采用农杆菌Boletus介导转化法，得到再生烟草植株，通过水杨酸诱导试验证明新获得的PR10aP启动子具有水杨酸诱导条件下的特异启动功能，为该启动子的进一步利用奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料
水稻品种“吉农大858”由吉林农业大学农学院提供；烟草保存于吉林省农科院生物技术实验室。
1.1.2 菌株和质粒
从福州晶泰生物技术有限公司购买了宿主菌（Escherichia coli）Trans1-T1，从上海科兴生物科技有限公司购买了pGM-T克隆试剂盒，在吉林省农科院生物技术实验室保存了根癌农杆菌（Agrobactium tu）EHA105及植物表达载体p3300-GFP。
1.1.3 试剂
从北京赛百盛生物工程公司购买了连接酶、限制性内切酶，从北京全式金生物工程公司购买了TransTaq DNA Polymerase High Fidelity （HiFi） Taq酶，从成都福际生物技术有限公司购买了胶回收试剂盒。从加拿大MBI公司购买了分子量标准200bp ladder。
1.2 方法
1.2.1 克隆PR10a启动子片段并进行该片段的序列分析
模板选用水稻品种“吉农大858”基因组DNA，扩增用根据已发表的PR10a启动子序列（Genbank GQ487632.1）设计的引物。此引物序列为：
PR10aPF： 5'-GCCCTACAGCAAATACACGTTCTTA-3'
PR10aPR： 5'-CACTGAAGATATAATCTAACTAG-3'
PCR程序：94℃ 5min；94℃ 30s ，57.4℃ 30s，72 ℃ 90s ，32个循环；72℃10min。PCR产物纯化后连入克隆载体pGM-T，测序由北京百迈客生物科技有限公司，并用VectorNTISuite和DNASIS 软件对其进行序列分析。
1.2.2 p3300-PR10aP-GFP 植物特异性诱导表达载体的构建
用EcoR I切下pGM-T-PR10aP上的PR10aP启动子，将其与用相同酶切的p3300-GFP大片段上连接，之后进行EcoR I酶切与PCR验证，将正确的载体命名为p3300-PR10aP-GFP。
1.2.3 农杆菌介导烟草的遗传转化
1.2.3.1 菌液和外植体无菌烟草小块的准备
在农杆菌EHA105中，通过液氮冻融法[4]转入名为p3300-PR10aP-GFP的载体。将该载体在液体LB培养基培养至OD600值在0.6～1.0之间，要求此配培养基中利福平卡和那霉素的浓度50μg/mL、pH值为7.0，在离心机中，采用4000r/min的速度，离心10min后，收集菌体。在附加2g/L MES，pH5.8的MS培养基（也称侵染培养基）中重悬至OD600为1.0，之后在28℃的条件下，温浴2～4h以备使用。 选取灭菌的烟草苗叶子，最好是从心向外数的第2片和第3片，将其切成6mm×6mm的小块备用，该小块即为外植体。
1.2.3.2 烟草转化
在制备好的农杆菌悬液中，浸入准备好的外植体（无菌烟草叶片小块），每隔3～4min轻轻晃动，浸泡10min即可。之后将外植体捞出吸干，为防止污染，吸干需用无菌滤纸，将干的外植体接种到含有2g/L MES的MS共同培养基上，在室温25℃暗光或弱光共培养。
在共同培养3d后，需要抑菌，抑菌需要将烟草叶片小块转入含有2mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、500mg/L头孢霉素的MS培养基上，上述培养基亦成为抑菌培养基。在抑菌培养基上培养7d后，将烟草叶片小块转入含有2mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、2mg/L Basta、250mg/L头孢霉素的MS培养基上，即为筛选培养基。每隔1周用此培养基继代1次。剪下待筛选继代过程生出不定芽的3～4片小叶，转入含有5mg/L Basta、250mg/L头孢霉素的MS培养基，及生根培养基中。过10d左右，上述不定芽生根，从而获得再生烟草植株。
1.2.4 转化再生植株的PCR检测
选用北京天根植物DNA提取试剂盒从再生烟草植株的叶片中提取基因组DNA，将提取的基因组DNA稀释至100ng/mL作为模板，阳性对照选择载体p3300-PR10aP-GFP，阴性对照选择未转化的烟草植株，PCR扩增选用GFP基因的特异性引物，引物序列分别为：
GFPR：5-AGATTGTGTGGACAGGTAATGGTTG-3′
GFPF：5-GTAAGGGAGAAGAACTTTTCACTGG-3′
PCR 扩增条件为：94℃ 5min；94℃ 30s，56.1℃ 30s，74℃ 80s，30个循环；74℃10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像系统分析。
1.2.5 PR10a启动子活性鉴定
