饲料中的氨基酸分析
一. 仪器及试剂
仪 器：
1). 天平一台（精度0.1mg）； 2). 恒温水浴锅一台； 3). 容量瓶；
4). 试管（1.5×15cm或1.5×10cm）； 5). 微量进样器（5μL或10μL）一支；
6). 微量可调移液枪（1000uμL，200μL）一支、吸头多个； 7). 旋涡混匀器一台；
8). HPLC系统及氨基酸分析专用柱（4.6×250mm 5μm）； 试 剂：
1). 超纯水（≥18MΩ∙cm）； 2). 乙腈（HPLC级）； 3). 三水合醋酸钠（分析纯）； 4). 冰醋酸（分析纯）；
5). 衍生试剂A和衍生试剂B溶液，至于冰箱保存（衍生试剂包对身体有害，用时请做好防护措施）； 6). 正己烷（HPLC级）。
7). 0.1mol/L盐酸溶液：精密量取9.0mL浓盐酸，加去离子水稀释至1000mL。 8）6mol/L盐酸溶液:精密量取浓盐酸溶液，加到去离子纯化水以等比例混合，（再加入0.1%的苯酚试剂作为保护剂）。
二. 流动相的配制
流动相A： 0.1mol/L醋酸钠溶液（pH 6.5）：乙睛＝93.0：7.0
配制方法：准确称取三水合醋酸钠13.6g于1000mL水中，搅拌均匀，使之溶解，用冰
醋酸或氢氧化钠溶液调pH值至6.50；准确量取配制好的三水合醋酸钠溶液930mL和乙腈70mL，混合均匀，抽滤过0.22µm滤膜；
流动相B：水：乙腈＝20.0：80.0
配制方法：准确量取水200mL和乙腈800mL，混合均匀，抽滤过0.22µm滤膜； 三. 衍生化反应 1.
2. 供试品溶液制备
精密称取饲料粉末样品100mg，置于50ml的圆底烧瓶中，加入10ml的6mol/L盐酸溶液，溶解，并在110度条件下加热回流反应24小时，反应完成后，放置冷却；冷却完后转移至100ml的量瓶中，加水分别3次润洗反应瓶，收集到量瓶中定容至100ml；充分混匀，再量取50ml的溶液蒸干，并用2ml水润洗定容，待衍生用。 3. 衍生步骤
1）分别将A、B两种衍生试剂用稀释剂稀释至原来浓度的1/5倍；
2）精密量取上述对照品溶液200µL，置于试管中，加入稀释后的A溶液100µL和稀释后的B溶液100μL，摇匀，室温反应60min；然后加入正己烷溶液400µL旋紧盖子后振摇5~10s，室温静置分层，取下层200µL溶液，加入800μL水混合均匀，再取200µL加入800μL水混合均匀，用孔径为0.22μm有机膜过滤，待分析；
3）供试品的衍生：供试品溶液200µL，置于试管中，加入稀释后的A溶液100µL和稀释后的B溶液100μL，摇匀，室温反应60min；然后加入正己烷溶液400µL旋紧盖子后振摇5~10s，室温静置分层，取下层200µL溶液，加入800μL水混合均匀，再取200µL加入800μL水混合均匀，用孔径为0.22μm有机膜过滤，待分析；
（注意：供试品样品前处理采用酸解提取，需要在衍生之前进行酸挥干处理，供试品中酸性强度过大在衍生过程中会发生中和，衍生过程必须在碱性条件下，才能够起到衍生化完全。） 四. 色谱条件
1. 色谱柱：月旭 Amino Acid，5μm，4.6×250mm； 2. 梯度程序：
流动相A： 0.1mol/L醋酸钠溶液（pH 6.50）：乙睛＝93：7 流动相B： 水：乙腈＝20：80
T(min) A% B% 0.01 100.0 0.0
11 93.0 7.0 13.9 88.0 12.0 14 85.0 15.0 29 66.0 34.0 32 30.0 70.0 35 0.0 100.0 42 0.0 100.0 45 100.0 0.0 60 100.0 0.0 流 速：1.0mL/min 柱 温：40℃ 波 长：254nm 进样量：10μL 工作站记录时间：60min
五．色谱图：
1. 空白
2. 混标
1. 门冬氨酸 2. 谷氨酸 3. 丝氨酸 4. 甘氨酸 5. 组氨酸 6. 精氨酸 7. 苏氨酸
8. 丙氨酸 9. 脯氨酸 10．氯化铵 11. 酪氨酸 12. 缬氨酸 13. 蛋氨酸 14. 胱氨酸
15. 异亮氨酸 16. 亮氨酸 17. 正亮氨酸 18. 苯丙氨酸 19. 赖氨酸
3. 饲料样品
五. 操作步骤和注意事项 1. 操作步骤：
1）设置柱温40℃和流速1.0mL/min；
2）将A、B两个通道用乙腈：水＝20：80排尽气泡（如B通道的原存留液中不含缓冲盐，则无需用乙腈：水＝20：80排气泡），B通道用流动相B再排尽气泡； 3）用乙腈：水＝20：80（A通道）冲洗系统20min，以防止缓冲盐析出； 4）A通道用流动相A排尽气泡，然后用流动相A走基线30min，平衡色谱柱； 5）运行一次空白梯度； 6）进样分析； 7) 分析完成后：
I）用乙腈：水＝20：80代替流动相A，进水样（清洗自动进样器），进行梯度洗脱； II）换90％乙腈冲洗色谱柱40min以上；
2. 注意事项：
1）进样分析：先进对照品溶液，后进供试品溶液； 2）缓冲溶液，隔天需重新配制； 3）防止缓冲盐析出。
