染色体G显带操作规程

染色体G 显带操作规程

1. 目的:规范细胞遗传(外周血)诊断的操作过程,以保证结果的准确、可靠。

2. 应用范围:外周血细胞遗传标准实验操作及核型分析。

3. 职责:

3.1文件编写:实验室技术员。

3.2文件审核:科室负责人。

3.3文件审批:实验室主任。

3.4执行:细胞遗传室的所有工作人员。

4. 内容:

4.1实验原理:

4.1.1.淋巴细胞的体外培养

4.1.1.1.外周血(脐带血)中的淋巴细胞几乎都是处在G 0期或G 1期,一般情况下是不分裂的。当在培养基中加入植物血凝素(phytohemagglutinin ,PHA )时,这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞,并开始进行有丝分裂。

4.1.1.2.离体培养的人体淋巴细胞的有丝分裂周期分为四个时期:DNA 合成前期(G 1期),约10~24h ,为RNA 和细胞质的合成;DNA 合成期(S 期)约为7h ,在G 1期的基础上,完成DNA 的合成;DNA 合成后期(G 2期)约为4~6h ,为后期RNA 和细胞质的合成,活跃的RNA 和微管蛋白等合成;细胞分裂期(M 期)约为

1.5h ,又分为分裂前期、中期、后期和末期。

4.1.1.3.培养基分为天然培养基和人工培养基两种;实验室常用的外周血淋巴细胞培养基为二者的混合培养基,主要由RPMI1640和牛血清混合而成。另外培养液中加有肝素钠用于防止血液的凝固,平衡盐溶液维持培养液的渗透压和pH ,双抗(链霉素和青霉素)用于抑制细菌的生长等。

4.1.2.纺锤体的抑止

4.1.2.1.在细胞分裂时,随着纺锤体的形成,染色体紧靠在一起,很难进行分析。因此,破坏纺锤体,使染色体依然呈游离状态,不再粘附至细胞内任何结合力上,在随后制作标本时一旦受到压力,染色体就很容易铺展开来。细胞分裂中纺锤体是由微管组成的。微管由微管蛋白组成,微管蛋白分α微管蛋白和β微管蛋白两种,α微管蛋白和β微管蛋白彼此间具有很强的亲和力,常呈二聚体形式存在。其中β微管蛋白肽链中第201位的半胱氨酸为秋水仙素与之结合的部位,秋水仙素与之结合后会引起微管解聚。故秋水仙素具有干扰微管装配,破坏纺锤体形成和终止细胞分裂的作用。但是这一作用不影响染色体的复制和着丝粒的分裂,因此它可使分裂的细胞停留在中期,获得大量分裂相,以供分析之用。

4.1.2.2.秋水仙素(colchicum )是一种生物碱,因最初从百合科植物秋水仙(Colchicum autumnale)中取出来,故名。分子式C 22H 25O 6N ,纯秋水仙素呈黄色针状结晶,熔点157℃,易溶于水、乙醇和氯仿,难溶于热水、乙醚等。味苦,有毒。秋水仙素能抑制有丝分裂,破坏纺锤体,使染色体停滞在分裂中期。这种由秋水仙素引起的不正常分裂,称为秋水仙素有丝分裂(C-mitosis )。在这样的有丝分裂中,染色体虽然纵裂,但细胞不分裂,不能形成两个子细胞,因而染色体加倍。秋水仙素是一种三环结构化合物,第2和第3个环均是7元环。它是甲基醚的类似物,包含4个甲氧基,1个乙酰化的初级氨基以及3个非苯型双键。秋水仙素分子的第一个环上由三个甲氧基,这是作用活性不可缺少的反应基团;第二个环内的氨基被酯化,从而可增加其活性;第三个环的水合基团被甲基取代。正因为如此,秋水仙素不仅易溶于水,而且即便所用的浓度极低,其反应活性仍很高。

4.1.3.低渗

4.1.3.1.细胞经过秋水仙素处理后,尽管染色体已经比较适合观察了,但仍还不能满足要求,因为人类细胞的染色体数目多,形状小,最大的染色体约为7~8微米,加之主要的观察与分析均在油镜下进行,这就要求标本中的染色体彼此散开,并且尽可能处于同一平面上,这些均有赖于低渗处理。覆盖在染色体上的核仁物质大大地阻碍着染色体的分散,低渗液的渗透作用不仅可使粘附于染色体的核仁物质散开,清楚地显示每一个扭曲的染色体,而且还可以使细胞膨胀,染色体铺展。

4.1.3.2.低渗溶液是指渗透压和离子强度均低的溶液。可以是水,低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾(0.65mol /L )、氯化钾(0.075mol /L )、稀释的平衡盐溶液或培养基。处理的时间一般为20~40min ,处理时的温度为23~37℃。早期研究中多用柠檬酸钠或柠檬酸钾作为低渗液,也有些学者使用稀释的人血清。自从1965年后,人们改用0.075mol /L 的KCl 作为低渗液,它可以使染色体的轮廓清楚,可染色性增强,染色时间缩短。在相差显微镜下观察,KCl 低渗处理标本的效果比其他低渗液更好,也适用于显微分光光度分析,当用显带染色时充分显示带型的特点。

4.1.4.固定

4.1.4.1.固定是将组织细胞或其成分选择性地固定于某一特定阶段的过程,其目的是在杀死细胞的同时避免所研究成分受到破坏。就细胞遗传学研究而言,固定的目的是在于提高染色体结构的可见性和显示染色体形态的细节,例如显示常染色质区和异染色质区,初级缢痕和次级缢痕等。

4.1.4.1.1.经秋水仙素处理后的细胞虽可用各种不同的固定液(金属固定液或非金属固定液)予以固定,但一定要在固定之前把秋水仙素从组织细胞上冲洗掉,否则,沉积在细胞表面的秋水仙素会影响染色体的形态,还会阻碍固定液穿透性。为此,在低渗处理后,应尽早加入固定液进行预固定。固定剂可迅速地穿透细胞,并将细胞瞬间杀死,使正在分裂的细胞立即阻留在各自特定的细胞周期时相上,否则原有的M 期细胞的核分裂会继续下去,染色体松解为染色质,导致研究无法进行。另外,预固定可使细胞都处于相同

