菌株的保存使用及销毁
1、新引进的菌种经形态、染色、培养性状、生化特性等的鉴别确定后作记录，并进行保存。
2、自主分离筛选的菌株经试验确定为优良菌株，并进行形态、染色、培养性状、生化特性、毒性等的鉴别确定（必要时进行分子鉴定）后作记录，并进行保存。 3、应用菌株采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌株生长充分以后，转移至 4～8℃冰箱中保存。此法仅用于应用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。 保存时间根据菌种种类而不同，细菌：1个月；酵母菌：2个月；霉菌及芽胞：3个月。
4、半储存菌株以甘油冷冻管保存法或液体石腊封存的半固体琼脂为主。甘油浓度为10%～20%，保存温度为-20～-30℃，每隔1～2年转种一代。此种方法主要适用于需氧细菌和酵母菌的保藏
5长期保存的储存菌株以冷冻干燥保藏为主，特殊要求的菌种可用其它方法进行保存，保存期可长达几年至几十年。
6菌种的传代不可超过6次。视菌种的特性及使用情况，一般储存菌株每5年传代一次，每隔1～2年从储存菌株转接至半储存菌株，半储存菌株每1～2年传代一次，每1～3个月从半储存菌株转接接至应用菌株。
7、菌种的确认：用无菌接种环取上述培养物接种到营养琼脂培养基（细菌）或玫瑰红钠培养基（真菌和酵母菌）平板上，或相应的宜于该菌生长的鉴别培养基平板上，然后在 30～35℃下培养3天（细菌）；20～25℃下培养 5 天（真菌和酵母菌）。培养后，首先观察其是否具有典型的菌落形态，然后挑取生长旺盛的单一的纯菌落，划线于平皿培养基，每种菌划 4 个平皿，以便收集较多的生长旺盛的典型单菌落，进行保存和鉴定。鉴定时作革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及形态特征。必要时再做生化实验以进一步鉴定该菌种。
若在该平板上发现有其它菌落生长，则说明操作有污染或菌种不纯，应将此被污染了的培养物灭活处理，并寻找原因。应根据其原因采取措施重新分离挑选纯菌落。
8、菌种的确认结果，记录在《菌种鉴定记录》上。
9、新引进的菌种的传代按菌种说明书要求复溶菌粉，转种于适宜的增菌培养基内，称第 1 代（G1），复壮后转接至平板上，并在适当温度下培养适当时间，分离单个纯种菌落，此为第 2 代（G2）。自主分离筛选的优良菌株，第一次纯化培养基内称第 1 代（G1），再次纯化纯种菌落，此为第 2 代（G2）。
菌种确认后，挑取平板上纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管，作为保存菌种（G2），也称传代用菌种，同时挑取纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作用菌种，此为第 3 代（W3）。
将第 2 代（G2）菌种管冷冻保存，将工作用菌（W3）于适当温度下培养适当时间后用于日常使用。
取一支冷冻保存的第 2 代（G2）菌种转种于平板和斜面培养基上，平板上的菌种制成冷冻保存管第 3 代（G3）；斜面培养基的菌种经适当温度下培养适当时间后用作工作用菌种，此仍为第 3 代（W3）。
将第 3 代菌种（G3）冷冻或低温保存，将生长、转种后的第 2 代（G2）菌种经高温灭活处理后丢弃。
按上述规程操作，直至 G4 转为 W5 为止，需重新开启冷冻干燥菌种，重复上述规程操作，保存和使用菌种。
当工作用菌种代数小于 5 时，在规定保存期限内，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。
