RNA在核糖体催化蛋白质合成中的作用

中国科学 C辑:生命科学 2009年第39卷第1期: 69 ~ 77 www.scichina.com life.scichina.com

《中国科学》杂志社

SCIENCE IN CHINA PRESS

RNA在核糖体催化蛋白质合成中的作用

张必良, 王玮

中国科学院广州生物医药与健康研究院, 呼吸疾病国家重点实验室, 广州 510663 E-mail: [email protected]

收稿日期: 2008-09-18; 接受日期: 2008-11-28

国家自然科学基金(批准号: 30870535)、国家高技术研究发展计划(批准号: 2006AA02Z191)、广州市科技攻关项目(批准号: 2007Z1-E4041)和广州经济开发区科技项目(批准号: 2007G-P029)资助

摘要核糖体是所有生命细胞的蛋白质合成工厂. 近几年对核糖体晶体结构的研究有了里程碑式的进展. 核糖体是一个核酶. 用体外筛选技术发现的核酶像核糖体一样也能催化肽键形成. RNA在生命起源中也有着不可替代的作用. 近期发现的小RNA在转录调节、染色体复制、mRNA稳定性和翻译, 及蛋白质降解和转运过程中都起作用. RNA越来越受到人们的重视, 一个崭新的现代“RNA世界”正在出现. 虽然核糖体在细胞中起着非常重要的作用, 但是其肽基转移反应机制还不很清楚. 本文介绍了肽基转移核酶与核糖体催化机理以及RNA在生命与进化中的作用和功能.

关键词

核酶 RNA合成核糖体肽基转移酶

虽然RNA与DNA在化学结构上差异很小, 但RNA具有显著的结构和功能多样性. 所有生命大分子中, 只有RNA既可以起基因信息的作用, 也可以起酶的催化作用, 所以RNA在生命进化过程中可能是第一个有生命的分子, 其在生命演化中起着关键作用. 科学家提出了“RNA世界(RNA World)”的假设——即在生命进化某一阶段有机体的遗传信息都贮存在RNA中, 所有的生化反应全由RNA催化. 随着RNA干扰(RNAi)、microRNA和piRNA的发现, 提示RNA不仅具有酶的催化性质, 在细胞发育、基因表达和基因调控等生命过程中也起着非常重要的作用, 一个崭新的现代“RNA世界”已经来临.

核糖体(Ribosome)是一个由核糖体RNA(rRNA)和核糖体蛋白组成的复合体. 核糖体由大小两个亚基组成(E. Coli: 50S和30S), 其功能是将基因翻译成蛋白质, 又被称为蛋白质加工厂. 在翻译的每一步, rRNA与mRNA或tRNA都发生相互作用, rRNA在蛋白质合成中对肽基转移反应(peptidyl transferase reac-

tion)起着非常重要的作用. 用体外进化和体外筛选(in vitro evolution and in vitro selection)技术获得的核酶(Ribozyme)也能像核糖体一样催化肽基转移反应. 核糖体的高分辨率晶体结构提示, rRNA具有肽基转移酶的活性, 即核糖体是一个核酶. 但是关于它的催化机制还不是很清楚, 这也是目前核糖体研究的热点之一.

1 核酶与肽的合成

1982年, Kruger[1]和Guerrier-Takada等人[2]发现了具催化活性的RNA又叫核酶(Ribozyme), 因此与Altman一起荣获了1989年的诺贝尔化学奖. 这一革命性的发现对生物学和酶学的研究及生命的进化产生了深远的影响, 具有重大科学意义. 这一类新的生物催化剂吸引了科学界的极大关注, 有力证明了在生命进化中关于“RNA世界”的假设. 最近几年发现的RNAi, microRNA和piRNA等小RNA的功能, 为“RNA世界”假设提供了进一步的证据. 如果“RNA世

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界”成立, RNA必须能够催化RNA复制(replication)和肽合成(peptide synthesis), 才有可能从“RNA世界”进化到现代“DNA/RNA/蛋白”世界. 研究已经证明RNA能够催化肽的合成[3](图 1). 而现代核糖体——1个含有50多种蛋白和5000多个碱基核苷酸的庞大的结构复杂的分子, 也可能是一个曾经能催化肽键形成的RNA分子的进化产物.