的固定微环境中,这样固定收获的细胞不会凝结在一起。

4.1.4.1.2.为使染色体结构不受破坏,提高染色体的可见性及染色体的嗜碱性,就需要是染色质物质沉淀。在活体条件下,细胞内不同成分的折射系数之间相差较小,在显微镜下不能分辨出明显的染色体结构;随着核蛋白的凝结和沉淀,染色体的折射系数将会发生很大的变化,从而使它们在细胞内成为明显的小体。因此迄今所用的固定剂都具有交联蛋白的特性,都能使染色质沉淀。常用的染色体固定剂往往是数种化学物的混合物,其中至少有一种化学物必须具备这一特性。

4.1.4.1.3.随着细胞的死亡而出现的另一些变化(特别是蛋白质的自溶作用),往往会破坏染色体的原来结构。在正常情况下,细胞内的酶参与蛋白质的合成,而当细胞死亡时,由于介质变为酸性,这些酶便在相反方向起作用,即使是复合蛋白质裂解为简单的氨基酸也是如此。因为多肽是染色体的主要成分之一,所以,这种变性效应最终引起染色体结构的破坏。因此,作为一种固定剂也应能防止蛋白质的自溶作用。此外,在细胞致死的同时,细菌的活动猖獗致使细胞内成分的分解。因此一种好的固定剂当既能起到防腐作用,又能阻止这种分解作用。

4.1.4.1.4.理想的固定剂还应能有助于达到优良的染色效果,即能增强染色体的嗜碱性。显而易见,没有哪一种化学物能同时具备以上这些条件,因而通常是将数种可以共存的液体混合起来,使之成为染色体研究中真正有效的固定剂。尽管如此,哪怕是最佳的固定剂,仍难免有不足之处。首先细胞被杀死后发生的一些变化很难予以避免;其次,可能会抽提出一些弥散成分,最后,即便是操作十分谨慎,仍难以保持酶活性不变。此外,有一些化学物还会导致细胞的皱缩。

4.1.4.2.用作固定剂的化合物又可分为非金属的和金属的两大类。前者如乙醇、甲醇、醋酸、甲醛、丙酸、苦味酸和氯仿等;后者如铬酸、锇酸、氯化铂、氯化汞、硝酸铀和醋酸镧等。其中有几种化合物还可作为蒸汽固定剂(Vapour fixative),也即在接触水或其它溶剂之前使可溶性物质先转变为不溶性物质,这样就可以在原位制作标本。另外,按照正在细胞内沉淀蛋白质的特性不同,又可把固定剂分成沉淀性和非沉淀性两种。沉淀性固定剂如铬酸、氯化汞和乙醇等,非沉淀性固定剂如四氧化锇、重铬酸钾等。

4.1.4.2.1.醋酸是一种理想的染色体的固定剂,它能使核酸沉淀,使组蛋白溶解,但却不能固定细胞质蛋白。在染色体结构的研究中,醋酸的主要用途是阻止染色体收缩,使染色体的结构免于破坏。经醋酸固定的物质还能抵消乙醇的硬化作用。它可使染色体结构保持完整,且多半不致破坏核蛋白。这种固定剂的一个缺点是会导致染色体片段的过分膨胀,因此如果要研究染色体的详细结构,必须把它与乙醇或类似的化合物一道使用,后者能使组织收缩和硬化。醋酸作为固定液中的一种成分具有以下优点:①可以与迄今所用的任何一种固定剂同时使用;②浓度可以很低或很高;③具有很强的穿透性能。此外,醋酸还是苯胺类染料的一种优良溶剂。因此它是染料和固定液混合物中必需的一种成分,例如醋酸-洋红、醋酸-奥辛和醋酸-间苯二酚蓝等

4.1.4.2.2.甲醇是焦木酸的一种成分,从木材分解蒸馏制得,广泛地用于动物染色体的固定。它可以使蛋白质沉淀,还具有脱水性,可使蛋白质出现不可逆转的变性,使组织硬化,但其不能有效地固定染色体,易被氧化剂氧化成甲酸,故不能与氧化剂共存。甲酸是一种无色有毒的液体且可以任何比例与水混合。

4.1.4.2.3.乙醇的有效浓度与甲醇一样。它和甲醇一样可以使蛋白质沉淀,还具有脱水性。可使蛋白质出现不可逆转的变性,使组织硬化。但是在有氧化剂存在时乙醇会很快被氧化为乙醛,并进而变成醋酸。它最重要的优点是能够迅速地穿透人组织。因此,乙醇也被广泛地用作染色体固定剂的一种成分。乙醇不能与许多金属固定剂(铬酸或四氧化锇)相混用,否则会被氧化。此外乙醇不能有效地固定染色质,原则上也不能与醋酸、甲醛或氯仿混合使用。但是如果要对染色体的酶进行研究时,可以用80%冷乙醇固定1h 或更多时间;如用于单层培养物,往往以纯乙醇或95%的乙醇固定1~15min ,因为酶的反应基团一般是不受乙醇破坏的。

4.1.4.2.4.1886年Carnoy 首先用醋酸、乙醇混合作为固定剂,故名为卡诺固定液。其特点是穿透快,且很利于染色体结构的研究。目前常用的卡诺固定液是由1份冰醋酸和3份甲醇混合而成的。所有的动植物和人类染色体的固定都可以用卡诺固定液,固定时间为15min 至24h ,温度为室温或稍冷。随着醋酸比例的增高,固定液膨胀的效能加大,有利于染色体的铺展,因此必要时可以改变酸和醇的比例,例如改成1:2或1:4等,但是如果过度膨胀则会导致细胞破碎,反而不利于分析。卡诺固定液中缺乏有助于染色体嗜碱性的金属成分,因此经这种方式固定的组织不能被许多碱性染料的水溶液染上色,除非使用一些特殊的媒染剂如铬酸。

4.1.5.制片

4.1.5.1.固定完成后就进入制片阶段。早期多采用涂片法、挤压法,后来很快被气干法取代,现今气干法在哺乳类和人类细胞遗传学中广泛应用。

4.1.5.2.涂片法(smear ):细胞是在固定之前就铺展到载玻片上的,而且无需什么处理便可使细胞分散开,整个操作迅速,很适于精细观察。

4.1.5.3.挤压法(squashing ):需要在固定或染色之后给以特殊的处理,然后放上盖玻片加压,如此方能从结实的细胞团块得到散开的细胞。但标本会临时性和逐步性变质,且操作不是很方便。

4.1.5.4.气干法(air drying):主要用于那些容易做成细胞悬液的组织,例如骨髓、外周血淋巴细胞、腹水和生殖上皮细胞等。所制片的染色体铺展较好,且处于同一焦平面上,操作较为简单,标本上的细胞密度较高,便于观察与分析。

