实验九 高效液相色谱法同时测定叶绿素和类胡萝卜素 学时：4
一、实验目的
1、了解高效液相色谱在叶绿体色素全分析的应用。
2、掌握生物样品的高效液相色谱实验技术。
3、初步掌握梯度洗脱实验技术。
二、实验原理
从植物提取液分离出来的叶绿素和胡萝卜素已发现有多种异构体，而且常常是同时存在的。因此对叶绿素和胡萝卜素的深入研究较为困难。高效液相色谱既能对单一组分进行定量，又能对混合物中的多组分在分离的基础上进行定量。既能用于主要成分的含量测定，又能用于微量和痕量组分的测定。高效液相色谱是一种准确度好和精密度高的分析技术。因此，尽管难以得到所有的植物色素标准品，但高效液相色谱技术仍被认为是研究叶绿素和胡萝卜素的一种最有效手段。
叶绿体色素提取液可以采用正相或反相高效液相色谱法分析，实验表明，反相高效液相色谱法更加方便。但由于色素提取液各组分的极性差别较大，等度洗脱可能使某些组分的分离不够完全。因此，对植物色素提取液的全分析应采用梯度洗脱方式以改善分离和缩短分析时间。
本实验采用高效液相色谱法可对绿色植物叶片提取液中的色素进行较全面的分离，并直接测定叶绿素a 、叶绿素b 和β-胡萝卜素的含量。
三、实验仪器与试剂
1、仪器
TSP 高压梯度HPLC 仪，3500-3200型高压梯度泵，UV-2000型双波长吸收检测器，Rheodyne 7725i六通进样阀，PC1000色谱工作站，微量进样器（100 µl），CQ - 50超声波除气装置，Hypersil BDS C18( 4.0mm×200 mm，5μm) 。
2、试剂
叶绿素a 、叶绿素b 和β-胡萝卜素纯品为Sigma 公司产品，甲醇、二氯甲烷和乙腈为液相色谱淋洗剂，实验用水为二次去离子水（娃哈哈纯净水），经玻璃系统重蒸馏。 四、实验步骤
1、色素的提取
取0.5 g左右干净的新鲜的去脉菜叶，准确称重。剪碎，置于研钵中，加0.1 g MgCO3和 5 mL 90% 丙酮，研磨至浆状，分次加入5 mL 丙酮，沥出提取液。高速离心后，移出上清液。重复提取直至植物组织无色。合并上清液，转入 50 mL 容量瓶中，以90% 丙酮定容。试液经过0.2 μm 针筒式微孔滤膜过滤器直接注入色谱仪分析。
2、流动相的配制
实验前，配制二氯甲烷-乙腈-甲醇-水（20: 10 : 65 : 5，v/v）流动相。流动相需用0.45 µm微孔膜过滤，并经超声波除气15 min后使用。
3、色谱条件试验
色谱柱为Hypersil BDS C18( 4.0mm×200 mm，5μm ），另加一20 mm C18的保护柱。流动相为二氯甲烷-乙腈-甲醇-水（20: 10 : 65 : 5，v/v），流速为1.5 mL/min，检测波长为440 nm和660 nm。进样体积为20 µL。
如仪器正常，可进标准化合物试液分析得到正确的色谱图。标准试液组分的出峰顺序依次为叶黄素、叶绿素b 、叶绿素a 和β−胡萝卜素。如分离不理想，可适当调节试验条件，使之得到良好的分离度和重现性的色谱图为止。对比讨论两个波长的色谱图。
4、工作曲线的绘制
于5个10 mL容量瓶中，分别移入0，0.20，0.40，0.60，0.80和1.00 mL 0.10 mg/L色素标准混合液，用流动相定容，然后分别进样分析。为提高各个组分的检测灵敏度，可设定一个检测波长-时间程序进行检测。在0~50 mg/L范围内，叶黄素、叶绿素b 、叶绿素a 和β−胡萝卜素的浓度应与峰面积呈现良好线性关系。计算相应的回归方程和相关系数。
5、实际样品测定
菠菜色素提取物经0.2μm 针头式过滤器直接进样分析。根据保留值定性，对照工作曲线计算各组分含量（注1）。
五、注意事项
1、在所有的提取过程中，应尽可能防止色素发生分解、氧化。操作过程中均应在避免高温、强光照射、高湿度、低pH 值条件下迅速完成。
2、色素提取液可能含有不溶物（如植物组织），必须除去，否则将缩短柱寿命。实验过程采用保护柱和针头过滤器保护色谱柱。
3、开启仪器应按操作规程，观察仪器参数是否在设定范围内。待仪器稳定后，方可进样分析。
4、每完成一种试液分析，应用丙酮等溶剂将进样注射针彻底洗干净。否则会引起样品残留，影响下一个样品分析。
5、实验结束，应按规定清洗仪器，方能关机。
六、思考题
1、在HPLC 中，采用双波长检测有什么好处？如何确定色谱峰的纯度？
2、为什么要进行梯度洗脱？在梯度洗脱过程中要注意哪些问题？
3、对生物样品进行高效液相色谱分析，应对进样溶液做那些预处理？
4、如何确定待测组成的色谱峰及含量？
5、对比同一份植物叶片试液的三种分析结果，简述导数分光光度法、同步荧光法和高效液相色谱法的特点。