10、传代后，按菌种的编号原则编号，并在每一支菌种管上贴上标签，标签内容包括：名称、编号、代数、传代日期、用途、操作人、有效期。交菌种保藏技术员统一保管。同时及时填写《菌种传代记录》。
11、菌种的编号：
采用字母加数字表示：英文缩写字母—代次—传代日期—顺序号
菌种的英文缩写字母：大肠埃希菌（E.c ）、金黄色葡萄球菌（S.a ）、枯草芽孢杆菌（B.s ）。
代数用一位带有下标数字的字母表示：传代用菌种用G 表示；工作用菌种用 W 表示；如 G3 表示传代用菌种第3代；W3表示工作用菌种第3代。
传代日期用6位数字表示：年份取最后两位数，月、日分别用两位数。 如 2012 年 1 月 12 日传代的第一支大肠埃希菌作为传代用菌种的编号为：E.c-G3-120112-01。
12、保存、使用、传代销毁等应及时认真详细地登记，以备查核。
13、在保存过程中，如发生污染退化等问题，应及时向领导报告，以便处理。
附表1
菌株的保存使用及销毁记录表
7 菌种的使用与管理
7.1生产用菌种应已列入卫生部公布的“可用于保健食品的益生菌菌种名单”，其生物学、遗传学、功效学特性应明确和稳定。
7.2原始菌种采购时必须索取菌株鉴定报告、稳定性报告及菌株不含有耐药因子的证明材料；各生产单位自行分离或收集的菌种，须经卫生部门指定的检验机构审查认可。
7.3 原始菌种经鉴定后，应及时冻干，不能冻干的菌种应保存2份或保存于2份培养基，一份供定期移种或传代用，另一份供经常移种或传代用。并规定适宜保存期限，到期重新筛选、复壮，再冻干。 7.4 每支冻干菌种开启后投产前须进行检定，检定内容包括：形态、纯度及培养特性的检查、糖发酵和生化反应观察。对于同时制备的同一批号的冻干菌种，须抽样进行代谢产物测定、血清学检查、毒性试验，必要时作遗传学特征的鉴定。
7.5 保健食品生产用菌种应采用种子批系统。工作种子批的生物学特性应与原始菌种一致，每批主种子批和工作种子批均应按规程要求保管、检定和使用。在适宜的培养基上主种子传代不超过10代，工作种子传代不超过5代。
7.6 菌种及其代谢产物必须无毒无害，不得在生产用培养基内加入有毒有害物质和致敏性物质。 7.7 从活菌类益生菌保健食品中应能分离出与报批和标识菌种一致的活菌。
7.8 生产企业应有专门的部门和人员管理生产菌种，经常定期检查，建立菌种档案资料，包括来源、历史、筛选、检定、保存方法、数量、启开使用等完整记录。每年向所在地省级卫生行政部门书面汇报管理情况。 7.9 生产用菌种应专门设立种子室，仅限于质量管理部门所批准的人员出入。
质控菌株及其保存与应用
一. 菌种保存
保存菌种用的培养基必须能维持使微生物长期生存且不出现生长或新陈代谢过于旺盛的情况，菌株能较长时间存活且保持性状稳定。 1. 菌种保存的注意事项
(1)不能用含有可发酵性糖的培养基保存菌种。
(2)不可以使用选择性培养基，不能从药敏试验平板培养基上留取菌株。 (3)不可使培养菌干枯，所有试管要保持良好的密封性。
(4)对温度变化敏感的细菌，如淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌，不可贮存于冰箱，但可用快速冷冻干燥法长期保存。 (5)作为抗菌药物敏感试验用的标准菌株，由保存状态取出后，不能连续使用1 周以上，应定期传代，但一般不超过6 次，必要时进行更换。 2. 菌种保存的方法
保存菌种的方法，应根据菌种的类型和保存目的进行选择，一般包括以下几种方法：
(1)培养基保存法：此法不需要特殊设备，并可随时提供使用，为常用的一种保存方法，其缺点是易发生变异。营养要求不高的细菌，可用半固体保存法，一般2～3月转种1次，并检查菌株特性，如特性已改变，则需丢弃。特殊培养要求的细菌，如流感嗜血杆菌可接种巧克力琼脂斜面，密封后冰箱贮存，每2周转种1次。淋病奈瑟菌保存于巧克力琼脂，每天或隔天转种1 次，不宜4 ℃冰箱保存，因易死亡。