4.1.6.染色

4.1.6.1.染色体的结构和行为只能在显微镜下进行研究。鉴于休止期的细胞核和分裂中的染色体折光指数差别甚小,未染色的标本在普通显微镜下很难予以观察,所以需要相差显微镜观察。但是在相差显微镜

下也不能完全显示染色体结构的细节,因此即便是在现在,染色的标本比未染色的标本在有效性和广泛性上仍占有很大的优势,虽然染色的标本也有其局限性。大多数的酸性染料是钾盐或钠盐,而碱性染料大多数是氯化物或硫酸盐。为了使染色体染色,应用碱性染料,因为染色质是强酸性的。酸性染料可以使碱性的细胞质着色。“嗜碱性”和“嗜酸性”这两个术语就是指对碱性或酸性染料的亲和力而言的。所以说染色体是嗜碱性的,而细胞质是嗜酸性的。

4.1.6.2.Gustav Giemsa在探讨Romanowsky 染料中的有关因子时,发现其甲基蓝的降价产物——甲基天青与染色质着色有关,而伊红则是通过已参与有天青的染色质相结合而引起作用的。那时他为了改善染色的质量先把天青和甲基蓝等量混合,最后选用天青、伊红、甘油和甲醇的混合物。而这种染料最初是为使血片中疟原虫染色而设计的。经典的细胞遗传学家总是用醋酸奥辛、醋酸洋红、龙胆紫、苏木精和其它染料是染色体标本着色的,几乎不用Giemsa 染色;只有血液学家才用它来染色血液和骨髓标本。直到1960年Moorhead 等建立人体外周血淋巴细胞体外培养制备染色体标本的方法,很自然地想起用Giemsa 染色这些细胞标本,且取得了非常好的效果。从此以后,实际上几乎所有的人类和哺乳类细胞遗传学家都按此照办了。

4.1.6.3.Giemsa 不是一种单一的染料,而是数种染料的混合物,它们是甲基蓝及其氧化产物——天青(azure )和伊红Y 。其染色的质量随所用染料的比例不同而异。天青A 和天青B 都是噻嗪系列的成员,是甲基蓝和重铬酸钾一起氧化的产物。天青A 是一种碱性染料,分子式C 14H 14N 3SCl ,分子量为291.799。它对染色质DNA 的反应恰巧与雪夫试剂一样,实际上也是一种醛反应,所以它不仅可取代碱性复红使染色体着色,而且染色体的色泽比碱性复红染色要明亮得多。此外,用天青A 较为方便,价格也比天青B 便宜。伊红Y 本身是一种酸性染料,玫瑰红色,属于呫吨(xanthene )系列。Giemsa 染料是由不同的噻嗪染料混合物(最重要的天青B )和曙红组成。染色体的着色有赖于在原位形成噻嗪-曙红(2:1)的沉淀物。着色过程首先是两个噻嗪分子与DNA 结合,然后再与一个曙红分子结合;其次是需要有一个疏水环境,以利于染料沉淀物的累积。通过这一机理,着色的水平可达很高的密度,而对DNA 的局部浓度则是不敏感的。因此,认为G 显带是由于染色体结构的解旋而引起DNA 的细微变异的假说是站不住脚的,尽管浓度-敏感染色法支持这一假说。

4.1.6.4.染色体DNA 很易与染料结合,而且实际上是作为一种催化剂促使噻嗪-曙红沉淀物的形成,在这一过程中,DNA 的量和质都没有什么影响。在染色体上高浓度的疏水蛋白区,容易形成噻嗪-曙红沉淀物,这些区段相当于含有高比例的二硫键交联的区段。这些二硫键在一定的位置或以适当的构型保留着各种疏水的染色体蛋白,而通过一系列的显带预处理就可以除去阴性G 带区的疏水蛋白,或使它们的构型变成更为疏水的状态。上述推论似乎与已知的事实是不矛盾的,而且有证据表明,对于着色来说虽然DNA 是必需的,但与产生的染色体带型有关的却是染色体蛋白质的差异。可以预料,在G 显带中所抽提的

蛋白质是疏水性的,而且主要是抽提出阴性G 带的蛋白质。目前普遍公认的G 显带染色机制是:胰蛋白酶抽提了和DNA 上富含GC 碱基对区段相结合的蛋白质,以致降低了该区段和染料的亲和力,即呈浅带;反之,DNA 上富含AT 碱基对的区段和组蛋白结合紧密,胰酶处理时不易被抽提,故和染料有较强的亲和力,即呈深带。

4.2标本采集

4.2.1采集要求:以晨起空腹采集为佳。

4.2.2标本类型:肝素钠抗凝血。

4.2.3标本量:3ml

4.2.4储存容器:一次性无菌肝素钠抗凝管。

4.2.5标本保存:标本4℃~10℃,24小时内尽快送检。

4.2.6运送条件:于4℃~10℃环境中保存运送。

4.2.7标本拒收标准:

4.2.7.1 标本缺唯一性条形码标识;

4.2.7.2 标本量不足检测;

4.2.7.3 标本严重溶血、凝血、脂血、黄疸、污染;

4.2.7.4标本使用非肝素钠抗凝;

4.3. 试剂与仪器

4.3.1试剂:

4.3.1.1试剂组成:

1640培养基,秋水仙素,甲醇,冰醋酸,KCL ,胰蛋白酶,生理盐水,Giemsa 粉,香柏油,无水乙醇等;

4.3.1.2储存和稳定性:

4.3.1.2.1 储存:1640培养基-20℃保存,秋水仙素,胰蛋白酶2℃~8℃保存,其它常温保存即可,切莫

倒置;

4.3.1.2.2 稳定性:未开封,可稳定至标明的保质期;开封后, 2℃~8℃,可稳定1周。

4.3.1.2.3 使用方法:1640培养基,秋水仙素,生理盐水香柏油按照试剂说明书使用,甲醇,冰醋酸,

KCL, 胰蛋白酶,Giemsa 粉,无水乙醇等需配制后使用。

4.3.2 仪器:

CO 2培养箱,超净台,恒温水浴箱,水平离心机,干燥箱,显微镜,细胞遗传自动分析系统,冰箱。

4.4质控程序

4.4.1对每批新到的培养基,对每个批号的培养基,必须要做过预实验后方可使用,并做好记录;