目前为止, 天然核酶的酶活性种类主要有核苷酸转移作用、磷酸二酯键水解作用、磷酸转移反应催化作用、脱磷酸作用、限制性内切酶作用和肽基转移作用. 通过体外进化和体外筛选技术, 获得的核酶能够催化很多化学和生化反应[4~6], 例如本文涉及的 RNA酰基化反应[5~7]、酰胺化反应[8,9]和肽基转移反应[3,10~12]. 1997年, 首次获得的核酶像核糖体一样能够催化肽键的形成, 核酶包含一个与对应的核糖体23S rRNA肽基转移酶活性中心(G2447-G2454)相似的核糖核酸区域(G25-A29)(图2)

[10]

了前期的设想, 即在核糖体中的rRNA具有肽基转移酶的催化作用.

. 这种结构的相

图1 核糖体与核酶的催化肽基转移反应的相似性

似性提示了功能上的相似. 该类核酶的发现更证实

图2 核糖体23S rRNA的肽基转移反应中心与核酶的二级结构相似性

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核糖体的翻译过程要求至少3步连续的生化反应: (ⅰ) 氨基酸活化作用: 形成氨酰基-腺苷酸(aa-AMP); (ⅱ) aminoacyl-tRNA 的合成: 形成3′(2′) 终端氨基酸酯; (ⅲ) 肽键的合成. 在非核糖体(non- ribosome)多肽生物合成过程中, 也要求至少3步连续反应: (ⅰ) 氨基酸adenylation: 形成aa-AMP; (ⅱ) holo-PCP (肽载体蛋白质): aminoacylation 形成硫酯; (ⅲ) 肽键的合成. 氨酰基-腺苷酸(aa-AMP)是蛋白质生物合成过程中关键的共同中间体, 被认为是肽合成过程中的最后祖先. 在编码肽合成(coded peptide synthesis)中, 专一的氨基酸连接到相应的tRNA形成3′(2′)-氨酰基-tRNA, 作为蛋白质生物合成的底物, tRNA为氨基酸提供了核酸“标记”. 在编码肽合成出现之前, 肽是怎么被合成的? 什么生物分子是肽合成的催化剂? 认为非编码肽合成(uncoded peptide synthesis)可能是编码肽合成进化的先辈, 并且非编码肽合成由RNA催化. 氨酰基-腺苷酸(aa-AMP)也许是非编码肽合成的RNA底物. Illangasekare等人[7]用氨酰基-腺苷酸作为筛选底物分离得到自我氨酰化核酶(self-aminoacylation ribozyme). RNA可以连续地催化氨酰化形成RNA氨酰酯(RNA-O-Phe), 并且生成

肽酰基-RNA(Phe-Phe-RNA)[13]. 用氨酰基-腺苷酸作为反应底物, 分离得到了一组新的核酶(TR158), 其可以高效率地催化二肽反应(图3), 并且可用几乎任何氨基酸作为其反应底物催化合成二肽[14]. 这些研究结果很大地扩展了核酶催化功能的通用性, 支持了核糖核酸分子可能是第一个生物催化剂的假说, 有力地证明了生命进化中“RNA世界”的假设.

2 核糖体RNA(rRNA)

传统的观念认为酶的本质是蛋白质, 即只有蛋

白质才有催化功能, 一直以来人们自然地认为核糖体中具有催化作用的是蛋白质组分, 而rRNA主要起支架作用. 后来越来越多的实验证据表明, rRNA在蛋白质合成过程中可能发挥重要作用, 特别是自Cech和Altman发现RNA具有催化功能后, 人们普遍接受了rRNA可能是一个肽基转移酶的理论. 其主要理由是: (ⅰ) 至今人们还不能把多肽链的形成即肽基转移酶的活性归于某个特定的核糖体蛋白, 因为任何一种核糖体蛋白的缺失都不会使核糖体功能完全丧失, 即还没有发现某一种核糖体蛋白或核糖体蛋白的混合物具有肽基转移酶的活性[15]; (ⅱ) 许多抗

图3 TR158肽基转移核酶的二级结构

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蛋白质合成抑制剂的细菌突变株, 其核糖体突变部位似乎仅涉及rRNA的突变[16]. 不仅如此, 目前所知的所有核糖体功能反应都与rRNA有关, 而核糖体蛋白可能只是在核糖体装配过程中对rRNA的折叠和功能构象的形成起重要作用[17~19]; (ⅲ) rRNA的结构比核糖体蛋白结构在进化过程中更具保守性[20]; (ⅳ) 用体外进化和体外筛选技术得到的核酶能够高效催化肽键的形成, 非常惊奇的是它的二级结构与核糖体的rRNA肽基转移反应中心很相似(图2)[3,9,10].

