68 2009, Vol. 30, No. 08
食品科学※工艺技术
荔枝皮原花青素提取、纯化及抗氧化活性研究
周玮婧，孙智达*，谢笔钧，杨尔宁
(华中农业大学食品科技学院，湖北 武汉 430070)
摘 要：本实验对荔枝果皮内的原花青素提取、纯化和抗氧化活性进行了研究。通过单因素试验和正交试验得出荔枝皮原花青素提取的最佳工艺条件为：乙醇浓度80%、料液比1:20(W/V)、提取温度50℃、提取时间120min 、pH6.0提取3次得到样品提取率95.9%。提取物浓缩后，采用AB-8填充柱对荔枝皮提取物中原花青素进行纯化，得率为1.3%，样品纯度为87.45%。通过对纯化后荔枝皮原花青素的抗氧化性能进行测定, 结果显示荔枝皮原花青素有较好的清除DPPH 自由基的能力。
关键词：荔枝皮；原花青素；提取；纯化；抗氧化性
Extraction, Purification and Antioxidation Evaluation of Procyanidins from Litchi chinensis Pericarp
ZHOU Wei-jing，SUN Zhi-da*，XIE Bi-jun，YANG Er-ning
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)
Abstract ：The objective of this study was to extract and purify procyanidins from Litchi chinensis pericarp and evaluate theirantioxidation. The results showed that the optimum conditions based on single factor and orthogonal test are as follows: thriceextracting Litchi chinensis pericarp with 20 times volume (V/W) of 80% ethanola at pH 6.0 for 120 min at 50 ℃. Under theseconditions, the extraction yield is more than 90%. Then the extract was concentrated and separated by column packed AB-8resins. The purity of the obtained extract is 87.45%, and the yield of procyanidins is 1.3%. The procyanidins of Litchi chinensispericarp have strong scavenging effects to DPPH radicals.
Key words：Litchi chinensis pericarp；procyanidins ；extraction ；purification ；antioxidant activity
中图分类号：TS201.1 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)08-0068-04
原花青素(procyanidins，PC) 是植物界中广泛存在的一大类多酚类化合物，其基本组成单位是黄烷-3-醇和黄烷-3,4-二醇[1]。经多年药理学研究和临床应用发现：原花青素对自由基有很强的捕捉消除能力，是一种很好的氧自由基清除剂，具有抑制红细胞膜和低密度脂蛋白脂质过氧化、防止血小板凝聚、防止心脑血管疾病等功能。目前在食品、保健品、药品、化妆品等领域已有所应用，在欧美等国家享有“皮肤维生素”和“口服化妆品”的美誉[2]。
荔枝为无患子科植物荔枝(Litchi chinensis Sonn.) 的果实，其栽培已有2000多年的历史，是我国南方特产水果。因其营养丰富，味甜肉嫩，品质极优而被誉为“中华之珍品”。我国荔枝鲜果除了在国内市场占有一定地位外，在世界水果贸易上也有明显的优势[3]。
荔枝的工业化生产中主要以鲜果、干果、罐头和
收稿日期：2008-07-10
基金项目：国家自然科学基金-广东省联合基金项目(U0731005)
干制品为主，而大量荔枝皮作为副产品没有得到有效的开发和利用，常常当作废弃物丢弃。其实荔枝皮内含有大量单宁类物质也具有很高的生理活性。李时珍在《本草纲目》中记载：“荔枝皮主治痘疮出不爽快，
[4]
煎汤饮之。又解荔枝热，浸水饮”。
目前关于阻止荔枝皮褐变和研究荔枝皮色素成分的报道有很多[5-6]，却很少有提取工艺方面以及抗氧化活性方面的研究。本实验拟对荔枝皮内的活性成分原花青素进行研究，以期能够为食品天然抗氧化剂领域的进一步开发利用提供科学依据。１1.1
材料与方法材料与试剂
