中国男科学杂志２００９年第２３卷第１期１９
大鼠前列腺平滑肌细胞的培养及其电压依赖性
钙通道的表达术
葛魏巍
梁朝朝”
叶元平
张贤生
郝宗耀
周
骏
安徽医科大学第一附属医院泌尿外科（合肥
２３００２２）
摘要目的探讨电压依赖型Ｔ．型及Ｌ．型钙通道哑基在ＳＤ大鼠前列腺平滑肌细胞（ＳＰＳＭＣｓ）中的表
达。方法
分离、培养和纯化大鼠前列腺平滑肌细胞，并利用免疫细胞化学的方法检测ａ－平滑肌肌动蛋ｎ（ａ—
ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅ
ａｃｔｉｎ。ａ．ＳＭＡ）进行细胞鉴定；采用ＲＴ．ＰＣＲ技术观察大鼠前列腺平滑肌细胞中钙离子通道不同
亚基ａｌＣ、ａ１Ｄ、ａｌＧ、ａｌＨｍＲＮＡ的表达。结果
培养的细胞多呈长梭形，ａ．ＳＭＡ免疫细胞化学染色为阳
性，经传代纯化，纯度近１００％。ＲＴ．ＰＣＲ结果显示，可见Ｌ型钙通道ａ１Ｃ、ａｌＤ及Ｔ型钙通道ａ１Ｇ的表达，未见ａ１Ｈ的表达。结论贴块法培养前列腺平滑肌细胞方法简便经济，可获得高纯度、状态良好的纬ｊ胞，电压依赖型Ｌ．型钙通与Ｔ．型钙通道存在于原代培养的ＳＰＳＭＣｓ中，它们的变化可能改变前列腺平滑肌的收缩活性。
关键词
前列腺；
肌细胞，平滑肌；
钙通道；大鼠
中图分类号
Ｒ３３５．５：
Ｒ３２９．２５
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｖｏｌｔａｇｅ—ｏｐｅｒａｔｅｄｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌｓｉｎ
ｒａｔ
ｐｒｏｓｔａｔｉｃ
ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｓ
Ｇｅ
Ｗｅｉｗｅｉ，Ｌｉａｎｇ
Ｃｈａｏｚｈａｏ，ＹｅＹｕａｎｐｉｎｇ，ＺｈａｎｇＸｉａｎｓｈｅｎｇ，ＨａＤＺｏｎｇｙａｏ，Ｚｈｏｕｊａｎ
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ｏｆ
Ｕｒｏｌｏｇｙ，Ｆｉｒｓｔ
Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ
Ｈｏｓｐｉｔａｌ
ｏｆＡｎｈｕｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ
２３００２２，Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
０ｂｊｅｅｔｉｖｅＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍＲＮＡｏｆＬ・－ｔｙｐｅｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌａｎｄＴ—・ｔｙｐｅｃａｌｃｉｕｍ
ｃｈａｎｎｅｌｉｎｃｕｌｔｕｒｅｄＳＰＳＭＣｓａｎｄｉｔ’Ｓｒｏｌｅｉｎｐｒｏｓｔａｔｅｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
ＳＰＳＭＣｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄ，ｃｕｌｔｕｒｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄ．
ＲＴ—ＰＣＲｗａｓｕｓｅｄ
ｔｏ
ｄｅｔｅｃｔｔｈｅｍＲＮＡ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｌｅ，ａｌＤ，ａｌＧ，ａｌＨｉｎＳＰＳＭＣｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｌＣ。
ａｉＤ，ａｌＧｗｅｒｅｆｏｕｎｄｉｎＳＰＳＭＣｓ，ｂｕｔｎｏ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｌＨｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｉｎ
ＳＰＳＭＣｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ
Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓ
ｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｉｎｖｏｌｔａｇｅ・・ｄｅｐｅｎｄｅｄＬ—－ｔｙｐｅａｎｄＴ—・ｔｙｐｅｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌｓａｎｄｔｈｅｉｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｍｉｇｈｔａｆｆｅｃｔｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｉｔｙｏｆ
ＳＰＳＭＣｓａｎｄｆｕｒｔｈｅｒｃａｕｓｅｄｐｒｏｓｔａｔｅｄｉｓｅａｓｅｓｓｕｃｈ
ａｓ
ｐｒｏｓｔａｔｉｔｉｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ
ｐｒｏｓｔａｔｅ；
ｍｙｏｃｙｔｅｓ，ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅ；
ｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌｓ；
ｒａｔｓ
前列腺是雄性动物的主要副性腺，不同的动物ｃａｌｃｉｕｍ
ｃｈａｎｎｅｌｓ，ＶＤＣＣ）参与调节尿道和膀胱
其前列腺的形态亦各有不同，ＳＤ大鼠足目前研究调节平滑肌的收缩，ＶＤＣＣ的改变可能会引起膀胱前列腺疾病的主要动物之一，其前列腺背外侧叶与和尿道平滑肌收缩活性的改变从而引起排尿症状如人类前列腺有许多类似。前列腺导管…由一层厚的膀胱过激综合症。为了探讨ＶＤＣＣ与前列腺疾病的平滑肌细胞覆盖至尿道黏膜层，射精时前列腺平滑关系，本研究应用ＲＴ．ＰＣＲ技术对所培养的ＳＤ大肌的收缩使得射精时前列腺液进入前列腺尿道，前鼠前列腺平滑肌细胞（ＳＤ
ｒａｔ
ｐｒｏｓｔａｔｅ
ｓｍｏｏｔｈ
列腺平滑肌亦参与膀胱尿液的排出。研究表明：Ｌ．ｍｕｓｃｌｅ
ｃｅｌｌｓ．ＳＰＳＭＣｓ）Ｌ．型及Ｔ．型钙通道的亚基
型和Ｔ一型电压依赖钙通道”。‘（ｖｏｌｔａｇｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ｍＲＮＡ进行鉴定。
‘基金项目：国家自然科学荩金资助项目（３０６７２１０６）“通讯作者．Ｅ．ｍａｉｌ：ｉｉａｎｇ＿ｃｈａｏｚｈａｏ＠１６３．ｃｏｉｎ
万
方数据
２０
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｄｒｏｌｏｇｙＶｏｉ．２３Ｎｏ．１２００９
材料与方法
一、动物
清洁级雄性ＳＤ大鼠，３４月龄成年大鼠２０只，
由安徽省动物实验中心提供。
二、主要试剂与仪器
ＤＭＥＭ（高糖）培养基（ＧＩＢＣＯ），胎牛血清（杭州四季青）青霉素、链霉素（华北制药股份有限公司），左旋多聚赖氨酸（ＳＩＧＭＡ）ａ－ＳＭＡ单克隆抗体（北京中杉金桥）Ｔ
ｒ
ｉ
ＺＯ
１（美国
ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司），ＤＡＢ试剂盒（北京中杉金桥），即用型ＳＰ９００１免疫组化试剂盒（美国ＺＹＭＥＤ，北京中杉金桥分装），逆转录试剂盒（美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司），ＰＣＲ试剂及ＰＣＲ引物（大连ＴａＫａＲａ公司），ＰＣＲ仪（美国ＢｉＯｍｅｔｒＯ公司），
三、前列腺平滑肌细胞原代和传代培养１．将ＳＤ大鼠１００％二氧化碳吸入处夕Ｅ，用酒精消毒后，无菌条件下迅速取出前列腺背外侧叶，置入含１００Ｕ／ｍｌ青霉素的Ｈａｎｋｓ液中，转入超净台，除去前列腺的血管及被膜组织，用眼科剪将前列腺组织剪成１１１１１１１３的小组织块，贴于２５ｍｌ培养瓶底面，等距排列，加入含２０％胎牛衄清的ＤＭＥＭ培养基２ｍｌ，将培养瓶底面向上，不使培养渡接触组织块。于３７℃、５％ＣＯ：孵箱中绝对静置约３ｈ，使组织块接近干涸，轻轻翻转培养瓶，使组织液刚好没过组织块表面，半开放式绝对静置培养３ｄ后将培养液添加至５ｍｌ，至第６天全换液，此后每３天换液一次。待组织块外缘细胞逐渐汇合达８０％以上，即可进行传代。
２．在前列腺平滑肌培养过程中，不免混杂有其他细胞，主要是成纤维细胞，尚有少量上皮细胞需要纯化去除。（１）自然纯化：利用平滑肌细胞的增殖优势，抑制其他细胞特别足上皮细胞的生长。随着传代次数的增加，平滑肌细胞纯度会逐渐增高，以此达到去除其它细胞的纯化目的。（２）差速贴壁法成纤维细胞贴壁过程快，贴壁时问大约为１０～３０ｍｉｎ，而平滑肌细胞贴壁时问一般在１．４ｈ以上。可利用成纤维细胞比平滑肌细胞贴壁较快的特点来纯化细胞。
四、前列腺平滑肌细胞鉴定
１．细胞形态学鉴定：应用倒置相差显微镜观察，平滑肌细胞未汇合之前多呈梭形或多边形，内
有ｌ砣个细胞核，可向细胞密度低的方向伸出一至数
个足突。细胞汇合后部分区域细胞束状排列，呈典型“谷峰”状。
２．免疫细胞化学鉴定：细胞接种子６孔培养板
万
方数据内，板内放置处理过的盖玻片待生长至单层后，作ａ．ａｃｔｉｎ免疫化学染色检测平滑肌肌动蛋白抗体的表达。主要步骤：细胞以４％多聚甲醛固定３０ｍｉｎ；蒸馏水洗玻片３ｍｉｎ×３次，滴加３％Ｈ２０２室温静置