饲料中的氨基酸分析
一. 仪器及试剂
仪 器：
1). 天平一台（精度0.1mg）； 2). 恒温水浴锅一台； 3). 容量瓶；
4). 试管（1.5×15cm或1.5×10cm）； 5). 微量进样器（5μL或10μL）一支；
6). 微量可调移液枪（1000uμL，200μL）一支、吸头多个； 7). 旋涡混匀器一台；
8). HPLC系统及氨基酸分析专用柱（4.6×250mm 5μm）； 试 剂：
1). 超纯水（≥18MΩ∙cm）； 2). 乙腈（HPLC级）； 3). 三水合醋酸钠（分析纯）； 4). 冰醋酸（分析纯）；
5). 衍生试剂A和衍生试剂B溶液，至于冰箱保存（衍生试剂包对身体有害，用时请做好防护措施）； 6). 正己烷（HPLC级）。
7). 0.1mol/L盐酸溶液：精密量取9.0mL浓盐酸，加去离子水稀释至1000mL。 8）6mol/L盐酸溶液:精密量取浓盐酸溶液，加到去离子纯化水以等比例混合，（再加入0.1%的苯酚试剂作为保护剂）。
二. 流动相的配制
流动相A： 0.1mol/L醋酸钠溶液（pH 6.5）：乙睛＝93.0：7.0
配制方法：准确称取三水合醋酸钠13.6g于1000mL水中，搅拌均匀，使之溶解，用冰
醋酸或氢氧化钠溶液调pH值至6.50；准确量取配制好的三水合醋酸钠溶液930mL和乙腈70mL，混合均匀，抽滤过0.22µm滤膜；
流动相B：水：乙腈＝20.0：80.0
配制方法：准确量取水200mL和乙腈800mL，混合均匀，抽滤过0.22µm滤膜； 三. 衍生化反应 1.
2. 供试品溶液制备
精密称取饲料粉末样品100mg，置于50ml的圆底烧瓶中，加入10ml的6mol/L盐酸溶液，溶解，并在110度条件下加热回流反应24小时，反应完成后，放置冷却；冷却完后转移至100ml的量瓶中，加水分别3次润洗反应瓶，收集到量瓶中定容至100ml；充分混匀，再量取50ml的溶液蒸干，并用2ml水润洗定容，待衍生用。 3. 衍生步骤
1）分别将A、B两种衍生试剂用稀释剂稀释至原来浓度的1/5倍；
2）精密量取上述对照品溶液200µL，置于试管中，加入稀释后的A溶液100µL和稀释后的B溶液100μL，摇匀，室温反应60min；然后加入正己烷溶液400µL旋紧盖子后振摇5~10s，室温静置分层，取下层200µL溶液，加入800μL水混合均匀，再取200µL加入800μL水混合均匀，用孔径为0.22μm有机膜过滤，待分析；
3）供试品的衍生：供试品溶液200µL，置于试管中，加入稀释后的A溶液100µL和稀释后的B溶液100μL，摇匀，室温反应60min；然后加入正己烷溶液400µL旋紧盖子后振摇5~10s，室温静置分层，取下层200µL溶液，加入800μL水混合均匀，再取200µL加入800μL水混合均匀，用孔径为0.22μm有机膜过滤，待分析；
（注意：供试品样品前处理采用酸解提取，需要在衍生之前进行酸挥干处理，供试品中酸性强度过大在衍生过程中会发生中和，衍生过程必须在碱性条件下，才能够起到衍生化完全。） 四. 色谱条件
1. 色谱柱：月旭 Amino Acid，5μm，4.6×250mm； 2. 梯度程序：
流动相A： 0.1mol/L醋酸钠溶液（pH 6.50）：乙睛＝93：7 流动相B： 水：乙腈＝20：80
T(min) A% B% 0.01 100.0 0.0
11 93.0 7.0 13.9 88.0 12.0 14 85.0 15.0 29 66.0 34.0 32 30.0 70.0 35 0.0 100.0 42 0.0 100.0 45 100.0 0.0 60 100.0 0.0 流 速：1.0mL/min 柱 温：40℃ 波 长：254nm 进样量：10μL 工作站记录时间：60min
五．色谱图：
1. 空白
2. 混标
1. 门冬氨酸 2. 谷氨酸 3. 丝氨酸 4. 甘氨酸 5. 组氨酸 6. 精氨酸 7. 苏氨酸
8. 丙氨酸 9. 脯氨酸 10．氯化铵 11. 酪氨酸 12. 缬氨酸 13. 蛋氨酸 14. 胱氨酸
15. 异亮氨酸 16. 亮氨酸 17. 正亮氨酸 18. 苯丙氨酸 19. 赖氨酸
3. 饲料样品
五. 操作步骤和注意事项 1. 操作步骤：
1）设置柱温40℃和流速1.0mL/min；
2）将A、B两个通道用乙腈：水＝20：80排尽气泡（如B通道的原存留液中不含缓冲盐，则无需用乙腈：水＝20：80排气泡），B通道用流动相B再排尽气泡； 3）用乙腈：水＝20：80（A通道）冲洗系统20min，以防止缓冲盐析出； 4）A通道用流动相A排尽气泡，然后用流动相A走基线30min，平衡色谱柱； 5）运行一次空白梯度； 6）进样分析； 7) 分析完成后：
I）用乙腈：水＝20：80代替流动相A，进水样（清洗自动进样器），进行梯度洗脱； II）换90％乙腈冲洗色谱柱40min以上；
2. 注意事项：
1）进样分析：先进对照品溶液，后进供试品溶液； 2）缓冲溶液，隔天需重新配制； 3）防止缓冲盐析出。