荔枝品种为妃子笑(Litchi chinensis Sonn. cv. Feizixiao)，采自广州市，成熟后采收并立即运回实验室冷藏。
作者简介：周玮婧(1985-)，女，硕士研究生，研究方向为天然产物化学。E-mail ：[email protected]*通讯作者：孙智达(1963-)，男，教授，博士，研究方向为天然产物化学。E-mail ：[email protected]
※工艺技术食品科学
2009, Vol. 30, No. 0869
香草醛天津市科密欧化学试剂开发中心；DPPH 自由基、葡萄籽原花青素标准品 Sigma 公司产品；AB-8大孔吸附树脂 南开大学化工厂；VC 中国医药集团上海化学试剂有限公司；甲醇、乙醇和硫酸均为分析纯。1.2
仪器与设备
Fuhe HH-4数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司；DS-1高速组织捣碎机 上海标本模型厂；SH2-Ⅲ型循环水真空泵 上海亚荣生化仪器厂；X-1001型旋转蒸发器 上爱朗仪器有限公司；UV-9100紫外可见分光光度计 北京瑞利仪器公司；电子天平 赛多利斯科学仪器有限公司。1.3测定方法
1.3.1
荔枝皮原花青素分离提取
将荔枝剥皮，其果皮经过组织捣碎机捣碎，准确称取5.0g 荔枝皮原料放于圆底烧瓶中，加入一定浓度的乙醇，在设定的液料比条件下，将样品放入恒温水浴锅里设定不同温度提取一定时间，并将其提取液进行真空抽滤。1.3.2
荔枝皮原花青素提取工艺优化
在其他条件一致时，分别研究提取温度、提取溶剂的浓度、提取时间、pH 值和料液比对原花青素提取含量的影响。在单因素试验基础上，用正交试验对主要因素进行优化分析，以确定最佳提取工艺。1.3.3
荔枝皮原花青素的纯化
在最优工艺条件下提取荔枝皮原花青素，将提取液过滤后，用旋转蒸发仪减压回收乙醇，水相上AB-8大孔吸附树脂，采用10倍量蒸馏水和50%的乙醇分步洗脱，将洗脱液真空浓缩、冷冻干燥，并测定原花青素的含量。1.3.4
荔枝皮原花青素含量测定
采用硫酸-香草醛法[7]，作标准曲线并得出回归方程。将提取液定容到100ml 容量瓶中，以葡萄籽原花青素的标准曲线计算，测定荔枝皮原花青素的浓度，并换算出质量，计算出得率与纯度[8]，公式如下：
得率(%) =———————————产物中原花青素质量
× 荔枝皮质量
100
纯度(%) =——————————— 产物中原花青素质量
×100
产物质量
1.3.5荔枝皮原花青素清除DPPH 自由基的IC 50值及清除率
DPPH 自由基是一种稳定的以氮为中心的自由基，通过在515nm 波长处检测荔枝皮原花青素对DPPH 自由
基的清除效果，计算其抗氧化能力，并计算出自由基清除率为50%时的自由基清除剂的浓度，即半数抑制率浓度(IC50) 。
取不同稀释度的提取液2ml 和2×10-4mol/L的DPPH 自由基甲醇溶液2ml ，加入同一具塞试管中，摇匀，在室温避光反应30min 后于515nm 处测其吸光度，并用VC 溶液作为阳性对照，计算荔枝皮原花青素对DPPH 自由基的清除率[9]，公式如下：
清除率(%) = (1－ ————A i －A j
) ×
A100
式中：A 0为对照组吸光度；A i 为样品组吸光度；A j 为空白组吸光度。２结果与分析
2.1
原花青素含量测定标准曲线
以葡萄籽原花青素为标准品，分别配制浓度为0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05mg/ml的标准液，作标准曲线(图1) ，计算回归方程为 Y=2.1892X+0.0708，R 2=0.9969。
1.41.2度
1光0.8吸0.60.40.20
00.10.20.30.40.50.6
浓度(mg/ml)
图１ 原花青素含量测定标准曲线Fig.1 Standard curve of
procyanidins
2.2单因素试验
2.2.1
最佳提取温度的选择
)
0.5l m 0.45/g m 0.4(度0.35浓0.3素0.25青花0.2原0.150.1
[1**********]
温度(℃)
图２ 温度对原花青素提取效果的影响
Fig.2 Effects of temperature on extraction of
procyanidins
在提取时间90min 、料液比为1:15(W/V)、乙醇浓度70%、pH6.0、提取次数为1次的条件下，提取温度对原花青素提取效果的影响如图2所示。随着提取温度
70 2009, Vol. 30, No. 08
食品科学
※工艺技术
的增加，提取效果会逐渐提高，但是当温度大于60℃后，原花青素的浓度会下降，提取效果降低，故选择提取温度在50～70℃为宜。2.2.2
最佳乙醇浓度的选择
在提取时间90min 、料液比1:15(W/V)、提取温度70℃、pH6.0、提取次数为1次的条件下，乙醇浓度对原花青素提取效果的影响如图3所示。随着乙醇浓度的增加，提取效果会逐渐提高，但是当乙醇浓度大于70%后，再增加乙醇浓度时，原花青素的浓度会下降，提取效果也逐渐降低，故选择乙醇浓度60%～80%为宜。