(2)快速冷冻法：将纯培养细菌在液体培养基上增菌后，取数个新鲜菌落加入含小牛血清或脱纤维绵羊血的培养基内制成浓菌悬液，再放人无菌玻璃珠，将此瓶放入－30℃以下低温冰箱保存。需要时用无菌镊子取出1 粒玻璃珠置增菌培养液
中，增菌培养后即可获得新鲜菌种。用此方法，大部分细菌可保存6 ～12 月，甚至更长时间。
(3)冷冻干燥法：是菌种保存最佳方法，可以免去细菌因频繁传代而造成菌种污染、变异和死亡。此法需冷冻干燥设备，操作较费时，但适用于需要长期保存的菌种。 三. 菌种管理
(1)实验室保存菌种需按规定时间转种，每转种3代作一次鉴定，并有详细记录卡，包括菌种名称、编号、来源、保存日期、传代情况等。
(2)实验室保存菌株不得擅自处理或带出实验室，如确需要带离实验室，须经上级领导批准，并做好详细的记录。 (3)菌种应有专人保管，如遇工作调动，应及时做好交接工作。
二. 菌种类型 (一) 标准茵株
要搞好临床微生物学检验质控，必须保存有一批标准菌株，作为对仪器、培养基、染色液、试剂和诊断血清的质控菌株，也可作为从事细菌检验的工作人员熟悉某些菌株的教具。 1. 标准菌株的条件
(1)形态、生理、生化及血清学特性典型，并相当稳定。 (2)菌株对所试药物产生恒定的抑菌环和恰当的MIC 值。
(3)对测试项目反应敏感。如测试巧克力琼脂平板的分离能力，应选流感嗜血杆菌或脑膜炎奈瑟菌。 2. 标准菌株的来源
(1)ATCC：美国典型菌种保藏中心。 (2)NCTC：英国国家典型菌种保藏中心。 (3)(中国) 国家菌种保藏中心。
(4)实验室分离菌株：实验室分离菌株必须经过严格鉴定，其形态、生理、生化特征典型，经多次传代，特征恒定，否则不能作为标准菌株。 (二) 临床菌株
临床分离的菌株，可保存几天、几星期或根据需要选择一些菌株长期保存，以便进行统计、分析，或用于教学和研究。
菌株的保存使用及销毁
1、新引进的菌种经形态、染色、培养性状、生化特性等的鉴别确定后作记录，并进行保存。
2、自主分离筛选的菌株经试验确定为优良菌株，并进行形态、染色、培养性状、生化特性、毒性等的鉴别确定（必要时进行分子鉴定）后作记录，并进行保存。 3、应用菌株采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌株生长充分以后，转移至 4～8℃冰箱中保存。此法仅用于应用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。 保存时间根据菌种种类而不同，细菌：1个月；酵母菌：2个月；霉菌及芽胞：3个月。
4、半储存菌株以甘油冷冻管保存法或液体石腊封存的半固体琼脂为主。甘油浓度为10%～20%，保存温度为-20～-30℃，每隔1～2年转种一代。此种方法主要适用于需氧细菌和酵母菌的保藏
5长期保存的储存菌株以冷冻干燥保藏为主，特殊要求的菌种可用其它方法进行保存，保存期可长达几年至几十年。
6菌种的传代不可超过6次。视菌种的特性及使用情况，一般储存菌株每5年传代一次，每隔1～2年从储存菌株转接至半储存菌株，半储存菌株每1～2年传代一次，每1～3个月从半储存菌株转接接至应用菌株。
7、菌种的确认：用无菌接种环取上述培养物接种到营养琼脂培养基（细菌）或玫瑰红钠培养基（真菌和酵母菌）平板上，或相应的宜于该菌生长的鉴别培养基平板上，然后在 30～35℃下培养3天（细菌）；20～25℃下培养 5 天（真菌和酵母菌）。培养后，首先观察其是否具有典型的菌落形态，然后挑取生长旺盛的单一的纯菌落，划线于平皿培养基，每种菌划 4 个平皿，以便收集较多的生长旺盛的典型单菌落，进行保存和鉴定。鉴定时作革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及形态特征。必要时再做生化实验以进一步鉴定该菌种。
