㊃ ２４㊃
中国兽药杂志２０１４，４８（３）：２４ ２６／郭德祥，等㊀
苦参碱的提取纯化工艺研究
郭德祥，郭亚楠，李向阳
［收稿日期］２０１３－１２－０１㊀［文献标识码］Ａ㊀［文章编号］１００２－１２８０（２０１４）０３－００２４－０３㊀［中图分类号］Ｓ８５３．７３
（国家兽用药品工程技术研究中心，河南洛阳４７１００３）
［摘㊀ 要］㊀ 为了优化苦参碱的提取工艺，以浸膏收率㊁ 苦参碱含量为评价指标，选择用水量㊁ 提取时间及提取次数为考察因素，利用Ｌ９（３４）正交试验法优选出水煎煮法提取苦参碱的最佳工艺条件为用８倍量水提取３次，每次提取２ｈ㊂ 采用乙醇沉淀及三氯甲烷萃取相结合的方法对苦参粗提物进行纯化，浓缩药液浓度为１．０ｇ生药／ｍＬ时进行醇沉，醇沉后调节药液的ｐＨ值至９ １１用三氯甲烷萃取３次㊂ 优选出的提取工艺稳定㊁ 可行，可用于苦参碱的工业化提取㊂ ［关键词］㊀ 苦参碱；提取纯化；正交试验
ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＰｒｏｃｅｓｓｏｆＡｌｋａｌｏｉｄｓｆｒｏｍＳ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ
（ＮａｔｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒＦｏｒＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｕｏｙａｎｇ，Ｈｅｎａｎ４７１００３，Ｃｈｉｎａ）
ＧＵＯＤｅ－ｘｉａｎｇ，ＧＵＯＹａ－ｎａｎ，ＬＩＸｉａｎｇ－ｙａｎｇ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｏｏｐｔｉｍｉｚｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆａｌｋａｌｏｉｄｓｆｒｏｍＳ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ，ｔａｋｉｎｇａｌｋａｌｏｉｄｓｆｒｏｍＳ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓａｎｄｄｒｙ
ｅｘｔｒａｃｔａｓｉｎｄｅｘｅｓ，ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｗａｓｕｓｅｄｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｅｆｆｅｃｔｏｆｓｏｌｖｅｎｔｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅｓｏｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ．Ｏｐｔｉｍａｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｗａｓ：ｅｘｔｒａｃｔｅｄ３ｔｉｍｅｓｗｉｔｈ８ｔｉｍｅｓａｍｏｕｎｔｏｆａｎｄａｄｊｕｓｔｉｎｇｔｈｅｐＨｏｆｔｈｅｓｏｌｕｔｉｏｎｔｏ９ １１，ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ３ｔｉｍｅｓ．Ｔｈｉｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｗａｓｓｔａｂｌｅａｎｄｆｅａｓｉｂｌｅ，ｉｔｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｔｏｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆａｌｋａｌｏｉｄｓｆｒｏｍＳ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ．㊀ ㊀ 苦参为豆科植物苦参（ＳｏｐｈｏｒａｆｌａｖｅｓｃｅｎｓＡｉｔ．）