１０ｒａｉｎ：０．０ｌｍｏｌ／Ｌ
ＰＢＳ液洗３ｍｉｎ×３次：滴加正
常山羊血清封闭液，室温２０分钟，不洗；滴加ａ．ＳＭＡ单克隆抗体，４℃湿盒过夜：０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ液洗３ｍｉｎ×３次；滴加２抗，室温静置２０ｍｉｎ：０．ＯｌｍｏｌＦＬＰＢＳ液洗３ｍｉｎ×３次；ＤＡＢ娃色５—１０ｍｉｎ，在显微镜Ｆ掌握染色程度；苏木精复染２分钟，盐酸酒精分化，自来水冲洗；脱水，透明，封片，镜检。
五、ＲＴ．ＰＣＲ检测ＳＰＭＣｓＬ型与Ｔ型钙通道的表达
参照文献１４４１合成引物，引物序列及扩增片段见表１。阳性对照ＧＡＰＤＨ的上下游引物来自不同外显子序列，确保不发生基因组ＤＮＡ污染。
表１
Ｌ、Ｔ型钙通道和ＧＡＰＤＨ的ＰＣＲ引物序列
１．第３代ＳＰＳＭＣｓ总ＲＮＡ的提取：弃培养液，加入ｌｍｌＴｒｉｚｏｌ，室温５ｍｉｎ；吸出的Ｔｒｉｚｏｌ中加入０．２ｍｌ氯仿；４℃１２０００×ｇ离心１５ｍｉｎ；取无色水性层加入５００
ｌａ
ｌ异丙醇；４℃１２０００×ｇ离心８ｒａｉｎ：
移去上清，加入ＤＥＰＣ处理的７５％乙醇１ｍＩ冲洗；４℃８０００×ｇ离心５ｒａｉｎ；移去７５％乙醇，加入去ＲＮＡ酶的水溶解。
２．ＲＴ反应：按ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒说明书进行。３．ＰＣＲ反应：５０
ｕ
ｌ反应体系中分别加入上下
游引物，ｄＮＴＰｓ以ｃＤＮＡ为模板，在ＥｘＴａｇ酶作用下进行ＰＣＲ扩增，以ＧＡＰＤＨ作为内参照。引物序列见表１。扩增产物经１．５％琼脂糖凝胶电泳观察结果。
反应条件：Ｌ一型钙通道：变性温度９４℃３０
Ｓ，
退火温度５５℃４５Ｓ，延伸温度７２℃２ｍｉｎ，共３５个循环；Ｔ．型钙通道：变性温度９４℃４５Ｓ，退火温度６８℃ｌｍｉｎ１５
Ｓ，延伸温度７２℃２ｍｉｎ，共３５
个循环。
中国男科学杂志２００９年第２３卷第１期２１
结
果
一、ＳＰＳＭＣｓ的生长情况
组织块接种后一般２—３ｄ即有圆形小细胞爬出，３—７ｄ贴壁（图１），待细胞中心汇合需要传代一般需要８－１４ｄ。传代细胞约需３—５ｄ即长满瓶底，需再次传代。至第７代细胞传代仍存活良好。
二、前列腺平滑肌细胞鉴定
１．细胞形态学鉴定：应用倒置相筹显微镜观察，前列腺平滑肌细胞未汇合之前多呈梭形和多边形，内有ｌ一２个细胞核，可向细胞密度低的方向伸出一至数个足突，细胞汇合后部分区域细胞束状排列，呈典型“谷峰”状（图２）。
２．免疫组化检查：细胞以平滑肌肌动蛋白为抗体，经免疫细胞化学染色显示前列腺平滑肌细胞胞质呈棕黄色，纯度近ｌ００％（图３）。
三、ＲＴ．ＰＣＲ检测ＳＰＳＭＣｓＴ．型与Ｌ．型钙通
道ｍＲＮＡ的表达
ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳发现成年ＳＰＳＭＣｓ出现Ｌ一型钙通道ａｌＣ、ａｌＤ业单位ｍＲＮＡ和Ｔ．犁钙通道ａｌＧ亚单位ｍＲＮＡ的表达，而未见Ｔ一型钙通道
ａ１
Ｈ亚单位ｍＲＮＡ的表达（图４）。
万
方数据讨论
体外前列腺平滑肌的培养和细胞株的建立是研究了实验步骤，降低了实验成本。结合自然纯化法和的眼科剪处理组织块，尽量使其边缘锐利，有利于免贴壁不良；（４）由于原代培养时密度不均，组整个培养过程都要严格无菌操作。
钙离子通道种类繁多，在平滑肌细胞中主要是
细胞牛物学行为研究疾病发病ＣＬＮ及其防治手段的基础，因此掌握一种简便、高效的细胞培养技术对前列腺疾病方面的研究工作者具有重要意义。平滑肌细胞原代培养有组织贴块法和酶消化法，但平滑肌细胞较脆弱，对酶消化耐受不良，消化时间也难以掌握。本研究采用贴块法…培养前列腺平滑肌细胞，避免了酶消化法对平滑肌细胞的损伤，也大大简化差速贴擘法可获得高纯度的平滑肌细胞，具有一定推广价值。原代培养是要获得纯度高、有活力的细胞，儿点技巧总结如下：（１）分离组织过程中注意尽量剥离前列腺周围脂肪和外膜；（２）使用锋利细胞萌出：（３）培养开始时必须绝对静置３ｄ，以织块周围密度过密，而整瓶密度较低时可按１：１原瓶传代；（５）切勿暴力吹打，镜下见细胞悬液呈“落雪状”即可进行“差速贴壁”纯化ＳＰＳＭＣｓ；（６）ＶＤＣＣ根据其激活阈值的高低又可分为高电压激活钙
２２ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｄｒｏｌｏｇｙＶ０１．２３Ｎｏ．１２００９
通道（ｈｉｇｈ—ｖｏｌｔａｇｅ
ａｃｔｉｖａｔｅｄｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌｓ。ＨＶＡ）
和低电压激活钙通道（１０ｗ．ｖｏｌｔａｇｅ
ａｃｔｉｖａｔｅｄｃａｌｃｉｕｍ