若在该平板上发现有其它菌落生长，则说明操作有污染或菌种不纯，应将此被污染了的培养物灭活处理，并寻找原因。应根据其原因采取措施重新分离挑选纯菌落。
8、菌种的确认结果，记录在《菌种鉴定记录》上。
9、新引进的菌种的传代按菌种说明书要求复溶菌粉，转种于适宜的增菌培养基内，称第 1 代（G1），复壮后转接至平板上，并在适当温度下培养适当时间，分离单个纯种菌落，此为第 2 代（G2）。自主分离筛选的优良菌株，第一次纯化培养基内称第 1 代（G1），再次纯化纯种菌落，此为第 2 代（G2）。
菌种确认后，挑取平板上纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管，作为保存菌种（G2），也称传代用菌种，同时挑取纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作用菌种，此为第 3 代（W3）。
将第 2 代（G2）菌种管冷冻保存，将工作用菌（W3）于适当温度下培养适当时间后用于日常使用。
取一支冷冻保存的第 2 代（G2）菌种转种于平板和斜面培养基上，平板上的菌种制成冷冻保存管第 3 代（G3）；斜面培养基的菌种经适当温度下培养适当时间后用作工作用菌种，此仍为第 3 代（W3）。
将第 3 代菌种（G3）冷冻或低温保存，将生长、转种后的第 2 代（G2）菌种经高温灭活处理后丢弃。
按上述规程操作，直至 G4 转为 W5 为止，需重新开启冷冻干燥菌种，重复上述规程操作，保存和使用菌种。
当工作用菌种代数小于 5 时，在规定保存期限内，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。
10、传代后，按菌种的编号原则编号，并在每一支菌种管上贴上标签，标签内容包括：名称、编号、代数、传代日期、用途、操作人、有效期。交菌种保藏技术员统一保管。同时及时填写《菌种传代记录》。
11、菌种的编号：
采用字母加数字表示：英文缩写字母—代次—传代日期—顺序号
菌种的英文缩写字母：大肠埃希菌（E.c ）、金黄色葡萄球菌（S.a ）、枯草芽孢杆菌（B.s ）。
代数用一位带有下标数字的字母表示：传代用菌种用G 表示；工作用菌种用 W 表示；如 G3 表示传代用菌种第3代；W3表示工作用菌种第3代。
传代日期用6位数字表示：年份取最后两位数，月、日分别用两位数。 如 2012 年 1 月 12 日传代的第一支大肠埃希菌作为传代用菌种的编号为：E.c-G3-120112-01。
12、保存、使用、传代销毁等应及时认真详细地登记，以备查核。
13、在保存过程中，如发生污染退化等问题，应及时向领导报告，以便处理。
附表1
菌株的保存使用及销毁记录表
7 菌种的使用与管理
7.1生产用菌种应已列入卫生部公布的“可用于保健食品的益生菌菌种名单”，其生物学、遗传学、功效学特性应明确和稳定。
7.2原始菌种采购时必须索取菌株鉴定报告、稳定性报告及菌株不含有耐药因子的证明材料；各生产单位自行分离或收集的菌种，须经卫生部门指定的检验机构审查认可。
7.3 原始菌种经鉴定后，应及时冻干，不能冻干的菌种应保存2份或保存于2份培养基，一份供定期移种或传代用，另一份供经常移种或传代用。并规定适宜保存期限，到期重新筛选、复壮，再冻干。 7.4 每支冻干菌种开启后投产前须进行检定，检定内容包括：形态、纯度及培养特性的检查、糖发酵和生化反应观察。对于同时制备的同一批号的冻干菌种，须抽样进行代谢产物测定、血清学检查、毒性试验，必要时作遗传学特征的鉴定。
7.5 保健食品生产用菌种应采用种子批系统。工作种子批的生物学特性应与原始菌种一致，每批主种子批和工作种子批均应按规程要求保管、检定和使用。在适宜的培养基上主种子传代不超过10代，工作种子传代不超过5代。