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｌｋａｌｏｉｄｓｆｒｏｍＳ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｔｅｓｔ
输液泵；ＵＶ２３０型检测器；ＥＣ２０００色谱工作站）；公司，美国）；Ａｂ２６５－ｓ电子分析天平（梅特勒－托利１．２㊀仪器㊀ 苦参，购自洛阳康鑫中药饮片公司，符２００５０７，由中国药品生物制品检定所提供；乙腈为多公司，瑞士）㊂
ｗａｔｅｒ，２ｈｅａｃｈｔｉｍｅ．Ｃｒｕｄｅｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｓｆｒｏｍｓｏｐｈｏｒａｗｅｒｅｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙｅｔｈａｎｏｌｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎａｎｄｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎｔｏ１．０ｇｍｅｄｉｃｉｎａｌｍａｔｅｒｉａｌｓｐｅｒｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒｂｅｆｏｒｅｅｔｈａｎｏｌｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ
的干燥根，具有清热燥湿㊁ 杀虫利尿的功效［１－２］，临床上常用于治疗猪感冒㊁ 无名高热，仔猪白痢，家兔疥癣，鸡球虫病等㊂ 现代研究表明，苦参主要的有效成分为苦参碱㊁ 氧化苦参碱等生物碱［３］，本研究采用最为方便㊁ 易于工业化生产的水煎煮法，以浸膏得率㊁ 苦参碱提取率为评价指标，通过正交试验筛选苦参提取的最佳工艺条件，为新药研究和充分利用苦参药材资源提供理论依据㊂ １㊀仪器与材料
１．１㊀仪器㊀ 依利特高效液相色谱仪（Ｐ２３０型高压
ＺＯＲＢＡＸＮＨ２色谱柱，４．６ｍｍˑ ２５０ｍｍ，５μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ
合‘ 中华人民共和国兽药典“ 二ʻ 一ʻ 年版二部苦参项下的有关规定［４］；苦参碱对照品，批号：１１０８０５－色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯㊂
２㊀方法与结果
２．１㊀含量测定方法㊀ 色谱条件与系统适用性试
作者简介：郭德祥，硕士，从事新兽药研发工作㊂ Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｕｏｄｅｘｉａｎｇ００１＠１６３．ｃｏｍ
２０１４，４８（３）：２４ ２６／郭德祥，等中国兽药杂志
表２㊀正交试验结果
序号１２３４５６７８９
㊃ ２５㊃
验：ＺＯＲＢＡＸＮＨ２柱（４．６ｍｍˑ ２５０ｍｍ，５μｍ）；以乙腈－无水乙醇－３％磷酸溶液（８０ʒ １０ʒ １０）为流动相；检测波长为２２０ｎｍ㊂理论板数按苦参碱峰计算应不低于１５００㊂
线性范围考察：精密称取苦参碱对照品２０．９ｍｇ于１００ｍＬ容量瓶中，加乙腈－无水乙醇（８０：２０）溶解㊁ 定容，制成浓度为２０９μｇ／ｍＬ的储备液，将上述储备液用乙腈－无水乙醇（８０ʒ ２０）稀释成浓度分别为１０４．５㊁５２．２㊁２６．１㊁１３．１μｇ／ｍＬ的对照品溶液，分用水量提取时间提取次数空白浸膏收率苦参碱含量Ａ／倍Ｂ／ｈＣ／次Ｄ／％／％１１１２２２３３３
１２３１２３３１２
１２３３１２２３１
１２３１２３１２３