4.4.2对每批新到的甲醇和乙酸,必须要做过预实验后方可使用,并做好记录;

4.4.3对每批新到的秋水仙素,对每个批号的秋水仙素,必须要做过预实验后方可使用,并做好记录;

4.5操作步骤:

4.5.1培养:将抽取好的外周血分别接种于两瓶培养液中(每瓶接种0.2-0.4ml 左右),摇匀,置37℃

恒温培养箱内培养72小时(温差±1℃)。

4.5.2秋水仙素处理:培养至68-70小时之间,向培养液内加入秋水仙素2—4滴,使细胞分裂停在中期,

收获分裂相。

4.5.3收获细胞

4.5.3.1将培养72小时的两瓶培养物倒入1个离心管内,以1500rpm 离心10分钟,弃上清,留下沉淀 细胞。

4.5.3.2低渗:向离心管内加入37℃预温的低渗液8ml ,用滴管反复冲打分散细胞,置37℃水浴箱中低

渗处理25-30分钟。

4.5.3.3预固定:向低渗的细胞悬液内缓慢加入固定液(甲醇和乙酸按3:1的比例混合)1-2ml ,轻轻混

匀后置室温下固定5分钟后,1500rpm 离心10分钟,弃上清,留下沉淀细胞。

4.5.3.4固定:沿管壁缓慢加入固定液8ml ,轻轻混匀后放37℃水浴箱固定,固定时间为30分钟,然后

1500rpm 离心10分钟,弃上清,加入6ml 固定液轻轻打匀后放4℃冰箱备用。

4.5.4制片

4.5.4.1以1500rpm 离心10分钟,弃上清,留下沉淀细胞,重新加固定液0.5ml (加固定液的量根据沉

淀物的量和制片后细胞的分布情况调整),混匀后滴冰片,过酒精灯干燥。

4.5.4.2烤片:将制好的标本置60℃烤箱内过夜老化或80℃两个小时。

4.5.5显带与染色:取3个50ml 立式染色缸,置37℃水浴中。染色缸Ⅰ加入生理盐水42ml ,胰酶8ml ,用tris10滴,混匀,PH 值为7.0-7.2左右,用于细胞遗传消化显带。染色缸Ⅱ内加大约50m 生理盐水,用于漂洗。染色缸Ⅲ内加入双蒸水45ml ,染色液两管,混匀,用于染片。过程为:取老化的标本片置染色缸Ⅰ中,胰酶消化显带1分8秒,迅速取出置染色缸Ⅱ中,轻轻漂洗几次,放染色缸Ⅲ中染色3—5分钟,取出,用自来水冲洗,置烤箱中将玻片烤干。(实验条件可随实验环境变化而改变)。

4.5.6镜检:先于10倍显微镜下挑选分散好、大小适中的分裂相,然后在油镜下进行计数分析。每一标本

计数30个核型,至少分析5组核型,并画出三组核型。

4.6参考值:正常男性:46,XY 正常女性:46,XX

4.7临床意义:

细胞遗传是遗传物质的载体。其结构的改变导致基因连锁群的变化,从而引起一系列临床症状,即为细胞遗传异常综合征。即使是表型正常的携带者,其后代也可能表现出临床症状。人类细胞遗传的临床检查为探明某些疾病的病因、发病机理、诊断、治疗、预防和预后等提供科学依据。它涉及遗传学、血液学、肿瘤、环境因素引起的遗传损伤等多学科领域,为提高优生优育水平提供了实验依据。

4.8注意事项

4.8.1.在采血接种培养时,注意不要加入太多的肝素钠,因为肝素钠过多可能会导致溶血和抑制淋巴细胞的转化和分裂,但肝素钠量也不应过少,以免采血时发生凝血现象或培养物出现纤维蛋白形成的膜状结构。这种膜状结构一般在培养24h 左右出现,此时可在无菌条件下将它除去,以免影响效果。血标本培养前在室温下放置不超过4h ,在4℃冰箱内放置时间不超过24h 。

4.8.2.在一般温箱内培养,必须将瓶口塞紧,以免培养液的pH 值发生较大的变化。如果培养过程中,培养液酸化较严重(培养液呈黄色时)将不利于细胞生长,此时可加入适量无菌的0.14%NaHCO3溶液调正或再加入2~3ml 培养液的办法来校正。培养箱的温度应控制在37±0.5℃,温度过高过低都将影响细胞的生长,所以在一般温箱上附装一个精确的温控仪器是较理想的。

4.8.3.细胞培养失败的可能原因

4.8.3.1.所购置的培养液不合格,如PHA 质量有问题,配液用水不合要求,pH 过高或过低等。

4.8.3.2.无菌操作不符合要求,发生细菌污染。

4.8.3.3.一次性抗凝管不合格,被细菌污染,或采血的过程不符合要求等。

4.8.3.4.所采血液是细胞免疫水平低下患者或长期接受放疗、化疗后患者的血液。

4.8.4.细胞培养成功但制片失败的原因

4.8.4.1.秋水仙素处理不当:如秋水仙素质量有问题或秋水仙素的浓度、处理时间不够或处理不合适,结果分裂相少;如果秋水仙素浓度过高或处理时间过长,则使染色体过于缩短,难以进行分析。

4.8.4.2.低渗处理不当:低渗处理时间过长时,细胞膜往往过早破裂,导致分裂细胞丢失,或染色体丢失;如果处理时间不足时,细胞膨胀不够,则染色体分散不佳,难以进行染色体计数分析。

4.8.4.3.离心速度不合适:如果从培养瓶收集细胞进行离心时的速度太低,则细胞多被丢失,如果低渗后离心速度过高,则往往使分裂细胞过早破裂,分散良好的分裂相多被丢失,以致制出的标本中分裂相少或大部分为剩余的分散不好的分裂相。

4.8.4.4.标本固定不充分:如固定液不新鲜,或甲醇、冰醋酸的质量不佳,此时,染色体形象模糊,染色体周围有胞浆背景。

4.8.4.5.玻片去油不彻底:玻片有油迹时,将使滴上的细胞悬液不能均匀分散,且将使细胞随液滴流动而丢失。

广州达安临床检验中心作业指导书 编号:GZDA-SOP-XBYC-XM001

染色体G 显带操作规程 第四版 第9页 共9页 第4次修改

4.8.4.6.玻片冷冻不够:合适的冰湿载玻片,从冰水中拿出时,玻片表面浮霜,如冷冻不

够则无此现象,此时细胞难以粘附而可能造成丢失。

染色体G 显带操作规程

1. 目的:规范细胞遗传(外周血)诊断的操作过程,以保证结果的准确、可靠。

2. 应用范围:外周血细胞遗传标准实验操作及核型分析。

3. 职责:

3.1文件编写:实验室技术员。

3.2文件审核:科室负责人。

3.3文件审批:实验室主任。

3.4执行:细胞遗传室的所有工作人员。

4. 内容:

4.1实验原理:

4.1.1.淋巴细胞的体外培养

4.1.1.1.外周血(脐带血)中的淋巴细胞几乎都是处在G 0期或G 1期,一般情况下是不分裂的。当在培养基中加入植物血凝素(phytohemagglutinin ,PHA )时,这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞,并开始进行有丝分裂。

4.1.1.2.离体培养的人体淋巴细胞的有丝分裂周期分为四个时期:DNA 合成前期(G 1期),约10~24h ,为RNA 和细胞质的合成;DNA 合成期(S 期)约为7h ,在G 1期的基础上,完成DNA 的合成;DNA 合成后期(G 2期)约为4~6h ,为后期RNA 和细胞质的合成,活跃的RNA 和微管蛋白等合成;细胞分裂期(M 期)约为

1.5h ,又分为分裂前期、中期、后期和末期。

4.1.1.3.培养基分为天然培养基和人工培养基两种;实验室常用的外周血淋巴细胞培养基为二者的混合培养基,主要由RPMI1640和牛血清混合而成。另外培养液中加有肝素钠用于防止血液的凝固,平衡盐溶液维持培养液的渗透压和pH ,双抗(链霉素和青霉素)用于抑制细菌的生长等。

4.1.2.纺锤体的抑止

4.1.2.1.在细胞分裂时,随着纺锤体的形成,染色体紧靠在一起,很难进行分析。因此,破坏纺锤体,使染色体依然呈游离状态,不再粘附至细胞内任何结合力上,在随后制作标本时一旦受到压力,染色体就很容易铺展开来。细胞分裂中纺锤体是由微管组成的。微管由微管蛋白组成,微管蛋白分α微管蛋白和β微管蛋白两种,α微管蛋白和β微管蛋白彼此间具有很强的亲和力,常呈二聚体形式存在。其中β微管蛋白肽链中第201位的半胱氨酸为秋水仙素与之结合的部位,秋水仙素与之结合后会引起微管解聚。故秋水仙素具有干扰微管装配,破坏纺锤体形成和终止细胞分裂的作用。但是这一作用不影响染色体的复制和着丝粒的分裂,因此它可使分裂的细胞停留在中期,获得大量分裂相,以供分析之用。

4.1.2.2.秋水仙素(colchicum )是一种生物碱,因最初从百合科植物秋水仙(Colchicum autumnale)中取出来,故名。分子式C 22H 25O 6N ,纯秋水仙素呈黄色针状结晶,熔点157℃,易溶于水、乙醇和氯仿,难溶于热水、乙醚等。味苦,有毒。秋水仙素能抑制有丝分裂,破坏纺锤体,使染色体停滞在分裂中期。这种由秋水仙素引起的不正常分裂,称为秋水仙素有丝分裂(C-mitosis )。在这样的有丝分裂中,染色体虽然纵裂,但细胞不分裂,不能形成两个子细胞,因而染色体加倍。秋水仙素是一种三环结构化合物,第2和第3个环均是7元环。它是甲基醚的类似物,包含4个甲氧基,1个乙酰化的初级氨基以及3个非苯型双键。秋水仙素分子的第一个环上由三个甲氧基,这是作用活性不可缺少的反应基团;第二个环内的氨基被酯化,从而可增加其活性;第三个环的水合基团被甲基取代。正因为如此,秋水仙素不仅易溶于水,而且即便所用的浓度极低,其反应活性仍很高。

4.1.3.低渗

4.1.3.1.细胞经过秋水仙素处理后,尽管染色体已经比较适合观察了,但仍还不能满足要求,因为人类细胞的染色体数目多,形状小,最大的染色体约为7~8微米,加之主要的观察与分析均在油镜下进行,这就要求标本中的染色体彼此散开,并且尽可能处于同一平面上,这些均有赖于低渗处理。覆盖在染色体上的核仁物质大大地阻碍着染色体的分散,低渗液的渗透作用不仅可使粘附于染色体的核仁物质散开,清楚地显示每一个扭曲的染色体,而且还可以使细胞膨胀,染色体铺展。

4.1.3.2.低渗溶液是指渗透压和离子强度均低的溶液。可以是水,低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾(0.65mol /L )、氯化钾(0.075mol /L )、稀释的平衡盐溶液或培养基。处理的时间一般为20~40min ,处理时的温度为23~37℃。早期研究中多用柠檬酸钠或柠檬酸钾作为低渗液,也有些学者使用稀释的人血清。自从1965年后,人们改用0.075mol /L 的KCl 作为低渗液,它可以使染色体的轮廓清楚,可染色性增强,染色时间缩短。在相差显微镜下观察,KCl 低渗处理标本的效果比其他低渗液更好,也适用于显微分光光度分析,当用显带染色时充分显示带型的特点。

4.1.4.固定

4.1.4.1.固定是将组织细胞或其成分选择性地固定于某一特定阶段的过程,其目的是在杀死细胞的同时避免所研究成分受到破坏。就细胞遗传学研究而言,固定的目的是在于提高染色体结构的可见性和显示染色体形态的细节,例如显示常染色质区和异染色质区,初级缢痕和次级缢痕等。

4.1.4.1.1.经秋水仙素处理后的细胞虽可用各种不同的固定液(金属固定液或非金属固定液)予以固定,但一定要在固定之前把秋水仙素从组织细胞上冲洗掉,否则,沉积在细胞表面的秋水仙素会影响染色体的形态,还会阻碍固定液穿透性。为此,在低渗处理后,应尽早加入固定液进行预固定。固定剂可迅速地穿透细胞,并将细胞瞬间杀死,使正在分裂的细胞立即阻留在各自特定的细胞周期时相上,否则原有的M 期细胞的核分裂会继续下去,染色体松解为染色质,导致研究无法进行。另外,预固定可使细胞都处于相同