ｃｈａｎｎｅｌｓ。ＬＶＡ），其中Ｌ广型钙通道是高电压激活钙通道，阈值高，激活前膜需要去极化。而低电压激活钙通道，即Ｔ一型钙通道，在接近静息电位（－７０ｍＶ）下就能激活，显著低于ＨＶＡ激活所需的电压（一１０ｍＶ）。电生理学研究在人和动物逼尿肌和尿道平滑肌中均检测到Ｌ．型钙通道及Ｔ一型钙通道的存在，Ｌ．型钙通道的开放使得钙离子大量内流，平滑肌动作电位进入快速上升相，而去极化与胞内钙离子浓度的升高促进了与Ｌ．型钙通道耦联的大电导钙激活钾离子通道１８】
（ｂｉｇ—ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅＣａ２＋＿ａｃｔｉｖａｔｅｄｋ“ｃｈａｎｎｅｌｓ．ＢＫ）
的激活，ＢＫｊ：要与细胞膜的复极化有关。因Ｔ．型钙通道的低电压激活特性，其在低电压条件下不断激活可能诱发去极化从而激活Ｌ广犁钙通道，与Ｔ．型钙通道耦联的小电导钙激活钾通道…１（ｓｍａｌｌ．ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ
Ｃａ２＋．
ａｃｔｉｖａｔｅｄ
ｋ２＋ｃｈａｎｎｅｌｓ，ＳＫ）可能参与维持膜电位的稳
定状态，冈此Ｌ．型钙通道和Ｔ一型钙通道共同参与调控平滑肌细胞的兴奋性从而调节平滑肌的收缩。
本研究发现培养的ＳＰＳＭＣｓ表达Ｌ．型钙通道的ａ１Ｃ、ａ１Ｄ亚基和Ｔ一犁钙通道ａ１Ｇ亚基的ｍＲＮＡ，而未见Ｔ一型钙通道ａｌＨ哑基ｍＲＮＡ的表达。此结果与在逼尿肌“１和尿道乎滑肌”’中ＶＤＣＣ的报道一致。Ｓｕｉｐｌ通过记录膀胱过激综合征患者和ＩＦ常组膀胱逼尿肌ＶＤＣＣ通道电流，发现Ｔ型钙通道在膀胱过激综合征患者的电流密度是增加的，而李新”…发现逼尿肌不稳模型ＳＤ大鼠Ｔ型和Ｌ犁钙通道ｍＲＮＡ的表达也是增加的，推测钙通道的变化导致平滑肌细胞兴奋性的改变，引起逼尿肌的不稳。在前列腺平滑肌细胞中钙通道的变化对前列腺会有何影响呢？慢性前列腺炎（ｃｈｒｏｎｉｃｐｒｏｓｔａｔｉｔｉｓ，ＣＰ）是泌尿外科常见疾病，好发于青壮年，病因不明。梁朝朝等””对７９例慢性前列腺炎患者、３１例正常对照组的前列腺液及尿液的Ｃａ２＋、Ｋ＋等电解质进行了测定并分组分析，结果显示治疗有效组前列腺液中的Ｃａ２＋浓度在治疗后较治疗前明显降低，推测Ｃａ２＋与ＣＰ的发病机制有一定关系。Ｗｅｓｓｅｌｍａｎｎｌｌ２１认为前列腺尿液反流（ｉｎｔｒａｐｒｏｓｔａｔｉｃ
ｕｒｉｎａｒｙ
ｒｅｆｌｕｘ。ＩＰＵＲ）可能与ＣＰ
发病有关，而前列腺导管内外压力的变化是引起ＩＰＵＲ的直接原闪。推测前列腺平滑肌ＶＤＣＣ的变化有可能引起前列腺收缩活性的改变，从而导致ＩＰＵＲ。另外，ＣＰ患者的会阴部不适及疼痛也可能与前列腺平滑肌的痉挛有关。我们以后将通过分子生物学结合电生理学的方法研究非细菌性前列腺炎动物模型和正常组之间ＶＤＣＣ的表达和电流的改变，为前列腺疾病，特别足前列腺炎的诊断与治疗提供参考。
万
方数据参考文献
ｌ
ＰｉｎｈｅｉｒｏＰＦ，ＡｌｍｅｉｄａＣＣＤ，ＳｅｇａｍＨｉＴＭ，ｅｔａ１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆ
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ｓｅｘ
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（４）：４７６－４８２
３
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ｏｆｖｏｌｔａｇｅ—ｏｐｅｒａｔｅｄＣａ２＋ｃｈａｎｎｅｌｓｉｎ
ｏｓｔｅｏｃｙｔｉｃ（ＭＬＯ－Ｙ４）ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
ＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓｅａｒｃｈ
Ｃｏｍｍｕｎ２００１；２８２：５３６．５４２
５
ＷｏｎＹＪ，Ｗｈａｎｇ
Ｋ，ＫｏｎｇＩＤ，ｅｔａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｓ
ｏｆｈｉｇｈｖｏｌｔａｇｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌｓ
ｉｎ
ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ
ａｎｄ
ｐａｒａｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃｆａｅｌｖｉｃｇａｎｇｌｉｏｎ
ｎｅｕｒｏｎｓ
ｉｎｎｅｒｖｑｔｉｎｇ
ｔｈｅｕｒｏｇｅｎｉｔａｌｓｙｓｔｅｍ．ＪＰｈａｒｍａｃｏｌＥｘｐＴｈｅｒ２００６；