１５．６１９．２２１．５２２．３２４．４１７．２２２．８１７．０１９．６
２．４０３．３１４．３３６．２５５．３１４．０８５．６２３．５６５．３１
别精密吸取上述５个不同浓度的对照品溶液１０μＬ，以峰面积（Ｙ）与对照品浓度（Ｘ）进行线性回归，回０．１３归方程为 ２．０９Ｙ＝μｇ４３９６．７范围内Ｘ－，线性关系良好０．８６９６，ｒ＝０．９９９９㊂㊂
表明在
对照品溶液的制备：精密称取５ｍｇ苦参碱对照
品于１００ｍＬ容量瓶中，加乙腈－无水乙醇（８０ʒ ２０）溶解定容，制成每１ｍＬ含苦参碱０．０５ｍｇ的溶液，即得㊂
供试品溶液的制备：精密称取１０ｍｇ干燥物甲醇超声溶解，并定容于１０ｍＬ容量瓶中，即得㊂
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶２．２㊀液各１０正交试验法提取苦参碱μＬ，注入液相色谱仪㊀ ，测定㊂
２．２．１㊀煮法进行提取苦参碱提取工艺条件的选择［５］，以用水量㊁ 提取时间和提取次数为㊀ 采用水煎３
个因素，设计３个水平，进行Ｌ最佳工艺条件㊂ 因素水平表见表９（３４１㊂
）正交试验，筛选表１㊀因素水平表
水平因素
用水量Ａ／倍
提取时间Ｂ／ｈ
提取次数Ｃ／次
１２６３
１０８
２．５２
１３２３
２．２．２㊀主要有效成分考察指标的确定和测定，将其作为考察指标㊀ 苦参碱为苦参的，同时结合浸膏收率优选最佳工艺ｇ，煎煮液按照，Ｌ㊂ 分别称取苦参药材９份各１００
滤过９（３４
），滤液浓缩正交表２设计的条件进行煎煮，置已恒重的蒸发皿中，合并，水浴蒸干，７０ħ 减压干燥至完全干燥后，称重并计算浸膏收率（浸膏收率％＝浸膏重量／样品重量ˑ １００％），结果见表２㊂
ＫＫ１１８．７６７１６．６００Ｋ２２１．３００２０．２３３２０．３６７１９．８６７１９．７３３３Ｒ１９．８００２０．２００２．５３３１９．４３３０．８００２２．９００６．３００２０．２６７０．５３４ＫＫ１ ３．３４７４．７５７Ｋ２ ５．２１３４．０６０３．３４７４．３４０３Ｒ ４．８３０１．８６６４．５７３４．９５７４．３３７０．６９７５．０８７１．７４０４．７１３０．３７６㊀ 在所考察的影响因素中㊀ 由表２直观分析可知，重要性依次为，以浸膏收率为评价指标时Ｃ＞Ａ＞Ｂ；以苦，参碱含量为评价指标时，在所考察的影响因素中，重要性依次为Ａ＞Ｃ＞Ｂ㊂得到最佳工艺条件Ａ以浸膏收率为指标方差分析结果表明２Ｂ１Ｃ，３㊂
以浸膏
收率作为评价指标时，Ｃ因素具有显著意义，Ａ因素和Ｂ因素均无显著意义（表３）；以苦参碱含量为指标方差分析结果表明，以苦参碱含量作为评价指标时，Ａ因素㊁Ｂ 因素和Ｃ因素均无显著意义㊂ 综合考虑环保节能因素ＢＣ８倍量水提取，确定最佳提取工艺条件为３次，每次提取２ｈ（表４）㊂
Ａ２１３，即加表３㊀以浸膏收率为指标方差分析结果
方差来源偏差平方和自由度Ｆ比Ｆ临界值显著性用水量Ａ９．７３６２７．９２２１９提取时间Ｂ１．２２９２１．０００１９提取次数Ｃ６０．２９６２４９．０６１
１９
∗
误差
１．２３
２
㊀ ㊀ Ｆ０．１０（２，２）＝９．００，Ｆ０．０５（２，２）＝１９．０，Ｆ０．０１（２，２）＝９９．０
表４㊀以苦参碱含量为指标方差分析结果
方差来源偏差平方和自由度Ｆ比Ｆ临界值显著性用水量Ａ５．８３２２７．４５８１９提取时间Ｂ０．７８２２１．０００１９提取次数Ｃ５．６３７２７．２０８
１９
误差
０．７８
２
㊀ ㊀ Ｆ０．１０（２，２）＝９．００，Ｆ０．０５（２，２）＝１９．０，Ｆ０．０１（２，２）＝９９．０
㊃ ２６㊃
中国兽药杂志２０１４，４８（３）：２４ ２６／郭德祥，等㊀
２．２．３㊀验证试验㊀ 称取苦参药材３份，按正交试验优选的最佳提取工艺进行放大验证试验，即加８倍量水提取３次，每次提取２ｈ㊂三次验证试验干膏收率（％）分别为２２．４㊁２２．０㊁２２．１，苦参总碱含量（％）分别为６．０８㊁５．９４㊁５．８７；干膏收率（％）和苦参总碱含量（％）的平均值分别为２２．２㊁５．９４㊂验证试验结果表明正交设计筛选出的最佳提取工艺条件重现性良好，说明此工艺稳定㊁ 可行㊂