自从1999年3个研究小组[21~23]发表了核糖体的晶体结构以来, 对核糖体晶体结构的研究有了突飞猛进的发展. 2000年, 通过核糖体的高分辨率晶体结构, 在位于大亚基的肽基转移反应中心周围没有发现任何蛋白, 只有rRNA(23S rRNA)(图4(A)), 离肽基转移反应中心最近的是L3蛋白, 距离为18.4Å, 说明蛋白不可能涉及肽基转移反应[24,25]. 这项研究对rRNA在蛋白质合成过程中起主要催化作用的理论提供了强有力的证据. 从晶体结构图中, 可以推论出在大亚基单位的RNA完成重要的肽基转移反应, 核糖体是一个核酶(图5). 因此, 科学家认为rRNA具有催化功能, 蛋白质不直接参与肽键的形成, 而是只作为结构单位, 帮助rRNA正确折叠.

的X射线晶体学研究需要大量的氨酰基(肽基)- tRNAs. 化学合成是一个非常有效的制备氨酰基 (肽基)-tRNAs的方法. O-氨酰基(肽基)与tRNA形成的2′(3′)酯键相当不稳定, 这给化学合成带来很大困难, tRNA的氨酰基化(aminoacylation)成了氨酰基(肽基)- tRNAs合成的关键步骤. Hecht[29] 成功地解决了这个问题, 即就是用缺少3′端pCpA的tRNA[tRNA(-CA)]与2′(3′)-O-氨酰基-pCpA或衍生物在T4RNA连接酶催化下生成氨酰基-tRNAs. 从而只需要化学合成2′(3′)-O-氨酰基-pCpA, 而可以通过T7 RNA聚合酶或化学合成来大量制备tRNA(-CA). 但是由于此合成方法产量低、反应步骤长及产生消旋产品等弊端, 不能被广泛推广应用. 1991年, Robertson等人[30]报道, 氨基酸乙氰甲酯(aa-OCH2CN)与未保护的pdCpA反应是一个制备氨酰基-pdCpA的有效方法. 这个氨基酰化方法产率高, 而且不产生消旋产物. 但是只能适用于在C75上缺少一个2′-OH的pdCpA氨基酰化, 因为这个CA基团位于核糖体活性中心, 一个微小的变化都会影响核糖体肽基转移反应. 随后报道[31]用四氢呋喃(THF)保护基团作为永久保护C75胞苷上的2′-OH形成O-2′-THF-pCpA. 在O-2′-THF-pCpA氨基酸酰化后, THF保护基团在纯化过程中脱去. 利用这种方法可以非常有效地合成2′(3′)-氨酰基-pCpA, 它与tRNA(-CA)通过T4 RNA连接酶反应生成氨酰基- tRNA(图6). 这种方法提供了一种非常有潜力的核糖体底物制备方法.

肽基转移酶活性的多数分析方法用“片段反应”(fragment reaction)方法即嘌呤霉素(puromycin)作为肽基受体(acceptor), 寡聚核苷-3′(2′)-Ｏ-fMet作为肽基供体(donor)[32]或poly (Phe) 合成反应[33]. 利用高压纸上电泳或测定乙酸乙酯提取液的放射量进行检测肽基转移酶活性. 这些分析方法的主要缺点是不能直接地观察肽键形成、敏感性低及要求加入30%酒精等. 只有开发高敏感性的肽基转移酶活性的分析方法, 才能更好地、更准确地研究核糖体的肽基转移反应机理. 前几年, 有pCpCpA-2′-脱氧-嘌呤霉素(pCpCpdA-Pmm)作为肽基转移受体, 但是它在A76缺少一个2′-OH及嘌呤霉素, 与天然的A76碱基不一样. 众所周知, 所有的tRNA核苷酸3′-末端的序列全是pCpCpA(universally conserved), pCpCpA应该