３１７：１０６４．１０７ｌ６
ＤｅｌＴｏｍＲＬｅｖｉｔｓｋｙＫＬ，Ｌ６ｐｅｚ—ＢａｒｎｅｏＪ’ｅｔａ１．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
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１１
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ＸＪ，ＷａｎｇＤＢ，ｅｔａ１．Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ
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ｐｅｌｖｉｃ
ｐａｉｎ．ＷｏｒｌｄＪＵｒｏｌ２００１；１９（３）：１８０一１８５
（２００８－０７—３ｌ收稿）
中国男科学杂志２００９年第２３卷第１期１９
大鼠前列腺平滑肌细胞的培养及其电压依赖性
钙通道的表达术
葛魏巍
梁朝朝”
叶元平
张贤生
郝宗耀
周
骏
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２３００２２）
摘要目的探讨电压依赖型Ｔ．型及Ｌ．型钙通道哑基在ＳＤ大鼠前列腺平滑肌细胞（ＳＰＳＭＣｓ）中的表
达。方法
分离、培养和纯化大鼠前列腺平滑肌细胞，并利用免疫细胞化学的方法检测ａ－平滑肌肌动蛋ｎ（ａ—
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ａｃｔｉｎ。ａ．ＳＭＡ）进行细胞鉴定；采用ＲＴ．ＰＣＲ技术观察大鼠前列腺平滑肌细胞中钙离子通道不同
亚基ａｌＣ、ａ１Ｄ、ａｌＧ、ａｌＨｍＲＮＡ的表达。结果
培养的细胞多呈长梭形，ａ．ＳＭＡ免疫细胞化学染色为阳
性，经传代纯化，纯度近１００％。ＲＴ．ＰＣＲ结果显示，可见Ｌ型钙通道ａ１Ｃ、ａｌＤ及Ｔ型钙通道ａ１Ｇ的表达，未见ａ１Ｈ的表达。结论贴块法培养前列腺平滑肌细胞方法简便经济，可获得高纯度、状态良好的纬ｊ胞，电压依赖型Ｌ．型钙通与Ｔ．型钙通道存在于原代培养的ＳＰＳＭＣｓ中，它们的变化可能改变前列腺平滑肌的收缩活性。
关键词
前列腺；
肌细胞，平滑肌；
钙通道；大鼠
中图分类号
Ｒ３３５．５：
Ｒ３２９．２５
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｖｏｌｔａｇｅ—ｏｐｅｒａｔｅｄｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌｓｉｎ
ｒａｔ
ｐｒｏｓｔａｔｉｃ
ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｓ
Ｇｅ
Ｗｅｉｗｅｉ，Ｌｉａｎｇ
Ｃｈａｏｚｈａｏ，ＹｅＹｕａｎｐｉｎｇ，ＺｈａｎｇＸｉａｎｓｈｅｎｇ，ＨａＤＺｏｎｇｙａｏ，Ｚｈｏｕｊａｎ
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ｏｆ
Ｕｒｏｌｏｇｙ，Ｆｉｒｓｔ
Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ
Ｈｏｓｐｉｔａｌ
ｏｆＡｎｈｕｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ
２３００２２，Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
０ｂｊｅｅｔｉｖｅＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍＲＮＡｏｆＬ・－ｔｙｐｅｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌａｎｄＴ—・ｔｙｐｅｃａｌｃｉｕｍ
ｃｈａｎｎｅｌｉｎｃｕｌｔｕｒｅｄＳＰＳＭＣｓａｎｄｉｔ’Ｓｒｏｌｅｉｎｐｒｏｓｔａｔｅｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
ＳＰＳＭＣｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄ，ｃｕｌｔｕｒｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄ．
ＲＴ—ＰＣＲｗａｓｕｓｅｄ
ｔｏ
ｄｅｔｅｃｔｔｈｅｍＲＮＡ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｌｅ，ａｌＤ，ａｌＧ，ａｌＨｉｎＳＰＳＭＣｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｌＣ。