２．３㊀苦参碱纯化工艺的优化㊀ 苦参提取之后，除有效成分外，还含有较多的淀粉等杂质，而这些杂量，选择萃取３次㊂
２．３．３㊀ｐＨ的考察㊀ 取经苦参醇沉并回收乙醇后的药液３份，每份取相当于生药１００ｇ，加水至１ｍＬʒ １．５ｇ生药，分别用２０％氢氧化钠溶液调ｐＨ值至９㊁１０㊁１１，用三氯甲烷各萃取３次，比较不同ｐＨ值对收膏率及苦参碱含量的影响，结果见表７㊂
表７㊀不同ｐＨ值的比较
ｐＨ９
收膏率／％
２．７苦参碱含量／％
２１．８质将影响其质量，因此需要对粗提物进行纯化㊂ 本文采用乙醇沉淀及三氯甲烷萃取相结合的方法对苦参粗提物进行纯化２．３．１２．０醇量达ｇ生药㊀ 乙醇沉淀㊂
７５％，４／ｍＬ，ħ 每份取相当于生药㊀ 取苦参提取液浓缩成冷藏，上清液回收乙醇１００ｇ，，加乙醇使含１．０㊁１．５㊁比较不同药液浓度对收膏率及苦参碱含量的影响，结果见表５㊂
表５㊀不同药液浓度对收膏率及苦参碱含量影响的比较
药液浓度／（ｇ生药㊃ｍＬ －１１．０）
收膏率苦参碱含量１．５１０．１／％２．０
８．７８．４／％
７．２
１０．２
９．２㊀ 时㊀ 从表中可以看出，当药液浓度为１．０ｇ生药／ｍＬ２．０，收膏率高率比较低ｇ生药㊂ ／ｍＬ，从苦参碱含量比较，当药液浓度为综合考虑收膏率及苦参碱含量时，苦参碱的含量较高，但是此时收，选择将药液浓缩至２．３．２㊀１．０提取液中生物碱加碱碱化三氯甲烷萃取ｇ生药㊀ ／ｍＬ利用生物碱的碱性进行醇沉㊂
，用三氯甲烷萃取，将苦参，回收三氯甲烷，即可得到纯度较高的生物碱㊂
取经苦参醇沉并回收乙醇后的药液３份，每份相当于生药２０％１００ｇ，加水至１ｍＬʒ １．５ｇ萃取氢氧化钠溶液调１㊁２㊁３次，比较不同萃取次数对收膏率及苦参ｐＨ值至１１，用三氯甲烷分别生药，用碱含量的影响，结果见表６㊂
表６㊀萃取次数的比较
萃取次数
收膏率／％
苦参碱含量／％
１２１．８１９．２３
２．３２．８
２４．８２０．６
㊀ 碱含量比较㊀ 从表中可以看出，药液萃取，萃取２次，３苦参碱的含量较高次，收膏率高，从苦参，但此时收率相对较低㊂ 综合考虑收膏率及苦参碱含
１０１１３．０２．８
２０．７１９．９
㊀ 率及苦参碱含量影响不明显㊀ 从表中可以看出，调整ｐＨ㊂ 因此值至，萃取时调节药９ １１，对收膏２．３．４㊀液的ｐＨ批验证试验值至９ １１㊂
按照筛选出的最佳纯化工艺进行放大验证试验㊀ 称取苦参粗提物３份各１㊂ ｋｇ，验
３㊀证试验结果无显著性差异讨论与小结
，说明该工艺稳定㊁ 可行㊂
苦参粗提物被２０％氢氧化钠溶液碱化后，生物碱被游离出来，易被三氯甲烷等溶剂萃取，但生物碱还能与苦参粗提物中的淀粉等杂质生成不溶或难溶沉淀，同时非碱溶性物质也析出，形成咖啡色沉淀，包埋并带走部分生物碱，造成生物碱的损失㊂ 所以采用乙醇沉淀及三氯甲烷萃取相结合的方法先除去苦参粗提物中的淀粉等杂质㊂
苦参药材用８倍量水提取３次，每次提取２ｈ，合并药液并浓缩至１．０ｇ生药／ｍＬ时进行醇沉，醇３沉后调节药液的ｐＨ值为９ １１，并用三氯甲烷萃取
苦参碱的工业化提取次㊂ 优选出的提取㊁ ㊂ 纯化工艺稳定㊁ 可行，可用于参考文献：
［１］㊀刘药杂志梅，刘雪英，２００３，，程建峰２８（９）：８０１．苦参碱的药理研究进展－８０４．［Ｊ］．中国中
［２］㊀中草药李燕，，何立人２０００，．３１（３）：２２７苦参碱类生物碱的心血管系统药理研究－２２９．［Ｊ］．［３］㊀药马方励，２００４，，程２６（５）：４２０怡．苦参碱多种制剂的药效学研究进展－４２２．［Ｊ］．中成［４］㊀二部中国兽药典委员会［Ｓ］．
．‘中华人民共和国兽药典“ 二ʻ 一ʻ 年版［５］㊀邓丽琴２００６，１７（２）：．苦参中苦参碱提取工艺研究２３３－２３４．
［Ｊ］．时珍国医国药，
（编辑：陈希）