)
0.5l m /g 0.45m (度0.4浓0.35素青0.3花原0.250.2
40
50
60
70
80
90
100
乙醇浓度(%)
图３ 乙醇浓度对原花青素提取效果的影响
Fig.3 Effects of ethanol concentration on extraction of
procyanidins
2.2.3
最佳提取时间的选择
在提取温度70℃、料液比1:15(W/V)、乙醇浓度
70%、pH6.0、提取次数为1次的条件下，提取时间对原花青素提取效果的影响如图4所示。随着提取时间的增加，提取效果会逐渐提高，但是当提取时间超过90min 后，原花青素的浓度会逐渐下降，故选择提取时间为60～120min 为宜。
)
0.5l m /0.45g m 0.4(度0.35浓0.3素青0.25花0.2原0.150.120
40
60
80
100
120
140
160
时间(min)
图４ 时间对原花青素提取效果的影响
Fig.4 Effects of extraction time on extraction of
procyanidins
2.2.4
最佳料液比的选择
在提取温度70℃、提取时间90m i n 、乙醇浓度
70%、pH6.0、提取次数为1次的条件下，料液比对原花青素提取效果的影响如图5所示。随着料液比逐渐减小，提取效果会逐步增加，当料液比达到1:15时，继续增加乙醇的比例，提取物浓度没有显著增加。故选择料液比为1:15为宜。
)
0.6l m /g 0.5m (度0.4浓0.3素青0.2花原0.10
1:5
1:10
1:15
1:20
1:25
料液比(W/V)
图５ 料液比对原花青素提取效果的影响
Fig.5 Effect of ratio of material to liquid on extraction of
procyanidins
2.2.5
最佳pH 值的选择
在提取温度70℃、提取时间90m i n 、乙醇浓度
70%、料液比1:15、提取次数为1次的条件下， pH 值对原花青素提取效果的影响如图6所示。当pH ＜6.0时，原花青素的提取效果随pH 值升高而增大；当pH>6.0时，原花青素的含量急剧下降，所以pH6.0时的提取效果为最好。
)
0.35l m /0.3g m 0.25(度浓0.2素0.15青0.1花原0.[1**********]2
pH
图６ ｐＨ值对原花青素提取效果的影响
Fig.6 Effects of pH value on extraction of
procyanidins¡¡
2.3
正交试验结果
表１ 正交试验因素水平表
Table 1 Factors and levels of orthogonal test on extraction
conditions of procyanidins
水平A 时间(min)
B 温度(℃)
C 浓度(%)
D 料液比(W/V)
1
6050601:1029060701:153
120
70
80
1:20
在单因素试验的基础上，选择主要影响因素时间(A)、温度(B)、浓度(C)和料液比(D)为研究对象，采用四因素三水平正交试验来研究荔枝皮原花青素不同条件下提取的效果，并且每个条件下做三个平行试验。以原花青素提取浓度为指标，因素水平表如表1所示。
通过对正交试验结果(表2) 和方差分析结果(表3) 进行分析，表明B 因素的极差最大，因此对荔枝皮原花青素的提取效果影响最为显著的是温度，其次是料液比、时间，乙醇浓度对提取效果的影响最小，且四个因素均达到极显著水平。根据K 值的大小可知，荔枝皮原
※工艺技术食品科学
2009, Vol. 30, No. 0871
花青素提取的最优条件是A 3B 1C 3D 3，即时间120 min 、温度50℃、乙醇浓度80%和料液比1:20。
表２ 正交试验结果
Table 2 Results and range analysis of orthogonal test试验号A 时间B 温度C 浓度D 料液比原花青素浓度(mg/ml)111320.4100.4430.449221110.4030.3960.406331230.5350.5890.665412210.3070.3550.286522330.5530.4730.505632120.3780.3510.319713130.2190.1890.221823220.2420.1690.266933310.256
0.226
0.265
K 10.3200.4770.3200.322K 20.3790.3920.3790.337K 30.3980.2280.3980.438R
0.078
0.249
0.078
0.117
表３ 方差分析表
Table 3 Analysis of variance