7.6 菌种及其代谢产物必须无毒无害，不得在生产用培养基内加入有毒有害物质和致敏性物质。 7.7 从活菌类益生菌保健食品中应能分离出与报批和标识菌种一致的活菌。
7.8 生产企业应有专门的部门和人员管理生产菌种，经常定期检查，建立菌种档案资料，包括来源、历史、筛选、检定、保存方法、数量、启开使用等完整记录。每年向所在地省级卫生行政部门书面汇报管理情况。 7.9 生产用菌种应专门设立种子室，仅限于质量管理部门所批准的人员出入。
质控菌株及其保存与应用
一. 菌种保存
保存菌种用的培养基必须能维持使微生物长期生存且不出现生长或新陈代谢过于旺盛的情况，菌株能较长时间存活且保持性状稳定。 1. 菌种保存的注意事项
(1)不能用含有可发酵性糖的培养基保存菌种。
(2)不可以使用选择性培养基，不能从药敏试验平板培养基上留取菌株。 (3)不可使培养菌干枯，所有试管要保持良好的密封性。
(4)对温度变化敏感的细菌，如淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌，不可贮存于冰箱，但可用快速冷冻干燥法长期保存。 (5)作为抗菌药物敏感试验用的标准菌株，由保存状态取出后，不能连续使用1 周以上，应定期传代，但一般不超过6 次，必要时进行更换。 2. 菌种保存的方法
保存菌种的方法，应根据菌种的类型和保存目的进行选择，一般包括以下几种方法：
(1)培养基保存法：此法不需要特殊设备，并可随时提供使用，为常用的一种保存方法，其缺点是易发生变异。营养要求不高的细菌，可用半固体保存法，一般2～3月转种1次，并检查菌株特性，如特性已改变，则需丢弃。特殊培养要求的细菌，如流感嗜血杆菌可接种巧克力琼脂斜面，密封后冰箱贮存，每2周转种1次。淋病奈瑟菌保存于巧克力琼脂，每天或隔天转种1 次，不宜4 ℃冰箱保存，因易死亡。
(2)快速冷冻法：将纯培养细菌在液体培养基上增菌后，取数个新鲜菌落加入含小牛血清或脱纤维绵羊血的培养基内制成浓菌悬液，再放人无菌玻璃珠，将此瓶放入－30℃以下低温冰箱保存。需要时用无菌镊子取出1 粒玻璃珠置增菌培养液
中，增菌培养后即可获得新鲜菌种。用此方法，大部分细菌可保存6 ～12 月，甚至更长时间。
(3)冷冻干燥法：是菌种保存最佳方法，可以免去细菌因频繁传代而造成菌种污染、变异和死亡。此法需冷冻干燥设备，操作较费时，但适用于需要长期保存的菌种。 三. 菌种管理
(1)实验室保存菌种需按规定时间转种，每转种3代作一次鉴定，并有详细记录卡，包括菌种名称、编号、来源、保存日期、传代情况等。
(2)实验室保存菌株不得擅自处理或带出实验室，如确需要带离实验室，须经上级领导批准，并做好详细的记录。 (3)菌种应有专人保管，如遇工作调动，应及时做好交接工作。
二. 菌种类型 (一) 标准茵株
要搞好临床微生物学检验质控，必须保存有一批标准菌株，作为对仪器、培养基、染色液、试剂和诊断血清的质控菌株，也可作为从事细菌检验的工作人员熟悉某些菌株的教具。 1. 标准菌株的条件
(1)形态、生理、生化及血清学特性典型，并相当稳定。 (2)菌株对所试药物产生恒定的抑菌环和恰当的MIC 值。
(3)对测试项目反应敏感。如测试巧克力琼脂平板的分离能力，应选流感嗜血杆菌或脑膜炎奈瑟菌。 2. 标准菌株的来源
(1)ATCC：美国典型菌种保藏中心。 (2)NCTC：英国国家典型菌种保藏中心。 (3)(中国) 国家菌种保藏中心。
(4)实验室分离菌株：实验室分离菌株必须经过严格鉴定，其形态、生理、生化特征典型，经多次传代，特征恒定，否则不能作为标准菌株。 (二) 临床菌株
临床分离的菌株，可保存几天、几星期或根据需要选择一些菌株长期保存，以便进行统计、分析，或用于教学和研究。