㊃ ２４㊃
中国兽药杂志２０１４，４８（３）：２４ ２６／郭德祥，等㊀
苦参碱的提取纯化工艺研究
郭德祥，郭亚楠，李向阳
［收稿日期］２０１３－１２－０１㊀［文献标识码］Ａ㊀［文章编号］１００２－１２８０（２０１４）０３－００２４－０３㊀［中图分类号］Ｓ８５３．７３
（国家兽用药品工程技术研究中心，河南洛阳４７１００３）
［摘㊀ 要］㊀ 为了优化苦参碱的提取工艺，以浸膏收率㊁ 苦参碱含量为评价指标，选择用水量㊁ 提取时间及提取次数为考察因素，利用Ｌ９（３４）正交试验法优选出水煎煮法提取苦参碱的最佳工艺条件为用８倍量水提取３次，每次提取２ｈ㊂ 采用乙醇沉淀及三氯甲烷萃取相结合的方法对苦参粗提物进行纯化，浓缩药液浓度为１．０ｇ生药／ｍＬ时进行醇沉，醇沉后调节药液的ｐＨ值至９ １１用三氯甲烷萃取３次㊂ 优选出的提取工艺稳定㊁ 可行，可用于苦参碱的工业化提取㊂ ［关键词］㊀ 苦参碱；提取纯化；正交试验
ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＰｒｏｃｅｓｓｏｆＡｌｋａｌｏｉｄｓｆｒｏｍＳ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ
（ＮａｔｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒＦｏｒＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｕｏｙａｎｇ，Ｈｅｎａｎ４７１００３，Ｃｈｉｎａ）
ＧＵＯＤｅ－ｘｉａｎｇ，ＧＵＯＹａ－ｎａｎ，ＬＩＸｉａｎｇ－ｙａｎｇ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｏｏｐｔｉｍｉｚｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆａｌｋａｌｏｉｄｓｆｒｏｍＳ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ，ｔａｋｉｎｇａｌｋａｌｏｉｄｓｆｒｏｍＳ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓａｎｄｄｒｙ
ｅｘｔｒａｃｔａｓｉｎｄｅｘｅｓ，ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｗａｓｕｓｅｄｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｅｆｆｅｃｔｏｆｓｏｌｖｅｎｔｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅｓｏｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ．Ｏｐｔｉｍａｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｗａｓ：ｅｘｔｒａｃｔｅｄ３ｔｉｍｅｓｗｉｔｈ８ｔｉｍｅｓａｍｏｕｎｔｏｆａｎｄａｄｊｕｓｔｉｎｇｔｈｅｐＨｏｆｔｈｅｓｏｌｕｔｉｏｎｔｏ９ １１，ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ３ｔｉｍｅｓ．Ｔｈｉｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｗａｓｓｔａｂｌｅａｎｄｆｅａｓｉｂｌｅ，ｉｔｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｔｏｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆａｌｋａｌｏｉｄｓｆｒｏｍＳ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ．㊀ ㊀ 苦参为豆科植物苦参（ＳｏｐｈｏｒａｆｌａｖｅｓｃｅｎｓＡｉｔ．）