ａｉＤ，ａｌＧｗｅｒｅｆｏｕｎｄｉｎＳＰＳＭＣｓ，ｂｕｔｎｏ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｌＨｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｉｎ
ＳＰＳＭＣｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ
Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓ
ｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｉｎｖｏｌｔａｇｅ・・ｄｅｐｅｎｄｅｄＬ—－ｔｙｐｅａｎｄＴ—・ｔｙｐｅｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌｓａｎｄｔｈｅｉｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｍｉｇｈｔａｆｆｅｃｔｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｉｔｙｏｆ
ＳＰＳＭＣｓａｎｄｆｕｒｔｈｅｒｃａｕｓｅｄｐｒｏｓｔａｔｅｄｉｓｅａｓｅｓｓｕｃｈ
ａｓ
ｐｒｏｓｔａｔｉｔｉｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ
ｐｒｏｓｔａｔｅ；
ｍｙｏｃｙｔｅｓ，ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅ；
ｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌｓ；
ｒａｔｓ
前列腺是雄性动物的主要副性腺，不同的动物ｃａｌｃｉｕｍ
ｃｈａｎｎｅｌｓ，ＶＤＣＣ）参与调节尿道和膀胱
其前列腺的形态亦各有不同，ＳＤ大鼠足目前研究调节平滑肌的收缩，ＶＤＣＣ的改变可能会引起膀胱前列腺疾病的主要动物之一，其前列腺背外侧叶与和尿道平滑肌收缩活性的改变从而引起排尿症状如人类前列腺有许多类似。前列腺导管…由一层厚的膀胱过激综合症。为了探讨ＶＤＣＣ与前列腺疾病的平滑肌细胞覆盖至尿道黏膜层，射精时前列腺平滑关系，本研究应用ＲＴ．ＰＣＲ技术对所培养的ＳＤ大肌的收缩使得射精时前列腺液进入前列腺尿道，前鼠前列腺平滑肌细胞（ＳＤ
ｒａｔ
ｐｒｏｓｔａｔｅ
ｓｍｏｏｔｈ
列腺平滑肌亦参与膀胱尿液的排出。研究表明：Ｌ．ｍｕｓｃｌｅ
ｃｅｌｌｓ．ＳＰＳＭＣｓ）Ｌ．型及Ｔ．型钙通道的亚基
型和Ｔ一型电压依赖钙通道”。‘（ｖｏｌｔａｇｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ｍＲＮＡ进行鉴定。
‘基金项目：国家自然科学荩金资助项目（３０６７２１０６）“通讯作者．Ｅ．ｍａｉｌ：ｉｉａｎｇ＿ｃｈａｏｚｈａｏ＠１６３．ｃｏｉｎ
万
方数据
２０
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｄｒｏｌｏｇｙＶｏｉ．２３Ｎｏ．１２００９
材料与方法
一、动物
清洁级雄性ＳＤ大鼠，３４月龄成年大鼠２０只，
由安徽省动物实验中心提供。
二、主要试剂与仪器
ＤＭＥＭ（高糖）培养基（ＧＩＢＣＯ），胎牛血清（杭州四季青）青霉素、链霉素（华北制药股份有限公司），左旋多聚赖氨酸（ＳＩＧＭＡ）ａ－ＳＭＡ单克隆抗体（北京中杉金桥）Ｔ
ｒ
ｉ
ＺＯ
１（美国
ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司），ＤＡＢ试剂盒（北京中杉金桥），即用型ＳＰ９００１免疫组化试剂盒（美国ＺＹＭＥＤ，北京中杉金桥分装），逆转录试剂盒（美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司），ＰＣＲ试剂及ＰＣＲ引物（大连ＴａＫａＲａ公司），ＰＣＲ仪（美国ＢｉＯｍｅｔｒＯ公司），
三、前列腺平滑肌细胞原代和传代培养１．将ＳＤ大鼠１００％二氧化碳吸入处夕Ｅ，用酒精消毒后，无菌条件下迅速取出前列腺背外侧叶，置入含１００Ｕ／ｍｌ青霉素的Ｈａｎｋｓ液中，转入超净台，除去前列腺的血管及被膜组织，用眼科剪将前列腺组织剪成１１１１１１１３的小组织块，贴于２５ｍｌ培养瓶底面，等距排列，加入含２０％胎牛衄清的ＤＭＥＭ培养基２ｍｌ，将培养瓶底面向上，不使培养渡接触组织块。于３７℃、５％ＣＯ：孵箱中绝对静置约３ｈ，使组织块接近干涸，轻轻翻转培养瓶，使组织液刚好没过组织块表面，半开放式绝对静置培养３ｄ后将培养液添加至５ｍｌ，至第６天全换液，此后每３天换液一次。待组织块外缘细胞逐渐汇合达８０％以上，即可进行传代。