选择含有0.25mg/L水杨酸的MS培养基，即诱导培养基，将经PCR检测的转基因植株（处理组）和未转化植株（对照组）分别转入其中，并在暗光中诱导72h。处理之前剪下叶片在84nm紫外灯下观察[5]，同样在处理后剪下叶片在84nm紫外灯下观察，并照相记录其结果。在处理组和对照组中，都设定非转基因阴性对照。
剪下转基因植株的叶片，将叶片放在含有0.25mg/L水杨酸的MS培养基中，进行浸泡处理，分别取经过0、6、12、24、72、120、168h浸泡处理的叶片，加入液氮后研磨成粉末，按照1份粉末加2份PBS缓冲液（137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/L KH2PO4）的比例混匀，采用冰浴的方法至其完全融化。用漩涡振荡器进行漩涡30s；在4℃、用离心机，在15000r/min的速度下，离心20min，取上清液。
提取浸泡在分别含有0、0.0025、0.01、0.025、0.1、0.25、1、2.5mg/L水杨酸的MS培养基的烟草叶片中的总蛋白，用包被液把蛋白样品稀释至原来的200倍。将绿色荧光蛋白标准样稀释到100、50、10、5、1、0.1、0.05μg/mL，所采用的包被液标准为1.59g/L Na2CO3，2.93 g/L Na2CO3，根据此数据绘制标准曲线。
将上述稀释液各取150μl，分别置于酶标板中，在4～5℃的温度下包被过夜。第2日将各样品溶液倒掉，选择PBST（3含1% Tween20的PBS）作为缓冲液，洗涤酶标板4min，重复进行3次，之后加入200uL含有10%脱脂奶粉的PBS的封闭液，在37℃的条件下，封闭2h；将封闭液倒掉，再次运用上述方法进行洗涤，然后加入用封闭液稀释的一抗（兔抗GFP）工作液150μL，在37℃条件下包被1h；将一抗工作液倒掉，运用前述洗涤方法洗涤，加入用封闭液稀释的二抗（羊抗兔）150μL，包被1h；将二抗封闭液倒掉，继续用上述同样方法洗涤后，加入150μL显色剂，在室温及暗光的条件中反应15min，进行终止反应时加入100μL 2mol/L H2SO4，在酶标仪450nm处读取吸光值。根据吸光值在不同浓度的绿色荧光蛋白标准样的数值绘制标准曲线，选取标准曲线中R2>0.978的部分，根据该数据计算出各个对应样品中绿色荧光蛋白含量。
同样方法，将置于附加0.25mg/L水杨酸的MS培养基中浸泡0、6、12、24、48、72、120、168h的叶片提取总蛋白按照上述测定各个样品中绿色荧光蛋白含量。
2 结果分析
2.1 克隆PR10a启动子片段与其序列分析
2.1.1 克隆 PR10a启动子片段
以水稻DNA为模板用PR10aP上下游引物（PR10aPF、PR10aPR）PCR扩增出了约1.18k的DNA片度，该扩增的长度与试验预期的情况相同（图1a）。TA克隆载体pGM-T在插入回收的片段后，运用PCR检测上述扩增的DNA片度为1.18k，该鉴定采用以EcoRⅠ酶切，释放的DNA片度（图1b）为1.18k，命名该重组质粒为pGM-T-PR10aP。
图1 PR10a启动子的克隆和酶切鉴定
（a） PR10a启动子的PCR扩增 M：分子量标准200bp的DNA；1-2：PCR 产物；3：ddH2O
（b）鉴定重组质粒pGM-T-PR10aP M：DNA分子量标准200bp ladder；1-2：鉴定pGM-T-PR10aP的EcoRⅠ酶切；3-4：鉴定PCR
2.1.2 PR10a启动子的序列分析
所获得的PCR扩增产物PR10aP序列的长度为1182bp，它有4个碱基的差异与已经报道的序列，其同源性为99.7%（见图2）。由于在PCR反应时使用的Taq酶为高保真的，且根据生物数据库，发现全序列中所有顺式作用元件未表现差异，故可认为出现的4个碱基差异为个体间差异（见图2）。 图2 PR10a启动子序列
W-box用“ ”标出；as-1-like元件用“ ”标出；TAAATG-box用“ ”标出；CAAT-box用“ ”标出；
glyco-box用“ ”标出；CAC-box用“ ”标出；TATA-box用“ .”标出
2.2 构建名为p3300-PR10aP-GFP的植物特异性诱导表达载体
如下图3所示，将p3300-GFP中用于启动GFP的35S启动子替换为PR10a，将pGM-T-PR10aP和p3300-GFP分别用EcoRⅠ酶切，回收小片段的pGM-T-PR10aP酶切产物和大片段的p3300-GFP酶切产物，将大肠杆菌用T4 DNA连接酶连接转化。制作菌落PCR时，采用PR10a上游引物（PR10aPF）和GFP下游引物（GFPR），从中选择片段，使该片段能扩增到长度约为1.9k（图4A），将释放出长约1.2k的片段（图4B）用EcoRⅠ酶切鉴定，将测序证实方向正确的重组载体命名为p3300-PR10aP-GFP。
图3 植物表达载体p3300-GFP（A）、p3300-PR10aP-GFP（B）的T-DNA结构