实验九 高效液相色谱法同时测定叶绿素和类胡萝卜素 学时：4
一、实验目的
1、了解高效液相色谱在叶绿体色素全分析的应用。
2、掌握生物样品的高效液相色谱实验技术。
3、初步掌握梯度洗脱实验技术。
二、实验原理
从植物提取液分离出来的叶绿素和胡萝卜素已发现有多种异构体，而且常常是同时存在的。因此对叶绿素和胡萝卜素的深入研究较为困难。高效液相色谱既能对单一组分进行定量，又能对混合物中的多组分在分离的基础上进行定量。既能用于主要成分的含量测定，又能用于微量和痕量组分的测定。高效液相色谱是一种准确度好和精密度高的分析技术。因此，尽管难以得到所有的植物色素标准品，但高效液相色谱技术仍被认为是研究叶绿素和胡萝卜素的一种最有效手段。
叶绿体色素提取液可以采用正相或反相高效液相色谱法分析，实验表明，反相高效液相色谱法更加方便。但由于色素提取液各组分的极性差别较大，等度洗脱可能使某些组分的分离不够完全。因此，对植物色素提取液的全分析应采用梯度洗脱方式以改善分离和缩短分析时间。
本实验采用高效液相色谱法可对绿色植物叶片提取液中的色素进行较全面的分离，并直接测定叶绿素a 、叶绿素b 和β-胡萝卜素的含量。
三、实验仪器与试剂
1、仪器
TSP 高压梯度HPLC 仪，3500-3200型高压梯度泵，UV-2000型双波长吸收检测器，Rheodyne 7725i六通进样阀，PC1000色谱工作站，微量进样器（100 µl），CQ - 50超声波除气装置，Hypersil BDS C18( 4.0mm×200 mm，5μm) 。
2、试剂
叶绿素a 、叶绿素b 和β-胡萝卜素纯品为Sigma 公司产品，甲醇、二氯甲烷和乙腈为液相色谱淋洗剂，实验用水为二次去离子水（娃哈哈纯净水），经玻璃系统重蒸馏。 四、实验步骤
1、色素的提取
取0.5 g左右干净的新鲜的去脉菜叶，准确称重。剪碎，置于研钵中，加0.1 g MgCO3和 5 mL 90% 丙酮，研磨至浆状，分次加入5 mL 丙酮，沥出提取液。高速离心后，移出上清液。重复提取直至植物组织无色。合并上清液，转入 50 mL 容量瓶中，以90% 丙酮定容。试液经过0.2 μm 针筒式微孔滤膜过滤器直接注入色谱仪分析。
2、流动相的配制
实验前，配制二氯甲烷-乙腈-甲醇-水（20: 10 : 65 : 5，v/v）流动相。流动相需用0.45 µm微孔膜过滤，并经超声波除气15 min后使用。
3、色谱条件试验
色谱柱为Hypersil BDS C18( 4.0mm×200 mm，5μm ），另加一20 mm C18的保护柱。流动相为二氯甲烷-乙腈-甲醇-水（20: 10 : 65 : 5，v/v），流速为1.5 mL/min，检测波长为440 nm和660 nm。进样体积为20 µL。
如仪器正常，可进标准化合物试液分析得到正确的色谱图。标准试液组分的出峰顺序依次为叶黄素、叶绿素b 、叶绿素a 和β−胡萝卜素。如分离不理想，可适当调节试验条件，使之得到良好的分离度和重现性的色谱图为止。对比讨论两个波长的色谱图。
4、工作曲线的绘制
于5个10 mL容量瓶中，分别移入0，0.20，0.40，0.60，0.80和1.00 mL 0.10 mg/L色素标准混合液，用流动相定容，然后分别进样分析。为提高各个组分的检测灵敏度，可设定一个检测波长-时间程序进行检测。在0~50 mg/L范围内，叶黄素、叶绿素b 、叶绿素a 和β−胡萝卜素的浓度应与峰面积呈现良好线性关系。计算相应的回归方程和相关系数。
5、实际样品测定
菠菜色素提取物经0.2μm 针头式过滤器直接进样分析。根据保留值定性，对照工作曲线计算各组分含量（注1）。
五、注意事项
1、在所有的提取过程中，应尽可能防止色素发生分解、氧化。操作过程中均应在避免高温、强光照射、高湿度、低pH 值条件下迅速完成。
2、色素提取液可能含有不溶物（如植物组织），必须除去，否则将缩短柱寿命。实验过程采用保护柱和针头过滤器保护色谱柱。
3、开启仪器应按操作规程，观察仪器参数是否在设定范围内。待仪器稳定后，方可进样分析。
4、每完成一种试液分析，应用丙酮等溶剂将进样注射针彻底洗干净。否则会引起样品残留，影响下一个样品分析。
5、实验结束，应按规定清洗仪器，方能关机。
六、思考题
1、在HPLC 中，采用双波长检测有什么好处？如何确定色谱峰的纯度？
2、为什么要进行梯度洗脱？在梯度洗脱过程中要注意哪些问题？
3、对生物样品进行高效液相色谱分析，应对进样溶液做那些预处理？
4、如何确定待测组成的色谱峰及含量？
5、对比同一份植物叶片试液的三种分析结果，简述导数分光光度法、同步荧光法和高效液相色谱法的特点。