２．在前列腺平滑肌培养过程中，不免混杂有其他细胞，主要是成纤维细胞，尚有少量上皮细胞需要纯化去除。（１）自然纯化：利用平滑肌细胞的增殖优势，抑制其他细胞特别足上皮细胞的生长。随着传代次数的增加，平滑肌细胞纯度会逐渐增高，以此达到去除其它细胞的纯化目的。（２）差速贴壁法成纤维细胞贴壁过程快，贴壁时问大约为１０～３０ｍｉｎ，而平滑肌细胞贴壁时问一般在１．４ｈ以上。可利用成纤维细胞比平滑肌细胞贴壁较快的特点来纯化细胞。
四、前列腺平滑肌细胞鉴定
１．细胞形态学鉴定：应用倒置相差显微镜观察，平滑肌细胞未汇合之前多呈梭形或多边形，内
有ｌ砣个细胞核，可向细胞密度低的方向伸出一至数
个足突。细胞汇合后部分区域细胞束状排列，呈典型“谷峰”状。
２．免疫细胞化学鉴定：细胞接种子６孔培养板
万
方数据内，板内放置处理过的盖玻片待生长至单层后，作ａ．ａｃｔｉｎ免疫化学染色检测平滑肌肌动蛋白抗体的表达。主要步骤：细胞以４％多聚甲醛固定３０ｍｉｎ；蒸馏水洗玻片３ｍｉｎ×３次，滴加３％Ｈ２０２室温静置
１０ｒａｉｎ：０．０ｌｍｏｌ／Ｌ
ＰＢＳ液洗３ｍｉｎ×３次：滴加正
常山羊血清封闭液，室温２０分钟，不洗；滴加ａ．ＳＭＡ单克隆抗体，４℃湿盒过夜：０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ液洗３ｍｉｎ×３次；滴加２抗，室温静置２０ｍｉｎ：０．ＯｌｍｏｌＦＬＰＢＳ液洗３ｍｉｎ×３次；ＤＡＢ娃色５—１０ｍｉｎ，在显微镜Ｆ掌握染色程度；苏木精复染２分钟，盐酸酒精分化，自来水冲洗；脱水，透明，封片，镜检。
五、ＲＴ．ＰＣＲ检测ＳＰＭＣｓＬ型与Ｔ型钙通道的表达
参照文献１４４１合成引物，引物序列及扩增片段见表１。阳性对照ＧＡＰＤＨ的上下游引物来自不同外显子序列，确保不发生基因组ＤＮＡ污染。
表１
Ｌ、Ｔ型钙通道和ＧＡＰＤＨ的ＰＣＲ引物序列
１．第３代ＳＰＳＭＣｓ总ＲＮＡ的提取：弃培养液，加入ｌｍｌＴｒｉｚｏｌ，室温５ｍｉｎ；吸出的Ｔｒｉｚｏｌ中加入０．２ｍｌ氯仿；４℃１２０００×ｇ离心１５ｍｉｎ；取无色水性层加入５００
ｌａ
ｌ异丙醇；４℃１２０００×ｇ离心８ｒａｉｎ：
移去上清，加入ＤＥＰＣ处理的７５％乙醇１ｍＩ冲洗；４℃８０００×ｇ离心５ｒａｉｎ；移去７５％乙醇，加入去ＲＮＡ酶的水溶解。
２．ＲＴ反应：按ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒说明书进行。３．ＰＣＲ反应：５０
ｕ
ｌ反应体系中分别加入上下
游引物，ｄＮＴＰｓ以ｃＤＮＡ为模板，在ＥｘＴａｇ酶作用下进行ＰＣＲ扩增，以ＧＡＰＤＨ作为内参照。引物序列见表１。扩增产物经１．５％琼脂糖凝胶电泳观察结果。
反应条件：Ｌ一型钙通道：变性温度９４℃３０
Ｓ，
退火温度５５℃４５Ｓ，延伸温度７２℃２ｍｉｎ，共３５个循环；Ｔ．型钙通道：变性温度９４℃４５Ｓ，退火温度６８℃ｌｍｉｎ１５
Ｓ，延伸温度７２℃２ｍｉｎ，共３５
个循环。
中国男科学杂志２００９年第２３卷第１期２１
结
果
一、ＳＰＳＭＣｓ的生长情况
组织块接种后一般２—３ｄ即有圆形小细胞爬出，３—７ｄ贴壁（图１），待细胞中心汇合需要传代一般需要８－１４ｄ。传代细胞约需３—５ｄ即长满瓶底，需再次传代。至第７代细胞传代仍存活良好。
二、前列腺平滑肌细胞鉴定
１．细胞形态学鉴定：应用倒置相筹显微镜观察，前列腺平滑肌细胞未汇合之前多呈梭形和多边形，内有ｌ一２个细胞核，可向细胞密度低的方向伸出一至数个足突，细胞汇合后部分区域细胞束状排列，呈典型“谷峰”状（图２）。
２．免疫组化检查：细胞以平滑肌肌动蛋白为抗体，经免疫细胞化学染色显示前列腺平滑肌细胞胞质呈棕黄色，纯度近ｌ００％（图３）。
三、ＲＴ．ＰＣＲ检测ＳＰＳＭＣｓＴ．型与Ｌ．型钙通
道ｍＲＮＡ的表达
ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳发现成年ＳＰＳＭＣｓ出现Ｌ一型钙通道ａｌＣ、ａｌＤ业单位ｍＲＮＡ和Ｔ．犁钙通道ａｌＧ亚单位ｍＲＮＡ的表达，而未见Ｔ一型钙通道
ａ１
Ｈ亚单位ｍＲＮＡ的表达（图４）。
万
方数据讨论
体外前列腺平滑肌的培养和细胞株的建立是研究了实验步骤，降低了实验成本。结合自然纯化法和的眼科剪处理组织块，尽量使其边缘锐利，有利于免贴壁不良；（４）由于原代培养时密度不均，组整个培养过程都要严格无菌操作。
钙离子通道种类繁多，在平滑肌细胞中主要是