图4 p3300-PR10aP-GFP的PCR和酶切鉴定
M：DNA分子量标准200bp ladder；A：PCR；B： EcoRⅠ酶切p3300-PR10aP-GFP
2.3 转化再生植株的获得及PCR检测
在烟草被侵染15d后，出现了不定芽，在不定芽长出4～5叶时，将叶子剪下，将其转入生根培养基中。大约过2周后，不定芽生根，获得了41株抗性再生植株。运用GFP基因中的上游引物GFPF和下游引物GFPR（两者间距离611bp）进行PCR检测，检测出16棵阳性植株，其阳性率为39.0%（如图5所示）。
A B
C D
图5 烟草抗性植株的获得及PCR检测
A：外植体的分化；B、C：筛选与生根；D：PCR检测
M：DNA分子量标准200bp ladder；+：质粒；-：非转化植株；1-10：部分转化植株
2.4 转基因烟草GFP的表达
在弱光或暗光条件下，将烟草无菌苗用1.5mg/L水杨酸处理。在72h之后，将上述处理的转基因植株叶片和没有处理的转基因植物叶片，在72h后分别剪取水杨酸诱导的转基因植株和未经诱导植株叶片在波长384nm紫外灯下观察，结果（图6A，B）表明，经水杨酸诱导下的PR10a启动子表现出驱动GFP表达的活性，而烟草在未处理的情况下GFP不表达。
通过ELISA法对绿色荧光蛋白在总可溶性蛋白中的含量进行分析，结果显示，在水杨酸质量浓度达到0.25mg/L，处理时间达到72h后GFP的表达量达到最高值。转基因植株中GFP最高占到总可溶性蛋白的0.074%，产率最高可达14.07μg/g*FW（图6C，D）。
图6 转基因植株的GFP表达情况
A： 未诱导时非转基因植株（1）与非转基因植株（2）在自然光（左）和紫外光下（右）均表现一致。B： 诱导后非转基因植株（1）与转基因植株（2）在自然光（左）表现一致，但紫外光下（右）转基因植株有绿色荧光发出而非转基因植株没有。C.不同诱导时间下GFP的表达量。 D：不同水杨酸质量浓度条件下GFP的表达量
3 讨论
水稻病程相关蛋白10a启动子作为一个调控水稻病程相关蛋白10a表达的启动子，在超敏反应过程或水杨酸及其类似物处理的植株中均会被诱导表达[6]。本试验从水稻基因组中克隆了1.18kb的PR10aP启动子，经分析，其与已发表的序列有4个碱基的差别，为新基因，其序列中包含有TAAATG-box、TATA-box、ATF_CREB、CAC-box、CAAT-box、glyco-box等顺式元件，也包含有W-box（381bp，1004 bp）水杨酸应答元件，这种结构确保了其水杨酸应答的专一性。该启动子活性相关的GCC-box与已有的报道相同[4]，启动子中848bp处的as-1-like结构为天然状态，在以后的研究中可以考虑按照Rose等[5]研究的方式加以改造以获得更大的诱导表达量。
本研究证实，转PR10a启动子转基因烟草中GFP基因的表达受水杨酸诱导，为该启动子在转基因植物抗病育种中的应用奠定了基础。利用该启动子的诱导性结合位点特异性重组系统，可以构建MAT型[6]（multi-autotransformation）无标记载体，以培育无标记的转基因植物，提高转基因植物的安全性。
参考文献
[1] 张红霞，华子春，沈萍萍.植物防御反应与动物免疫应答的比较及其对应性初探[J].生物工程进展， 2001，21（4）： 46-50.
[2] 董霞，李文正，付坚，等.水杨酸诱导的烟草抗性相关序列的分离[J].植物生理学通讯， 2007，43（4）：711-715.
[3] Hofen R， Willmitzer L. Storage of competent cells for Agrobacterium transformation [J ].Nucleic Acids Research，1988，16：9877.
[4] Rose G， Georg S， Artur J. P， et al. Salicylic acid and the hypersensitive response initiate distinct signal transduction pathways in tobacco that converge on the as-1-like element of the PR-10a promoter[J].Biochem. 2003，270：4876–4886.
[5] 王俊杰，宋晔华，范亚军，等.糖皮质激素诱导绿色荧光蛋白在烟草中的表达[J].吉林农业大学学报， 2008，30（4）：427-435.
[6] Lotan T， Ori N， Fluhr R. Pathogenesis-related proteins are developmentally regulated in tobacco flowers[J].The Plant cell 1989，1（9）：881-887.