方差来源
偏差平方和自由度均方F 值显著性A 0.03020.01511.41**B 0.28820.144109.95**C 0.02920.01511.30**D
0.073
2
0.036
27.79
**
注：F 0.05(3，3) =9.28，F 0.01(3，3) =29.46。*为显著，**为极显著。
2.4提取次数试验结果
在优化工艺的试验条件下，对提取次数进行分析，称取荔枝皮5.0g ，按照料液比1:20加入80%乙醇水溶液，在50℃下提取120m in ，分别进行1、2、3、4、5次提取，其结果如图7所示。
)
l 0.7m /g 0.6m (0.5度浓0.4素0.3青花0.2原0.1012345
提取次数(次)
图７ 提取次数对原花青素提取效果的影响
Fig.7¡¡Effects of extraction times on extraction of
procyanidins
随着提取次数的增加，原花青素的提取效果逐渐增强。但是在原花青素溶出的同时，杂质也在不断溶出，到3次以后的增加量已经很少，所以确定最佳提取次数为3次。综合以上最优工艺条件下得到原花青素提取率为95.9%。2.5
大孔树脂的纯化
将粗提液经大孔树脂进行纯化，结果显示：AB-8大孔吸附树脂法对荔枝皮原花青素有较强的富集纯化作
用，50%乙醇洗脱能得到纯度较高的产物。进一步研究，最终得到产物的纯度为87.45%，得率为1.3%。2.6
抗氧化性能实验结果
按照1.3.2的方法，测得荔枝皮原花青素溶液和VC 溶液在波长515nm 处的吸光度。由图8可以看出，荔枝皮原花青素提取液及VC 溶液都有着较强的清除DPPH 自由基的能力，并且随着浓度的增加，清除率也逐渐增加。当荔枝皮原花青素提取液的浓度达到14mg/L时，可达到90%以上的清除率。且荔枝皮原花青素提取液的IC 50达到了7.1mg/L，而VC 溶液的IC 50为9.8mg/L，表明荔枝皮原花青素较之VC 有着较强的抗氧化能力。
10090)
80%70(率6050荔枝皮原花青素溶液除清40VC 溶液
3020100
[***********]50
浓度(mg/L)
图８ 荔枝皮原花青素提取液清除ＤＰＰＨ自由基的能力
Fig.8 Change of DPPH radical scavenging activity of procyanidins
of Litchi chinensis pericarp and vitamin C with concentration
３结 论
通过单因素试验，在正交试验基础上得出：在提取时间120min 、提取温度50℃、乙醇浓度80%、料液比1:20、pH6、提取三次的条件下可达到最佳的提取效果，得到原花青素的提取率为95.9%。且采用AB-8大孔树脂进行纯化，用50%乙醇作洗脱剂，能得到原花青素的得率为1.3%，纯度为87.45%。且纯化后的荔枝皮原花青素有较强的清除DPPH 自由基能力，当荔枝皮原花青素提取液的浓度达到14mg/L时，可达到90%以上的清除率。其IC 50达到7.1mg/L，强于VC 。
参考文献：
[1]
KOHLER N, WRAY V, WINTERHALTER P. Preparative isolation ofprocyanidins from grape seed extracts by high-speed counter-currentchromatography[J]. Journal of Chromatography A, 2008, 1177: 114-125.[2]
COS P, De BRUYNE T, HERMANS N, et al. Proanthocyanidins inhealth care: current and new trends[J]. Curr Med Chem, 2004, 11(10):1345-1359.
[3]刘志诚, 刘建峰, 余胜权. 荔枝丰产栽培技术彩色图说[M]. 北京: 中国农业出版社, 1998: 2-4.
[4]李时珍. 本草纲目[M]. 石印本. 上海: 锦章图书局印行, 1912: 342-343.[5]张昭其, 庞学群, 段学武. 荔枝果皮褐变过程中花色素苷含量的变化及测定[J]. 华南农业大学学报, 2002, 23(1): 16-19.
[6]陈志慧, 宋光泉. 荔枝皮色素的提取及稳定性研究[J]. 湖南农业科学, 2006, 2(2): 77-79.
[7]孙芸, 谷文英. 硫酸-香草醛法测定葡萄籽原花青素含量[J]. 食品与发酵工业, 2003, 29(9): 43-46.
[8]吴朝霞. 葡萄籽原花青素分离提纯、组分鉴定及抗氧化性研究[D].沈阳: 沈阳农业大学, 2005.
[9]
吕英华. 桑葚渣中红色素的提取工艺及特性研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2006.