3 O-氨酰基(肽基)-tRNA及其衍生物的合

成

在过去的50多年里, 对于核糖体的结构、成分及其在蛋白质合成中所起的作用已做了相当深入的研究. 特别是近10年, 对核糖体的晶体结构研究有了里程碑式的进展. 这些核糖体的晶体结构对研究核糖体的功能、反应机理和抗生素药物的设计起了极大地推动作用. 然而对于蛋白质合成中的最关键的一步——肽键形成的机制却仍然不是很清楚[26~28]. 一方面是由于核糖体的复杂性及特殊性, 同时越来越多的实验证据显示核糖体的肽基转移反应机制与传统观念的酶有所不同; 另一方面, 受核糖体的肽基转移反应底物所限, O-氨酰基-tRNA(aminoacyl-tRNA) 或O-肽基-tRNA(peptidyl-tRNA)的不稳定性及用酶方法制备, 只能提供非常有限的量; 同时, 缺乏一个高灵敏度的核糖体肽基转移反应的检测方法, 其很大程度上限制了核糖体肽基转移反应的研究. 核糖体

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是核糖体识别tRNA反应底物中最重要的一部分. 实验证实[20]pCpCpA-O-Phe 和pCpApCpCpA-O-Phe结合到核糖体的A位点和P位点具有相似的亲和性, 表明tRNA核苷酸中超越pCpCpA的其余核苷序列充当一个不很重要的角色结合到A位点和P位点, 核糖体大亚基的晶体结构证明了这一点. 那么pCpCpA-氨酰基或-肽基将是有用的核糖体肽基转移反应底物.

因为氨基酸与pCpCpA形成的氨基酰酯(pCpCpA- O-aa)很不稳定, 通过酰胺共价键联接苯丙氨酸与pCpCpA-2′-NH2, 形成的pCpCpA-NH- Phe作为肽基的受体. 当它与tRNA-O-氨酰基(或肽基, 如pCpCpA- O-Met-Biotin)供体反应生成pCpCpA-NH- Phe-Met- Biotin的稳定产物时(图7), 可用任何分析手段检测, 从而可以高灵敏度地检测肽基转移酶活性. 例如,

图4 核糖体肽基转移反应中心晶体结构图[25]

(A) rRNA肽基转移反应中心: 紫色表示肽基转移反应中心, 红色金属线表示RNA, 其他颜色条带表示蛋白质; (B) 离肽基转移反应中心最近的蛋白质: 紫色线表示多肽(polypeptide), 紫色小点表示肽基转移反应中心

图5 大亚基核糖体RNA催化的肽基转移反应

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当用磷-32标记5′-末端得到32pCpCpA-NH- Phe为肽基的受体, 可用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)来非常敏感地检测肽基转移产物. 实验显示这个反应底物, 在70S 核糖体和50S 大亚基单位的肽基转移反应中显示高度活性(图8)[34]. 结合核糖体的晶体结构, 利用这些缩微的肽基转移反应底物可有效地研究核糖体的肽基转移酶反应.

4 核糖体肽基转移酶的反应机理

先前科学家们认为核糖体的高分辨率晶体结构可以解开核糖体的催化机理, 然而这还远远不够, 还需要生化学家们在这个基础上进一步研究揭开肽基转移酶的反应机理. 晶体结构和其他生化及基因研究表明, 23S rRNA是核糖体大亚基内的唯一能催化肽键形成的组分. 从最初的核糖体大亚基-反应中间

图6 2′(3′)-O-氨酰基-tRNA 半合成方法

图7 用缩微的肽基转移反应底物进行的核糖体肽基转移反应

图8 PAGE胶分析缩微的肽基转移反应底物的肽基转移反应活性

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体复合物的X-射线图显示, A2451 (E. Coli编号) 的N3 与pCpCpdA-p-Puro磷酰胺的磷原子上的非桥联接的氧原子最接近. 建议将腺嘌呤A2451碱基上的N3作为一般酸碱催化剂[34,35]. 随后的研究对腺嘌呤A2451核苷酸能起如此重要的催化作用产生了疑问. Polacek[27]和Thompson等人[28]报道, 核糖体23S rRNA的A2451突变成G, U, C后, 核糖体同样具有肽基转移酶活性. 后来研究显示了A2451的2′-OH基团在肽基转移酶反应中充当重要角色[36]. 另一方面, 从其晶体结构可知, tRNA-氨酰基(A位点)和tRNA-肽基(P位点)中的CCA末端序列位于肽基转移酶中心, CCA与23S rRNA肽基转移酶中心的核苷通过非常专一的相互作用, 形成高度紧密的酶-底物复合体. 当A位点底物的氨酰基上的氨基进攻P位点底物的肽基羰基上的碳, 形成一个新的肽键. 从其晶体结构显示A2451的N3和2′-OH基团及P位点tRNA终端的腺苷(A76)的2′-OH紧邻新形成的肽键(图9)[37,38].