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｌｋａｌｏｉｄｓｆｒｏｍＳ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｔｅｓｔ
输液泵；ＵＶ２３０型检测器；ＥＣ２０００色谱工作站）；公司，美国）；Ａｂ２６５－ｓ电子分析天平（梅特勒－托利１．２㊀仪器㊀ 苦参，购自洛阳康鑫中药饮片公司，符２００５０７，由中国药品生物制品检定所提供；乙腈为多公司，瑞士）㊂
ｗａｔｅｒ，２ｈｅａｃｈｔｉｍｅ．Ｃｒｕｄｅｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｓｆｒｏｍｓｏｐｈｏｒａｗｅｒｅｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙｅｔｈａｎｏｌｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎａｎｄｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎｔｏ１．０ｇｍｅｄｉｃｉｎａｌｍａｔｅｒｉａｌｓｐｅｒｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒｂｅｆｏｒｅｅｔｈａｎｏｌｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ
的干燥根，具有清热燥湿㊁ 杀虫利尿的功效［１－２］，临床上常用于治疗猪感冒㊁ 无名高热，仔猪白痢，家兔疥癣，鸡球虫病等㊂ 现代研究表明，苦参主要的有效成分为苦参碱㊁ 氧化苦参碱等生物碱［３］，本研究采用最为方便㊁ 易于工业化生产的水煎煮法，以浸膏得率㊁ 苦参碱提取率为评价指标，通过正交试验筛选苦参提取的最佳工艺条件，为新药研究和充分利用苦参药材资源提供理论依据㊂ １㊀仪器与材料
１．１㊀仪器㊀ 依利特高效液相色谱仪（Ｐ２３０型高压
ＺＯＲＢＡＸＮＨ２色谱柱，４．６ｍｍˑ ２５０ｍｍ，５μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ
合‘ 中华人民共和国兽药典“ 二ʻ 一ʻ 年版二部苦参项下的有关规定［４］；苦参碱对照品，批号：１１０８０５－色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯㊂
２㊀方法与结果
２．１㊀含量测定方法㊀ 色谱条件与系统适用性试
作者简介：郭德祥，硕士，从事新兽药研发工作㊂ Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｕｏｄｅｘｉａｎｇ００１＠１６３．ｃｏｍ
２０１４，４８（３）：２４ ２６／郭德祥，等中国兽药杂志
表２㊀正交试验结果
序号１２３４５６７８９
㊃ ２５㊃
验：ＺＯＲＢＡＸＮＨ２柱（４．６ｍｍˑ ２５０ｍｍ，５μｍ）；以乙腈－无水乙醇－３％磷酸溶液（８０ʒ １０ʒ １０）为流动相；检测波长为２２０ｎｍ㊂理论板数按苦参碱峰计算应不低于１５００㊂
线性范围考察：精密称取苦参碱对照品２０．９ｍｇ于１００ｍＬ容量瓶中，加乙腈－无水乙醇（８０：２０）溶解㊁ 定容，制成浓度为２０９μｇ／ｍＬ的储备液，将上述储备液用乙腈－无水乙醇（８０ʒ ２０）稀释成浓度分别为１０４．５㊁５２．２㊁２６．１㊁１３．１μｇ／ｍＬ的对照品溶液，分用水量提取时间提取次数空白浸膏收率苦参碱含量Ａ／倍Ｂ／ｈＣ／次Ｄ／％／％１１１２２２３３３
１２３１２３３１２
１２３３１２２３１
１２３１２３１２３