68 2009, Vol. 30, No. 08
食品科学※工艺技术
荔枝皮原花青素提取、纯化及抗氧化活性研究
周玮婧，孙智达*，谢笔钧，杨尔宁
(华中农业大学食品科技学院，湖北 武汉 430070)
摘 要：本实验对荔枝果皮内的原花青素提取、纯化和抗氧化活性进行了研究。通过单因素试验和正交试验得出荔枝皮原花青素提取的最佳工艺条件为：乙醇浓度80%、料液比1:20(W/V)、提取温度50℃、提取时间120min 、pH6.0提取3次得到样品提取率95.9%。提取物浓缩后，采用AB-8填充柱对荔枝皮提取物中原花青素进行纯化，得率为1.3%，样品纯度为87.45%。通过对纯化后荔枝皮原花青素的抗氧化性能进行测定, 结果显示荔枝皮原花青素有较好的清除DPPH 自由基的能力。
关键词：荔枝皮；原花青素；提取；纯化；抗氧化性
Extraction, Purification and Antioxidation Evaluation of Procyanidins from Litchi chinensis Pericarp
ZHOU Wei-jing，SUN Zhi-da*，XIE Bi-jun，YANG Er-ning
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)
Abstract ：The objective of this study was to extract and purify procyanidins from Litchi chinensis pericarp and evaluate theirantioxidation. The results showed that the optimum conditions based on single factor and orthogonal test are as follows: thriceextracting Litchi chinensis pericarp with 20 times volume (V/W) of 80% ethanola at pH 6.0 for 120 min at 50 ℃. Under theseconditions, the extraction yield is more than 90%. Then the extract was concentrated and separated by column packed AB-8resins. The purity of the obtained extract is 87.45%, and the yield of procyanidins is 1.3%. The procyanidins of Litchi chinensispericarp have strong scavenging effects to DPPH radicals.
Key words：Litchi chinensis pericarp；procyanidins ；extraction ；purification ；antioxidant activity
中图分类号：TS201.1 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)08-0068-04
原花青素(procyanidins，PC) 是植物界中广泛存在的一大类多酚类化合物，其基本组成单位是黄烷-3-醇和黄烷-3,4-二醇[1]。经多年药理学研究和临床应用发现：原花青素对自由基有很强的捕捉消除能力，是一种很好的氧自由基清除剂，具有抑制红细胞膜和低密度脂蛋白脂质过氧化、防止血小板凝聚、防止心脑血管疾病等功能。目前在食品、保健品、药品、化妆品等领域已有所应用，在欧美等国家享有“皮肤维生素”和“口服化妆品”的美誉[2]。
荔枝为无患子科植物荔枝(Litchi chinensis Sonn.) 的果实，其栽培已有2000多年的历史，是我国南方特产水果。因其营养丰富，味甜肉嫩，品质极优而被誉为“中华之珍品”。我国荔枝鲜果除了在国内市场占有一定地位外，在世界水果贸易上也有明显的优势[3]。
荔枝的工业化生产中主要以鲜果、干果、罐头和
收稿日期：2008-07-10
基金项目：国家自然科学基金-广东省联合基金项目(U0731005)
干制品为主，而大量荔枝皮作为副产品没有得到有效的开发和利用，常常当作废弃物丢弃。其实荔枝皮内含有大量单宁类物质也具有很高的生理活性。李时珍在《本草纲目》中记载：“荔枝皮主治痘疮出不爽快，
[4]
煎汤饮之。又解荔枝热，浸水饮”。
目前关于阻止荔枝皮褐变和研究荔枝皮色素成分的报道有很多[5-6]，却很少有提取工艺方面以及抗氧化活性方面的研究。本实验拟对荔枝皮内的活性成分原花青素进行研究，以期能够为食品天然抗氧化剂领域的进一步开发利用提供科学依据。１1.1
材料与方法材料与试剂