的固定微环境中,这样固定收获的细胞不会凝结在一起。

4.1.4.1.2.为使染色体结构不受破坏,提高染色体的可见性及染色体的嗜碱性,就需要是染色质物质沉淀。在活体条件下,细胞内不同成分的折射系数之间相差较小,在显微镜下不能分辨出明显的染色体结构;随着核蛋白的凝结和沉淀,染色体的折射系数将会发生很大的变化,从而使它们在细胞内成为明显的小体。因此迄今所用的固定剂都具有交联蛋白的特性,都能使染色质沉淀。常用的染色体固定剂往往是数种化学物的混合物,其中至少有一种化学物必须具备这一特性。

4.1.4.1.3.随着细胞的死亡而出现的另一些变化(特别是蛋白质的自溶作用),往往会破坏染色体的原来结构。在正常情况下,细胞内的酶参与蛋白质的合成,而当细胞死亡时,由于介质变为酸性,这些酶便在相反方向起作用,即使是复合蛋白质裂解为简单的氨基酸也是如此。因为多肽是染色体的主要成分之一,所以,这种变性效应最终引起染色体结构的破坏。因此,作为一种固定剂也应能防止蛋白质的自溶作用。此外,在细胞致死的同时,细菌的活动猖獗致使细胞内成分的分解。因此一种好的固定剂当既能起到防腐作用,又能阻止这种分解作用。

4.1.4.1.4.理想的固定剂还应能有助于达到优良的染色效果,即能增强染色体的嗜碱性。显而易见,没有哪一种化学物能同时具备以上这些条件,因而通常是将数种可以共存的液体混合起来,使之成为染色体研究中真正有效的固定剂。尽管如此,哪怕是最佳的固定剂,仍难免有不足之处。首先细胞被杀死后发生的一些变化很难予以避免;其次,可能会抽提出一些弥散成分,最后,即便是操作十分谨慎,仍难以保持酶活性不变。此外,有一些化学物还会导致细胞的皱缩。

4.1.4.2.用作固定剂的化合物又可分为非金属的和金属的两大类。前者如乙醇、甲醇、醋酸、甲醛、丙酸、苦味酸和氯仿等;后者如铬酸、锇酸、氯化铂、氯化汞、硝酸铀和醋酸镧等。其中有几种化合物还可作为蒸汽固定剂(Vapour fixative),也即在接触水或其它溶剂之前使可溶性物质先转变为不溶性物质,这样就可以在原位制作标本。另外,按照正在细胞内沉淀蛋白质的特性不同,又可把固定剂分成沉淀性和非沉淀性两种。沉淀性固定剂如铬酸、氯化汞和乙醇等,非沉淀性固定剂如四氧化锇、重铬酸钾等。

4.1.4.2.1.醋酸是一种理想的染色体的固定剂,它能使核酸沉淀,使组蛋白溶解,但却不能固定细胞质蛋白。在染色体结构的研究中,醋酸的主要用途是阻止染色体收缩,使染色体的结构免于破坏。经醋酸固定的物质还能抵消乙醇的硬化作用。它可使染色体结构保持完整,且多半不致破坏核蛋白。这种固定剂的一个缺点是会导致染色体片段的过分膨胀,因此如果要研究染色体的详细结构,必须把它与乙醇或类似的化合物一道使用,后者能使组织收缩和硬化。醋酸作为固定液中的一种成分具有以下优点:①可以与迄今所用的任何一种固定剂同时使用;②浓度可以很低或很高;③具有很强的穿透性能。此外,醋酸还是苯胺类染料的一种优良溶剂。因此它是染料和固定液混合物中必需的一种成分,例如醋酸-洋红、醋酸-奥辛和醋酸-间苯二酚蓝等

4.1.4.2.2.甲醇是焦木酸的一种成分,从木材分解蒸馏制得,广泛地用于动物染色体的固定。它可以使蛋白质沉淀,还具有脱水性,可使蛋白质出现不可逆转的变性,使组织硬化,但其不能有效地固定染色体,易被氧化剂氧化成甲酸,故不能与氧化剂共存。甲酸是一种无色有毒的液体且可以任何比例与水混合。

4.1.4.2.3.乙醇的有效浓度与甲醇一样。它和甲醇一样可以使蛋白质沉淀,还具有脱水性。可使蛋白质出现不可逆转的变性,使组织硬化。但是在有氧化剂存在时乙醇会很快被氧化为乙醛,并进而变成醋酸。它最重要的优点是能够迅速地穿透人组织。因此,乙醇也被广泛地用作染色体固定剂的一种成分。乙醇不能与许多金属固定剂(铬酸或四氧化锇)相混用,否则会被氧化。此外乙醇不能有效地固定染色质,原则上也不能与醋酸、甲醛或氯仿混合使用。但是如果要对染色体的酶进行研究时,可以用80%冷乙醇固定1h 或更多时间;如用于单层培养物,往往以纯乙醇或95%的乙醇固定1~15min ,因为酶的反应基团一般是不受乙醇破坏的。

4.1.4.2.4.1886年Carnoy 首先用醋酸、乙醇混合作为固定剂,故名为卡诺固定液。其特点是穿透快,且很利于染色体结构的研究。目前常用的卡诺固定液是由1份冰醋酸和3份甲醇混合而成的。所有的动植物和人类染色体的固定都可以用卡诺固定液,固定时间为15min 至24h ,温度为室温或稍冷。随着醋酸比例的增高,固定液膨胀的效能加大,有利于染色体的铺展,因此必要时可以改变酸和醇的比例,例如改成1:2或1:4等,但是如果过度膨胀则会导致细胞破碎,反而不利于分析。卡诺固定液中缺乏有助于染色体嗜碱性的金属成分,因此经这种方式固定的组织不能被许多碱性染料的水溶液染上色,除非使用一些特殊的媒染剂如铬酸。

4.1.5.制片

4.1.5.1.固定完成后就进入制片阶段。早期多采用涂片法、挤压法,后来很快被气干法取代,现今气干法在哺乳类和人类细胞遗传学中广泛应用。

4.1.5.2.涂片法(smear ):细胞是在固定之前就铺展到载玻片上的,而且无需什么处理便可使细胞分散开,整个操作迅速,很适于精细观察。

4.1.5.3.挤压法(squashing ):需要在固定或染色之后给以特殊的处理,然后放上盖玻片加压,如此方能从结实的细胞团块得到散开的细胞。但标本会临时性和逐步性变质,且操作不是很方便。

4.1.5.4.气干法(air drying):主要用于那些容易做成细胞悬液的组织,例如骨髓、外周血淋巴细胞、腹水和生殖上皮细胞等。所制片的染色体铺展较好,且处于同一焦平面上,操作较为简单,标本上的细胞密度较高,便于观察与分析。