１５．６１９．２２１．５２２．３２４．４１７．２２２．８１７．０１９．６
２．４０３．３１４．３３６．２５５．３１４．０８５．６２３．５６５．３１
别精密吸取上述５个不同浓度的对照品溶液１０μＬ，以峰面积（Ｙ）与对照品浓度（Ｘ）进行线性回归，回０．１３归方程为 ２．０９Ｙ＝μｇ４３９６．７范围内Ｘ－，线性关系良好０．８６９６，ｒ＝０．９９９９㊂㊂
表明在
对照品溶液的制备：精密称取５ｍｇ苦参碱对照
品于１００ｍＬ容量瓶中，加乙腈－无水乙醇（８０ʒ ２０）溶解定容，制成每１ｍＬ含苦参碱０．０５ｍｇ的溶液，即得㊂
供试品溶液的制备：精密称取１０ｍｇ干燥物甲醇超声溶解，并定容于１０ｍＬ容量瓶中，即得㊂
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶２．２㊀液各１０正交试验法提取苦参碱μＬ，注入液相色谱仪㊀ ，测定㊂
２．２．１㊀煮法进行提取苦参碱提取工艺条件的选择［５］，以用水量㊁ 提取时间和提取次数为㊀ 采用水煎３
个因素，设计３个水平，进行Ｌ最佳工艺条件㊂ 因素水平表见表９（３４１㊂
）正交试验，筛选表１㊀因素水平表
水平因素
用水量Ａ／倍
提取时间Ｂ／ｈ
提取次数Ｃ／次
１２６３
１０８
２．５２
１３２３
２．２．２㊀主要有效成分考察指标的确定和测定，将其作为考察指标㊀ 苦参碱为苦参的，同时结合浸膏收率优选最佳工艺ｇ，煎煮液按照，Ｌ㊂ 分别称取苦参药材９份各１００
滤过９（３４
），滤液浓缩正交表２设计的条件进行煎煮，置已恒重的蒸发皿中，合并，水浴蒸干，７０ħ 减压干燥至完全干燥后，称重并计算浸膏收率（浸膏收率％＝浸膏重量／样品重量ˑ １００％），结果见表２㊂
ＫＫ１１８．７６７１６．６００Ｋ２２１．３００２０．２３３２０．３６７１９．８６７１９．７３３３Ｒ１９．８００２０．２００２．５３３１９．４３３０．８００２２．９００６．３００２０．２６７０．５３４ＫＫ１ ３．３４７４．７５７Ｋ２ ５．２１３４．０６０３．３４７４．３４０３Ｒ ４．８３０１．８６６４．５７３４．９５７４．３３７０．６９７５．０８７１．７４０４．７１３０．３７６㊀ 在所考察的影响因素中㊀ 由表２直观分析可知，重要性依次为，以浸膏收率为评价指标时Ｃ＞Ａ＞Ｂ；以苦，参碱含量为评价指标时，在所考察的影响因素中，重要性依次为Ａ＞Ｃ＞Ｂ㊂得到最佳工艺条件Ａ以浸膏收率为指标方差分析结果表明２Ｂ１Ｃ，３㊂
以浸膏
收率作为评价指标时，Ｃ因素具有显著意义，Ａ因素和Ｂ因素均无显著意义（表３）；以苦参碱含量为指标方差分析结果表明，以苦参碱含量作为评价指标时，Ａ因素㊁Ｂ 因素和Ｃ因素均无显著意义㊂ 综合考虑环保节能因素ＢＣ８倍量水提取，确定最佳提取工艺条件为３次，每次提取２ｈ（表４）㊂
Ａ２１３，即加表３㊀以浸膏收率为指标方差分析结果
方差来源偏差平方和自由度Ｆ比Ｆ临界值显著性用水量Ａ９．７３６２７．９２２１９提取时间Ｂ１．２２９２１．０００１９提取次数Ｃ６０．２９６２４９．０６１
１９
∗
误差
１．２３
２
㊀ ㊀ Ｆ０．１０（２，２）＝９．００，Ｆ０．０５（２，２）＝１９．０，Ｆ０．０１（２，２）＝９９．０
表４㊀以苦参碱含量为指标方差分析结果
方差来源偏差平方和自由度Ｆ比Ｆ临界值显著性用水量Ａ５．８３２２７．４５８１９提取时间Ｂ０．７８２２１．０００１９提取次数Ｃ５．６３７２７．２０８
１９
误差
０．７８
２
㊀ ㊀ Ｆ０．１０（２，２）＝９．００，Ｆ０．０５（２，２）＝１９．０，Ｆ０．０１（２，２）＝９９．０
㊃ ２６㊃
中国兽药杂志２０１４，４８（３）：２４ ２６／郭德祥，等㊀
２．２．３㊀验证试验㊀ 称取苦参药材３份，按正交试验优选的最佳提取工艺进行放大验证试验，即加８倍量水提取３次，每次提取２ｈ㊂三次验证试验干膏收率（％）分别为２２．４㊁２２．０㊁２２．１，苦参总碱含量（％）分别为６．０８㊁５．９４㊁５．８７；干膏收率（％）和苦参总碱含量（％）的平均值分别为２２．２㊁５．９４㊂验证试验结果表明正交设计筛选出的最佳提取工艺条件重现性良好，说明此工艺稳定㊁ 可行㊂