荔枝品种为妃子笑(Litchi chinensis Sonn. cv. Feizixiao)，采自广州市，成熟后采收并立即运回实验室冷藏。
作者简介：周玮婧(1985-)，女，硕士研究生，研究方向为天然产物化学。E-mail ：[email protected]*通讯作者：孙智达(1963-)，男，教授，博士，研究方向为天然产物化学。E-mail ：[email protected]
※工艺技术食品科学
2009, Vol. 30, No. 0869
香草醛天津市科密欧化学试剂开发中心；DPPH 自由基、葡萄籽原花青素标准品 Sigma 公司产品；AB-8大孔吸附树脂 南开大学化工厂；VC 中国医药集团上海化学试剂有限公司；甲醇、乙醇和硫酸均为分析纯。1.2
仪器与设备
Fuhe HH-4数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司；DS-1高速组织捣碎机 上海标本模型厂；SH2-Ⅲ型循环水真空泵 上海亚荣生化仪器厂；X-1001型旋转蒸发器 上爱朗仪器有限公司；UV-9100紫外可见分光光度计 北京瑞利仪器公司；电子天平 赛多利斯科学仪器有限公司。1.3测定方法
1.3.1
荔枝皮原花青素分离提取
将荔枝剥皮，其果皮经过组织捣碎机捣碎，准确称取5.0g 荔枝皮原料放于圆底烧瓶中，加入一定浓度的乙醇，在设定的液料比条件下，将样品放入恒温水浴锅里设定不同温度提取一定时间，并将其提取液进行真空抽滤。1.3.2
荔枝皮原花青素提取工艺优化
在其他条件一致时，分别研究提取温度、提取溶剂的浓度、提取时间、pH 值和料液比对原花青素提取含量的影响。在单因素试验基础上，用正交试验对主要因素进行优化分析，以确定最佳提取工艺。1.3.3
荔枝皮原花青素的纯化
在最优工艺条件下提取荔枝皮原花青素，将提取液过滤后，用旋转蒸发仪减压回收乙醇，水相上AB-8大孔吸附树脂，采用10倍量蒸馏水和50%的乙醇分步洗脱，将洗脱液真空浓缩、冷冻干燥，并测定原花青素的含量。1.3.4
荔枝皮原花青素含量测定
采用硫酸-香草醛法[7]，作标准曲线并得出回归方程。将提取液定容到100ml 容量瓶中，以葡萄籽原花青素的标准曲线计算，测定荔枝皮原花青素的浓度，并换算出质量，计算出得率与纯度[8]，公式如下：
得率(%) =———————————产物中原花青素质量
× 荔枝皮质量
100
纯度(%) =——————————— 产物中原花青素质量
×100
产物质量
1.3.5荔枝皮原花青素清除DPPH 自由基的IC 50值及清除率
DPPH 自由基是一种稳定的以氮为中心的自由基，通过在515nm 波长处检测荔枝皮原花青素对DPPH 自由
基的清除效果，计算其抗氧化能力，并计算出自由基清除率为50%时的自由基清除剂的浓度，即半数抑制率浓度(IC50) 。
取不同稀释度的提取液2ml 和2×10-4mol/L的DPPH 自由基甲醇溶液2ml ，加入同一具塞试管中，摇匀，在室温避光反应30min 后于515nm 处测其吸光度，并用VC 溶液作为阳性对照，计算荔枝皮原花青素对DPPH 自由基的清除率[9]，公式如下：
清除率(%) = (1－ ————A i －A j
) ×
A100
式中：A 0为对照组吸光度；A i 为样品组吸光度；A j 为空白组吸光度。２结果与分析
2.1
原花青素含量测定标准曲线
以葡萄籽原花青素为标准品，分别配制浓度为0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05mg/ml的标准液，作标准曲线(图1) ，计算回归方程为 Y=2.1892X+0.0708，R 2=0.9969。
1.41.2度
1光0.8吸0.60.40.20
00.10.20.30.40.50.6
浓度(mg/ml)
图１ 原花青素含量测定标准曲线Fig.1 Standard curve of
procyanidins
2.2单因素试验
2.2.1
最佳提取温度的选择
)
0.5l m 0.45/g m 0.4(度0.35浓0.3素0.25青花0.2原0.150.1
[1**********]
温度(℃)
图２ 温度对原花青素提取效果的影响
Fig.2 Effects of temperature on extraction of
procyanidins
在提取时间90min 、料液比为1:15(W/V)、乙醇浓度70%、pH6.0、提取次数为1次的条件下，提取温度对原花青素提取效果的影响如图2所示。随着提取温度
70 2009, Vol. 30, No. 08
食品科学
※工艺技术
的增加，提取效果会逐渐提高，但是当温度大于60℃后，原花青素的浓度会下降，提取效果降低，故选择提取温度在50～70℃为宜。2.2.2
最佳乙醇浓度的选择
在提取时间90min 、料液比1:15(W/V)、提取温度70℃、pH6.0、提取次数为1次的条件下，乙醇浓度对原花青素提取效果的影响如图3所示。随着乙醇浓度的增加，提取效果会逐渐提高，但是当乙醇浓度大于70%后，再增加乙醇浓度时，原花青素的浓度会下降，提取效果也逐渐降低，故选择乙醇浓度60%～80%为宜。