4.1.6.染色

4.1.6.1.染色体的结构和行为只能在显微镜下进行研究。鉴于休止期的细胞核和分裂中的染色体折光指数差别甚小,未染色的标本在普通显微镜下很难予以观察,所以需要相差显微镜观察。但是在相差显微镜

下也不能完全显示染色体结构的细节,因此即便是在现在,染色的标本比未染色的标本在有效性和广泛性上仍占有很大的优势,虽然染色的标本也有其局限性。大多数的酸性染料是钾盐或钠盐,而碱性染料大多数是氯化物或硫酸盐。为了使染色体染色,应用碱性染料,因为染色质是强酸性的。酸性染料可以使碱性的细胞质着色。“嗜碱性”和“嗜酸性”这两个术语就是指对碱性或酸性染料的亲和力而言的。所以说染色体是嗜碱性的,而细胞质是嗜酸性的。

4.1.6.2.Gustav Giemsa在探讨Romanowsky 染料中的有关因子时,发现其甲基蓝的降价产物——甲基天青与染色质着色有关,而伊红则是通过已参与有天青的染色质相结合而引起作用的。那时他为了改善染色的质量先把天青和甲基蓝等量混合,最后选用天青、伊红、甘油和甲醇的混合物。而这种染料最初是为使血片中疟原虫染色而设计的。经典的细胞遗传学家总是用醋酸奥辛、醋酸洋红、龙胆紫、苏木精和其它染料是染色体标本着色的,几乎不用Giemsa 染色;只有血液学家才用它来染色血液和骨髓标本。直到1960年Moorhead 等建立人体外周血淋巴细胞体外培养制备染色体标本的方法,很自然地想起用Giemsa 染色这些细胞标本,且取得了非常好的效果。从此以后,实际上几乎所有的人类和哺乳类细胞遗传学家都按此照办了。

4.1.6.3.Giemsa 不是一种单一的染料,而是数种染料的混合物,它们是甲基蓝及其氧化产物——天青(azure )和伊红Y 。其染色的质量随所用染料的比例不同而异。天青A 和天青B 都是噻嗪系列的成员,是甲基蓝和重铬酸钾一起氧化的产物。天青A 是一种碱性染料,分子式C 14H 14N 3SCl ,分子量为291.799。它对染色质DNA 的反应恰巧与雪夫试剂一样,实际上也是一种醛反应,所以它不仅可取代碱性复红使染色体着色,而且染色体的色泽比碱性复红染色要明亮得多。此外,用天青A 较为方便,价格也比天青B 便宜。伊红Y 本身是一种酸性染料,玫瑰红色,属于呫吨(xanthene )系列。Giemsa 染料是由不同的噻嗪染料混合物(最重要的天青B )和曙红组成。染色体的着色有赖于在原位形成噻嗪-曙红(2:1)的沉淀物。着色过程首先是两个噻嗪分子与DNA 结合,然后再与一个曙红分子结合;其次是需要有一个疏水环境,以利于染料沉淀物的累积。通过这一机理,着色的水平可达很高的密度,而对DNA 的局部浓度则是不敏感的。因此,认为G 显带是由于染色体结构的解旋而引起DNA 的细微变异的假说是站不住脚的,尽管浓度-敏感染色法支持这一假说。

4.1.6.4.染色体DNA 很易与染料结合,而且实际上是作为一种催化剂促使噻嗪-曙红沉淀物的形成,在这一过程中,DNA 的量和质都没有什么影响。在染色体上高浓度的疏水蛋白区,容易形成噻嗪-曙红沉淀物,这些区段相当于含有高比例的二硫键交联的区段。这些二硫键在一定的位置或以适当的构型保留着各种疏水的染色体蛋白,而通过一系列的显带预处理就可以除去阴性G 带区的疏水蛋白,或使它们的构型变成更为疏水的状态。上述推论似乎与已知的事实是不矛盾的,而且有证据表明,对于着色来说虽然DNA 是必需的,但与产生的染色体带型有关的却是染色体蛋白质的差异。可以预料,在G 显带中所抽提的

蛋白质是疏水性的,而且主要是抽提出阴性G 带的蛋白质。目前普遍公认的G 显带染色机制是:胰蛋白酶抽提了和DNA 上富含GC 碱基对区段相结合的蛋白质,以致降低了该区段和染料的亲和力,即呈浅带;反之,DNA 上富含AT 碱基对的区段和组蛋白结合紧密,胰酶处理时不易被抽提,故和染料有较强的亲和力,即呈深带。

4.2标本采集

4.2.1采集要求:以晨起空腹采集为佳。

4.2.2标本类型:肝素钠抗凝血。

4.2.3标本量:3ml

4.2.4储存容器:一次性无菌肝素钠抗凝管。

4.2.5标本保存:标本4℃~10℃,24小时内尽快送检。

4.2.6运送条件:于4℃~10℃环境中保存运送。

4.2.7标本拒收标准:

4.2.7.1 标本缺唯一性条形码标识;

4.2.7.2 标本量不足检测;

4.2.7.3 标本严重溶血、凝血、脂血、黄疸、污染;

4.2.7.4标本使用非肝素钠抗凝;

4.3. 试剂与仪器

4.3.1试剂:

4.3.1.1试剂组成:

1640培养基,秋水仙素,甲醇,冰醋酸,KCL ,胰蛋白酶,生理盐水,Giemsa 粉,香柏油,无水乙醇等;

4.3.1.2储存和稳定性:

4.3.1.2.1 储存:1640培养基-20℃保存,秋水仙素,胰蛋白酶2℃~8℃保存,其它常温保存即可,切莫

倒置;

4.3.1.2.2 稳定性:未开封,可稳定至标明的保质期;开封后, 2℃~8℃,可稳定1周。

4.3.1.2.3 使用方法:1640培养基,秋水仙素,生理盐水香柏油按照试剂说明书使用,甲醇,冰醋酸,

KCL, 胰蛋白酶,Giemsa 粉,无水乙醇等需配制后使用。

4.3.2 仪器:

CO 2培养箱,超净台,恒温水浴箱,水平离心机,干燥箱,显微镜,细胞遗传自动分析系统,冰箱。

4.4质控程序

4.4.1对每批新到的培养基,对每个批号的培养基,必须要做过预实验后方可使用,并做好记录;

4.4.2对每批新到的甲醇和乙酸,必须要做过预实验后方可使用,并做好记录;