２．３㊀苦参碱纯化工艺的优化㊀ 苦参提取之后，除有效成分外，还含有较多的淀粉等杂质，而这些杂量，选择萃取３次㊂
２．３．３㊀ｐＨ的考察㊀ 取经苦参醇沉并回收乙醇后的药液３份，每份取相当于生药１００ｇ，加水至１ｍＬʒ １．５ｇ生药，分别用２０％氢氧化钠溶液调ｐＨ值至９㊁１０㊁１１，用三氯甲烷各萃取３次，比较不同ｐＨ值对收膏率及苦参碱含量的影响，结果见表７㊂
表７㊀不同ｐＨ值的比较
ｐＨ９
收膏率／％
２．７苦参碱含量／％
２１．８质将影响其质量，因此需要对粗提物进行纯化㊂ 本文采用乙醇沉淀及三氯甲烷萃取相结合的方法对苦参粗提物进行纯化２．３．１２．０醇量达ｇ生药㊀ 乙醇沉淀㊂
７５％，４／ｍＬ，ħ 每份取相当于生药㊀ 取苦参提取液浓缩成冷藏，上清液回收乙醇１００ｇ，，加乙醇使含１．０㊁１．５㊁比较不同药液浓度对收膏率及苦参碱含量的影响，结果见表５㊂
表５㊀不同药液浓度对收膏率及苦参碱含量影响的比较
药液浓度／（ｇ生药㊃ｍＬ －１１．０）
收膏率苦参碱含量１．５１０．１／％２．０
８．７８．４／％
７．２
１０．２
９．２㊀ 时㊀ 从表中可以看出，当药液浓度为１．０ｇ生药／ｍＬ２．０，收膏率高率比较低ｇ生药㊂ ／ｍＬ，从苦参碱含量比较，当药液浓度为综合考虑收膏率及苦参碱含量时，苦参碱的含量较高，但是此时收，选择将药液浓缩至２．３．２㊀１．０提取液中生物碱加碱碱化三氯甲烷萃取ｇ生药㊀ ／ｍＬ利用生物碱的碱性进行醇沉㊂
，用三氯甲烷萃取，将苦参，回收三氯甲烷，即可得到纯度较高的生物碱㊂
取经苦参醇沉并回收乙醇后的药液３份，每份相当于生药２０％１００ｇ，加水至１ｍＬʒ １．５ｇ萃取氢氧化钠溶液调１㊁２㊁３次，比较不同萃取次数对收膏率及苦参ｐＨ值至１１，用三氯甲烷分别生药，用碱含量的影响，结果见表６㊂
表６㊀萃取次数的比较
萃取次数
收膏率／％
苦参碱含量／％
１２１．８１９．２３
２．３２．８
２４．８２０．６
㊀ 碱含量比较㊀ 从表中可以看出，药液萃取，萃取２次，３苦参碱的含量较高次，收膏率高，从苦参，但此时收率相对较低㊂ 综合考虑收膏率及苦参碱含
１０１１３．０２．８
２０．７１９．９
㊀ 率及苦参碱含量影响不明显㊀ 从表中可以看出，调整ｐＨ㊂ 因此值至，萃取时调节药９ １１，对收膏２．３．４㊀液的ｐＨ批验证试验值至９ １１㊂
按照筛选出的最佳纯化工艺进行放大验证试验㊀ 称取苦参粗提物３份各１㊂ ｋｇ，验
３㊀证试验结果无显著性差异讨论与小结
，说明该工艺稳定㊁ 可行㊂
苦参粗提物被２０％氢氧化钠溶液碱化后，生物碱被游离出来，易被三氯甲烷等溶剂萃取，但生物碱还能与苦参粗提物中的淀粉等杂质生成不溶或难溶沉淀，同时非碱溶性物质也析出，形成咖啡色沉淀，包埋并带走部分生物碱，造成生物碱的损失㊂ 所以采用乙醇沉淀及三氯甲烷萃取相结合的方法先除去苦参粗提物中的淀粉等杂质㊂
苦参药材用８倍量水提取３次，每次提取２ｈ，合并药液并浓缩至１．０ｇ生药／ｍＬ时进行醇沉，醇３沉后调节药液的ｐＨ值为９ １１，并用三氯甲烷萃取
苦参碱的工业化提取次㊂ 优选出的提取㊁ ㊂ 纯化工艺稳定㊁ 可行，可用于参考文献：
［１］㊀刘药杂志梅，刘雪英，２００３，，程建峰２８（９）：８０１．苦参碱的药理研究进展－８０４．［Ｊ］．中国中
［２］㊀中草药李燕，，何立人２０００，．３１（３）：２２７苦参碱类生物碱的心血管系统药理研究－２２９．［Ｊ］．［３］㊀药马方励，２００４，，程２６（５）：４２０怡．苦参碱多种制剂的药效学研究进展－４２２．［Ｊ］．中成［４］㊀二部中国兽药典委员会［Ｓ］．
．‘中华人民共和国兽药典“ 二ʻ 一ʻ 年版［５］㊀邓丽琴２００６，１７（２）：．苦参中苦参碱提取工艺研究２３３－２３４．
［Ｊ］．时珍国医国药，
（编辑：陈希）