)
0.5l m /g 0.45m (度0.4浓0.35素青0.3花原0.250.2
40
50
60
70
80
90
100
乙醇浓度(%)
图３ 乙醇浓度对原花青素提取效果的影响
Fig.3 Effects of ethanol concentration on extraction of
procyanidins
2.2.3
最佳提取时间的选择
在提取温度70℃、料液比1:15(W/V)、乙醇浓度
70%、pH6.0、提取次数为1次的条件下，提取时间对原花青素提取效果的影响如图4所示。随着提取时间的增加，提取效果会逐渐提高，但是当提取时间超过90min 后，原花青素的浓度会逐渐下降，故选择提取时间为60～120min 为宜。
)
0.5l m /0.45g m 0.4(度0.35浓0.3素青0.25花0.2原0.150.120
40
60
80
100
120
140
160
时间(min)
图４ 时间对原花青素提取效果的影响
Fig.4 Effects of extraction time on extraction of
procyanidins
2.2.4
最佳料液比的选择
在提取温度70℃、提取时间90m i n 、乙醇浓度
70%、pH6.0、提取次数为1次的条件下，料液比对原花青素提取效果的影响如图5所示。随着料液比逐渐减小，提取效果会逐步增加，当料液比达到1:15时，继续增加乙醇的比例，提取物浓度没有显著增加。故选择料液比为1:15为宜。
)
0.6l m /g 0.5m (度0.4浓0.3素青0.2花原0.10
1:5
1:10
1:15
1:20
1:25
料液比(W/V)
图５ 料液比对原花青素提取效果的影响
Fig.5 Effect of ratio of material to liquid on extraction of
procyanidins
2.2.5
最佳pH 值的选择
在提取温度70℃、提取时间90m i n 、乙醇浓度
70%、料液比1:15、提取次数为1次的条件下， pH 值对原花青素提取效果的影响如图6所示。当pH ＜6.0时，原花青素的提取效果随pH 值升高而增大；当pH>6.0时，原花青素的含量急剧下降，所以pH6.0时的提取效果为最好。
)
0.35l m /0.3g m 0.25(度浓0.2素0.15青0.1花原0.[1**********]2
pH
图６ ｐＨ值对原花青素提取效果的影响
Fig.6 Effects of pH value on extraction of
procyanidins¡¡
2.3
正交试验结果
表１ 正交试验因素水平表
Table 1 Factors and levels of orthogonal test on extraction
conditions of procyanidins
水平A 时间(min)
B 温度(℃)
C 浓度(%)
D 料液比(W/V)
1
6050601:1029060701:153
120
70
80
1:20
在单因素试验的基础上，选择主要影响因素时间(A)、温度(B)、浓度(C)和料液比(D)为研究对象，采用四因素三水平正交试验来研究荔枝皮原花青素不同条件下提取的效果，并且每个条件下做三个平行试验。以原花青素提取浓度为指标，因素水平表如表1所示。
通过对正交试验结果(表2) 和方差分析结果(表3) 进行分析，表明B 因素的极差最大，因此对荔枝皮原花青素的提取效果影响最为显著的是温度，其次是料液比、时间，乙醇浓度对提取效果的影响最小，且四个因素均达到极显著水平。根据K 值的大小可知，荔枝皮原
※工艺技术食品科学
2009, Vol. 30, No. 0871
花青素提取的最优条件是A 3B 1C 3D 3，即时间120 min 、温度50℃、乙醇浓度80%和料液比1:20。
表２ 正交试验结果
Table 2 Results and range analysis of orthogonal test试验号A 时间B 温度C 浓度D 料液比原花青素浓度(mg/ml)111320.4100.4430.449221110.4030.3960.406331230.5350.5890.665412210.3070.3550.286522330.5530.4730.505632120.3780.3510.319713130.2190.1890.221823220.2420.1690.266933310.256
0.226
0.265
K 10.3200.4770.3200.322K 20.3790.3920.3790.337K 30.3980.2280.3980.438R
0.078
0.249
0.078
0.117
表３ 方差分析表
Table 3 Analysis of variance