虽然已证实肽基转移反应中心部分的rRNA核苷起着重要的催化作用, 但是其作用机制还不是很清楚. 有关核糖体催化反应机制目前有几种假设[39,40], 如(ⅰ) 熵驱使反应: 当tRNA的肽基和氨酰基-CCA末端进入活性中心的适当安置, 反应就自动发生, 不需要任何催化; (ⅱ) 质子穿梭机理: P-位A76的2′-羟基作为一般酸碱或其他基团作为一般酸碱, 起质子穿梭作用; (ⅲ) 通过稳定氧阴离子过渡态: 当A位点底物氨基酸的α-氨基亲核进攻P位点A76的酰基形成一个氧阴离子中间体, 通过与带正离子的金属离子或其他基团作用, 降低过渡态的能量而稳定氧阴离子过渡态. 虽然核糖体催化反应机理至今还不是很清楚, 但是P位点tRNA的A76中2′-OH起着重要作用已经明确[41,42]. 通过A和P位点底物的CCA序列和亲核α-氨基基团与位于活性中心的23S rRNA碱基的相互作用, 该A和P位点底物正好排列在活性中心. 认为最有利的催化途径是经P位点tRNA的A76的2′-OH发生质子穿梭, 形成6员环过渡态(图10(A)), 反应不涉及核糖体RNA基团的化学催化[41].

但是最新报道[43]在P位点肽基-A76上缺失 2′-OH并不致使肽基转移酶失活, 而肽基转移仍然能够以一个合理的速率发生. 此研究表明, 从氨酰基- tRNA的α-氨基基团到肽酰基-tRNA的3′-OH的质子

图9 被叠加的结构显示P位点A76的2′-OH 和A2486

的2′-OH介入催化肽键形成

A位点(Puromycin, 灰色)和P位点 (Phe, 黄色)部分. 23S rRNA 的A2486(蓝色)是最接近底物的核苷酸. 在A位点的氨基基团(红色小点), P位点A76的2′-OH基团(红色小点), 苯丙氨酸羰基(红色小点)和2′-OH基团(红色小点) 之间潜在的相互作用由波折线标记

图10 肽键形成的质子穿梭机制

(A) 经由P位点tRNA A76的2′-OH质子穿梭机制;

(B) 水分子质子穿梭机制

穿梭, 对肽键形成不涉及肽基-tRNA的A76上2′- 羟基基团. 它可能是位于参与反应的tRNA附近的 23S rRNA基团作为一亲核试剂的质子穿梭, 但是核糖体RNA中这一位点仍有待确定. 最近, 本研究组实验结果显示, 50S 大亚基单位核糖体体系中, 当pCpCpA-NH-Phe作为核糖体A位点的底物, 2′-de-oxy-AMP-Met-Biotin作为核糖体P位点的底物, 仍然具有肽基转移活性(未发表资料). 以上实验结果证明, 在核糖体肽基转移反应中, P位点上A76的2′-羟基基团虽然很重要但并不是必须的, 所以质疑P位点A76

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点A76上的2′-羟基起质子穿梭作用的可能性. 本研究组推测有一个其他基团(水分子)可能起着质子穿梭作用(图10(B)).

核糖体不仅在生物功能上显示重要作用, 也是极具吸引力的抗生素药物靶标; 因为原核的70S核糖体与真核的80S核糖体之间存在显著的不同, 许多抗生素都是以直接抑制细菌细胞内蛋白质合成而对人

体副作用最小为目的而设计的. 长期以来, 细菌核糖体被公认为是一种有价值的抗生素药物靶标, 而且抗生素抗药性主要来源于rRNA的突变. 对rRNA的肽基转移反应机制的深入研究, 将帮助设计新的更有效的抗生素药物. 所以, 为了生物防御, 解决全球性的抗生素抗药性问题, 迫切需要开发新型抗生素药物.

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