4.4.3对每批新到的秋水仙素,对每个批号的秋水仙素,必须要做过预实验后方可使用,并做好记录;

4.5操作步骤:

4.5.1培养:将抽取好的外周血分别接种于两瓶培养液中(每瓶接种0.2-0.4ml 左右),摇匀,置37℃

恒温培养箱内培养72小时(温差±1℃)。

4.5.2秋水仙素处理:培养至68-70小时之间,向培养液内加入秋水仙素2—4滴,使细胞分裂停在中期,

收获分裂相。

4.5.3收获细胞

4.5.3.1将培养72小时的两瓶培养物倒入1个离心管内,以1500rpm 离心10分钟,弃上清,留下沉淀 细胞。

4.5.3.2低渗:向离心管内加入37℃预温的低渗液8ml ,用滴管反复冲打分散细胞,置37℃水浴箱中低

渗处理25-30分钟。

4.5.3.3预固定:向低渗的细胞悬液内缓慢加入固定液(甲醇和乙酸按3:1的比例混合)1-2ml ,轻轻混

匀后置室温下固定5分钟后,1500rpm 离心10分钟,弃上清,留下沉淀细胞。

4.5.3.4固定:沿管壁缓慢加入固定液8ml ,轻轻混匀后放37℃水浴箱固定,固定时间为30分钟,然后

1500rpm 离心10分钟,弃上清,加入6ml 固定液轻轻打匀后放4℃冰箱备用。

4.5.4制片

4.5.4.1以1500rpm 离心10分钟,弃上清,留下沉淀细胞,重新加固定液0.5ml (加固定液的量根据沉

淀物的量和制片后细胞的分布情况调整),混匀后滴冰片,过酒精灯干燥。

4.5.4.2烤片:将制好的标本置60℃烤箱内过夜老化或80℃两个小时。

4.5.5显带与染色:取3个50ml 立式染色缸,置37℃水浴中。染色缸Ⅰ加入生理盐水42ml ,胰酶8ml ,用tris10滴,混匀,PH 值为7.0-7.2左右,用于细胞遗传消化显带。染色缸Ⅱ内加大约50m 生理盐水,用于漂洗。染色缸Ⅲ内加入双蒸水45ml ,染色液两管,混匀,用于染片。过程为:取老化的标本片置染色缸Ⅰ中,胰酶消化显带1分8秒,迅速取出置染色缸Ⅱ中,轻轻漂洗几次,放染色缸Ⅲ中染色3—5分钟,取出,用自来水冲洗,置烤箱中将玻片烤干。(实验条件可随实验环境变化而改变)。

4.5.6镜检:先于10倍显微镜下挑选分散好、大小适中的分裂相,然后在油镜下进行计数分析。每一标本

计数30个核型,至少分析5组核型,并画出三组核型。

4.6参考值:正常男性:46,XY 正常女性:46,XX

4.7临床意义:

细胞遗传是遗传物质的载体。其结构的改变导致基因连锁群的变化,从而引起一系列临床症状,即为细胞遗传异常综合征。即使是表型正常的携带者,其后代也可能表现出临床症状。人类细胞遗传的临床检查为探明某些疾病的病因、发病机理、诊断、治疗、预防和预后等提供科学依据。它涉及遗传学、血液学、肿瘤、环境因素引起的遗传损伤等多学科领域,为提高优生优育水平提供了实验依据。

4.8注意事项

4.8.1.在采血接种培养时,注意不要加入太多的肝素钠,因为肝素钠过多可能会导致溶血和抑制淋巴细胞的转化和分裂,但肝素钠量也不应过少,以免采血时发生凝血现象或培养物出现纤维蛋白形成的膜状结构。这种膜状结构一般在培养24h 左右出现,此时可在无菌条件下将它除去,以免影响效果。血标本培养前在室温下放置不超过4h ,在4℃冰箱内放置时间不超过24h 。

4.8.2.在一般温箱内培养,必须将瓶口塞紧,以免培养液的pH 值发生较大的变化。如果培养过程中,培养液酸化较严重(培养液呈黄色时)将不利于细胞生长,此时可加入适量无菌的0.14%NaHCO3溶液调正或再加入2~3ml 培养液的办法来校正。培养箱的温度应控制在37±0.5℃,温度过高过低都将影响细胞的生长,所以在一般温箱上附装一个精确的温控仪器是较理想的。

4.8.3.细胞培养失败的可能原因

4.8.3.1.所购置的培养液不合格,如PHA 质量有问题,配液用水不合要求,pH 过高或过低等。

4.8.3.2.无菌操作不符合要求,发生细菌污染。

4.8.3.3.一次性抗凝管不合格,被细菌污染,或采血的过程不符合要求等。

4.8.3.4.所采血液是细胞免疫水平低下患者或长期接受放疗、化疗后患者的血液。

4.8.4.细胞培养成功但制片失败的原因

4.8.4.1.秋水仙素处理不当:如秋水仙素质量有问题或秋水仙素的浓度、处理时间不够或处理不合适,结果分裂相少;如果秋水仙素浓度过高或处理时间过长,则使染色体过于缩短,难以进行分析。

4.8.4.2.低渗处理不当:低渗处理时间过长时,细胞膜往往过早破裂,导致分裂细胞丢失,或染色体丢失;如果处理时间不足时,细胞膨胀不够,则染色体分散不佳,难以进行染色体计数分析。

4.8.4.3.离心速度不合适:如果从培养瓶收集细胞进行离心时的速度太低,则细胞多被丢失,如果低渗后离心速度过高,则往往使分裂细胞过早破裂,分散良好的分裂相多被丢失,以致制出的标本中分裂相少或大部分为剩余的分散不好的分裂相。

4.8.4.4.标本固定不充分:如固定液不新鲜,或甲醇、冰醋酸的质量不佳,此时,染色体形象模糊,染色体周围有胞浆背景。

4.8.4.5.玻片去油不彻底:玻片有油迹时,将使滴上的细胞悬液不能均匀分散,且将使细胞随液滴流动而丢失。

广州达安临床检验中心作业指导书 编号:GZDA-SOP-XBYC-XM001

染色体G 显带操作规程 第四版 第9页 共9页 第4次修改

4.8.4.6.玻片冷冻不够:合适的冰湿载玻片,从冰水中拿出时,玻片表面浮霜,如冷冻不

够则无此现象,此时细胞难以粘附而可能造成丢失。


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