细胞牛物学行为研究疾病发病ＣＬＮ及其防治手段的基础，因此掌握一种简便、高效的细胞培养技术对前列腺疾病方面的研究工作者具有重要意义。平滑肌细胞原代培养有组织贴块法和酶消化法，但平滑肌细胞较脆弱，对酶消化耐受不良，消化时间也难以掌握。本研究采用贴块法…培养前列腺平滑肌细胞，避免了酶消化法对平滑肌细胞的损伤，也大大简化差速贴擘法可获得高纯度的平滑肌细胞，具有一定推广价值。原代培养是要获得纯度高、有活力的细胞，儿点技巧总结如下：（１）分离组织过程中注意尽量剥离前列腺周围脂肪和外膜；（２）使用锋利细胞萌出：（３）培养开始时必须绝对静置３ｄ，以织块周围密度过密，而整瓶密度较低时可按１：１原瓶传代；（５）切勿暴力吹打，镜下见细胞悬液呈“落雪状”即可进行“差速贴壁”纯化ＳＰＳＭＣｓ；（６）ＶＤＣＣ根据其激活阈值的高低又可分为高电压激活钙
２２ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｄｒｏｌｏｇｙＶ０１．２３Ｎｏ．１２００９
通道（ｈｉｇｈ—ｖｏｌｔａｇｅ
ａｃｔｉｖａｔｅｄｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌｓ。ＨＶＡ）
和低电压激活钙通道（１０ｗ．ｖｏｌｔａｇｅ
ａｃｔｉｖａｔｅｄｃａｌｃｉｕｍ
ｃｈａｎｎｅｌｓ。ＬＶＡ），其中Ｌ广型钙通道是高电压激活钙通道，阈值高，激活前膜需要去极化。而低电压激活钙通道，即Ｔ一型钙通道，在接近静息电位（－７０ｍＶ）下就能激活，显著低于ＨＶＡ激活所需的电压（一１０ｍＶ）。电生理学研究在人和动物逼尿肌和尿道平滑肌中均检测到Ｌ．型钙通道及Ｔ一型钙通道的存在，Ｌ．型钙通道的开放使得钙离子大量内流，平滑肌动作电位进入快速上升相，而去极化与胞内钙离子浓度的升高促进了与Ｌ．型钙通道耦联的大电导钙激活钾离子通道１８】
（ｂｉｇ—ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅＣａ２＋＿ａｃｔｉｖａｔｅｄｋ“ｃｈａｎｎｅｌｓ．ＢＫ）
的激活，ＢＫｊ：要与细胞膜的复极化有关。因Ｔ．型钙通道的低电压激活特性，其在低电压条件下不断激活可能诱发去极化从而激活Ｌ广犁钙通道，与Ｔ．型钙通道耦联的小电导钙激活钾通道…１（ｓｍａｌｌ．ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ
Ｃａ２＋．
ａｃｔｉｖａｔｅｄ
ｋ２＋ｃｈａｎｎｅｌｓ，ＳＫ）可能参与维持膜电位的稳
定状态，冈此Ｌ．型钙通道和Ｔ一型钙通道共同参与调控平滑肌细胞的兴奋性从而调节平滑肌的收缩。
本研究发现培养的ＳＰＳＭＣｓ表达Ｌ．型钙通道的ａ１Ｃ、ａ１Ｄ亚基和Ｔ一犁钙通道ａ１Ｇ亚基的ｍＲＮＡ，而未见Ｔ一型钙通道ａｌＨ哑基ｍＲＮＡ的表达。此结果与在逼尿肌“１和尿道乎滑肌”’中ＶＤＣＣ的报道一致。Ｓｕｉｐｌ通过记录膀胱过激综合征患者和ＩＦ常组膀胱逼尿肌ＶＤＣＣ通道电流，发现Ｔ型钙通道在膀胱过激综合征患者的电流密度是增加的，而李新”…发现逼尿肌不稳模型ＳＤ大鼠Ｔ型和Ｌ犁钙通道ｍＲＮＡ的表达也是增加的，推测钙通道的变化导致平滑肌细胞兴奋性的改变，引起逼尿肌的不稳。在前列腺平滑肌细胞中钙通道的变化对前列腺会有何影响呢？慢性前列腺炎（ｃｈｒｏｎｉｃｐｒｏｓｔａｔｉｔｉｓ，ＣＰ）是泌尿外科常见疾病，好发于青壮年，病因不明。梁朝朝等””对７９例慢性前列腺炎患者、３１例正常对照组的前列腺液及尿液的Ｃａ２＋、Ｋ＋等电解质进行了测定并分组分析，结果显示治疗有效组前列腺液中的Ｃａ２＋浓度在治疗后较治疗前明显降低，推测Ｃａ２＋与ＣＰ的发病机制有一定关系。Ｗｅｓｓｅｌｍａｎｎｌｌ２１认为前列腺尿液反流（ｉｎｔｒａｐｒｏｓｔａｔｉｃ
ｕｒｉｎａｒｙ
ｒｅｆｌｕｘ。ＩＰＵＲ）可能与ＣＰ
发病有关，而前列腺导管内外压力的变化是引起ＩＰＵＲ的直接原闪。推测前列腺平滑肌ＶＤＣＣ的变化有可能引起前列腺收缩活性的改变，从而导致ＩＰＵＲ。另外，ＣＰ患者的会阴部不适及疼痛也可能与前列腺平滑肌的痉挛有关。我们以后将通过分子生物学结合电生理学的方法研究非细菌性前列腺炎动物模型和正常组之间ＶＤＣＣ的表达和电流的改变，为前列腺疾病，特别足前列腺炎的诊断与治疗提供参考。
万
方数据参考文献
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ｉｎ
ｉｓｏｌａｔｅｄ
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ＸＪ，ＷａｎｇＤＢ，ｅｔａ１．Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ
ｏｆ
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Ｗｅｓｓｅｌｍａｎｎ
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ｐｅｌｖｉｃ
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