方差来源
偏差平方和自由度均方F 值显著性A 0.03020.01511.41**B 0.28820.144109.95**C 0.02920.01511.30**D
0.073
2
0.036
27.79
**
注：F 0.05(3，3) =9.28，F 0.01(3，3) =29.46。*为显著，**为极显著。
2.4提取次数试验结果
在优化工艺的试验条件下，对提取次数进行分析，称取荔枝皮5.0g ，按照料液比1:20加入80%乙醇水溶液，在50℃下提取120m in ，分别进行1、2、3、4、5次提取，其结果如图7所示。
)
l 0.7m /g 0.6m (0.5度浓0.4素0.3青花0.2原0.1012345
提取次数(次)
图７ 提取次数对原花青素提取效果的影响
Fig.7¡¡Effects of extraction times on extraction of
procyanidins
随着提取次数的增加，原花青素的提取效果逐渐增强。但是在原花青素溶出的同时，杂质也在不断溶出，到3次以后的增加量已经很少，所以确定最佳提取次数为3次。综合以上最优工艺条件下得到原花青素提取率为95.9%。2.5
大孔树脂的纯化
将粗提液经大孔树脂进行纯化，结果显示：AB-8大孔吸附树脂法对荔枝皮原花青素有较强的富集纯化作
用，50%乙醇洗脱能得到纯度较高的产物。进一步研究，最终得到产物的纯度为87.45%，得率为1.3%。2.6
抗氧化性能实验结果
按照1.3.2的方法，测得荔枝皮原花青素溶液和VC 溶液在波长515nm 处的吸光度。由图8可以看出，荔枝皮原花青素提取液及VC 溶液都有着较强的清除DPPH 自由基的能力，并且随着浓度的增加，清除率也逐渐增加。当荔枝皮原花青素提取液的浓度达到14mg/L时，可达到90%以上的清除率。且荔枝皮原花青素提取液的IC 50达到了7.1mg/L，而VC 溶液的IC 50为9.8mg/L，表明荔枝皮原花青素较之VC 有着较强的抗氧化能力。
10090)
80%70(率6050荔枝皮原花青素溶液除清40VC 溶液
3020100
[***********]50
浓度(mg/L)
图８ 荔枝皮原花青素提取液清除ＤＰＰＨ自由基的能力
Fig.8 Change of DPPH radical scavenging activity of procyanidins
of Litchi chinensis pericarp and vitamin C with concentration
３结 论
通过单因素试验，在正交试验基础上得出：在提取时间120min 、提取温度50℃、乙醇浓度80%、料液比1:20、pH6、提取三次的条件下可达到最佳的提取效果，得到原花青素的提取率为95.9%。且采用AB-8大孔树脂进行纯化，用50%乙醇作洗脱剂，能得到原花青素的得率为1.3%，纯度为87.45%。且纯化后的荔枝皮原花青素有较强的清除DPPH 自由基能力，当荔枝皮原花青素提取液的浓度达到14mg/L时，可达到90%以上的清除率。其IC 50达到7.1mg/L，强于VC 。
参考文献：
[1]
KOHLER N, WRAY V, WINTERHALTER P. Preparative isolation ofprocyanidins from grape seed extracts by high-speed counter-currentchromatography[J]. Journal of Chromatography A, 2008, 1177: 114-125.[2]
COS P, De BRUYNE T, HERMANS N, et al. Proanthocyanidins inhealth care: current and new trends[J]. Curr Med Chem, 2004, 11(10):1345-1359.
[3]刘志诚, 刘建峰, 余胜权. 荔枝丰产栽培技术彩色图说[M]. 北京: 中国农业出版社, 1998: 2-4.
[4]李时珍. 本草纲目[M]. 石印本. 上海: 锦章图书局印行, 1912: 342-343.[5]张昭其, 庞学群, 段学武. 荔枝果皮褐变过程中花色素苷含量的变化及测定[J]. 华南农业大学学报, 2002, 23(1): 16-19.
[6]陈志慧, 宋光泉. 荔枝皮色素的提取及稳定性研究[J]. 湖南农业科学, 2006, 2(2): 77-79.
[7]孙芸, 谷文英. 硫酸-香草醛法测定葡萄籽原花青素含量[J]. 食品与发酵工业, 2003, 29(9): 43-46.
[8]吴朝霞. 葡萄籽原花青素分离提纯、组分鉴定及抗氧化性研究[D].沈阳: 沈阳农业大学, 2005.
[9]
吕英华. 桑葚渣中红色素的提取工艺及特性研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2006.