实验 49 过氧化氢酶的活性测定
植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使 H 2 O 2 累积。 H 2 O 2 可以直接或间接地氧化细胞内核酸、蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除 H 2 O 2 ，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中 过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。
Ⅰ 高锰酸钾滴定法
一、原理
过氧化氢酶能催化过氧化氢分解为水和分子氧，可根据 H 2 O 2 的消耗量或 O 2 的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的 H 2 O 2 溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的 H 2 O 2 ，即可求出消耗的 H 2 O 2 的量。
5H 2 O 2 +2KMnO 4 +4H 2 SO 4 → 5O 2 +2KHSO 4 +8H 2 O+2MnSO 4
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
植物叶片。
（二）试剂
1 ． 10 ％ H 2 SO 4 。
2 ． 0.2 mol/L 磷酸缓冲液 pH7.8 。
3 ． 0.1 mol/L 高锰酸钾标准液：称取 KMnO 4 （ AR ） 3.1605 g ，用新煮沸冷却蒸馏水配制成 1000 mL ，用 0.1 mol/L 草酸溶液标定。
4 ． 0.1 mol/L H 2 O 2 ： 30 ％ H 2 O 2 大约等于 17.6 mol/L ，取 30 ％ H 2 O 2 溶液 5.68 mL ，稀释至 1000 mL ，用标准 0.1 mol KMn0 4 溶液（在酸性条件下）进行标定。
5 ． 0.1 mol/L 草酸：称取分析纯 H 2 C 2 O 4 · 2H 2 O 12.607 g ，用蒸馏水溶解后，定容至 1000 mL 。
（三）仪器设备
研钵， 50 mL 三角瓶 14 个， 10 mL 酸式滴定管，恒温水浴锅， 25 mL 容量瓶 1 个。
三、实验步骤
1 ．酶液提取 称取小麦叶片 2.5 g 加入 pH7.8 的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至 25 mL 容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容， 4000 r/min 离心 15 min ，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
2 ．取 50 mL 三角瓶 4 个（ 2 个测定， 2 个对照），测定瓶中加入酶液 2.5 mL ，对照瓶中加入煮死酶液 2.5 mL ，再加入 2.5 mL 0.1 mol/L H 2 O 2 ，同时计时，于 30 ℃恒温水浴中保温 10 min 后，立即加入 10 ％ H 2 SO 4 2.5 mL 。
3 ．用 0.1 mol/L KMnO 4 标准溶液滴定 H 2 O 2 ，至出现粉红色（在 30 min 内不消失）为终点。
四、结果计算
酶活性用每克鲜重样品 l min 内分解 H 2 O 2 的毫克数表示：
酶活 [mg/ （ g ? min ）
] =
式中： A ——对照 KMnO 4 滴定毫升数（ mL ）。
B ——酶反应后 KMnO 4 滴定毫升数（ mL ）。
V T ——酶液总量（ mL ）。
1.7 —— l mL 0.1 mol/L 的 KMnO 4 相当于 1.7 mg H 2 O 2 。
FW ——样品鲜重（ g ）。
V 1 ——反应所用酶液量（ mL ）。
t ——反应时间（ min ）。
注意：所用 KMnO 4 溶液及 H 2 O 2 溶液临用前要经过重新标定。
Ⅱ 紫外吸收法
一、原理
H 2 O 2 在 240nm 波长下有强吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（ A 240 ）随反应时间而降低。根据测量吸光度的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
小麦叶片或其他植物组织。
（二）试剂
1 ． 0.2 mol/L pH7.8 磷酸缓冲液（内含 1 ％聚乙烯吡咯烷酮）。
2 ． 0.1 mol/L H 2 O 2 （用 0.1 mol/L 高锰酸钾标定）。
（三）仪器设备
紫外分光光度计，离心机，研钵， 25 mL 容量瓶 1 个，刻度吸管 0.5 mL 2 支， 2 mL 1 支， 10 mL 试管 3 支，恒温水浴锅。
三、实验步骤
1 ．酶液提取 称取新鲜小麦叶片或其他植物组织 0.5g ，置研钵中，加 2 ～ 3mL 4 ℃下预冷的 pH7.8 磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入 25 mL 容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并缓冲洗液，并定容到刻度。混合均匀，将容量瓶置 5 ℃冰箱中静置 l0 min ，取上部澄清液在 4000 r/min 下离心 15 min ，上清液即为过氧化氢酶粗提液， 5 ℃下保存备用。
2 ．测定 取 l0mL 试管 3 支，其中 2 支为样品测定管， 1 支为空白管（将酶液煮死），按表 49 – 1 顺序加入试剂。
表 49-1 紫外吸收待测样品测定液配制表
25 ℃预热后，逐管加入 0.3 mL 0.1 mol/L 的 H 2 O 2 ，每加完 1 管立即计时，并迅速倒入石英比色杯中， 240 nm 下测定吸光度，每隔 l min 读数 1 次，共测 4 min ，待 3 支管全部测定完后，计算酶活性。
四、结果计算
以 1 min 内 A 240 减少 0.1 的酶量为 1 个酶活单位（ u ）。
过氧化氢酶活性 [u / （ g · min ）
=
式中： ΔA 240 —— A S0 – （ A S1 +A S2 ） /2 。
A S0 ——加入煮死酶液的对照管吸光度。
A S1 、 A S2 ——样品管吸光度。
V t ——粗酶提取液总体积（ mL ）。
V 1 ——测定用粗酶液体积（ mL ）。
FW ——样品鲜重（ g ）。
0.1 —— A 240 每下降 0.1 为 1 个酶活单位（ u ）。 t ——加过氧化氢到最后一次读数时间（ min ）。
注意：凡在 240 nm 下有强吸收的物质对本实验有干扰。
[ 思考题 ]
影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些？
实验 49 过氧化氢酶的活性测定
植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使 H 2 O 2 累积。 H 2 O 2 可以直接或间接地氧化细胞内核酸、蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除 H 2 O 2 ，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中 过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。
Ⅰ 高锰酸钾滴定法
一、原理
过氧化氢酶能催化过氧化氢分解为水和分子氧，可根据 H 2 O 2 的消耗量或 O 2 的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的 H 2 O 2 溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的 H 2 O 2 ，即可求出消耗的 H 2 O 2 的量。
5H 2 O 2 +2KMnO 4 +4H 2 SO 4 → 5O 2 +2KHSO 4 +8H 2 O+2MnSO 4
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
植物叶片。
（二）试剂
1 ． 10 ％ H 2 SO 4 。
2 ． 0.2 mol/L 磷酸缓冲液 pH7.8 。
3 ． 0.1 mol/L 高锰酸钾标准液：称取 KMnO 4 （ AR ） 3.1605 g ，用新煮沸冷却蒸馏水配制成 1000 mL ，用 0.1 mol/L 草酸溶液标定。
4 ． 0.1 mol/L H 2 O 2 ： 30 ％ H 2 O 2 大约等于 17.6 mol/L ，取 30 ％ H 2 O 2 溶液 5.68 mL ，稀释至 1000 mL ，用标准 0.1 mol KMn0 4 溶液（在酸性条件下）进行标定。
5 ． 0.1 mol/L 草酸：称取分析纯 H 2 C 2 O 4 · 2H 2 O 12.607 g ，用蒸馏水溶解后，定容至 1000 mL 。
（三）仪器设备
研钵， 50 mL 三角瓶 14 个， 10 mL 酸式滴定管，恒温水浴锅， 25 mL 容量瓶 1 个。
三、实验步骤
1 ．酶液提取 称取小麦叶片 2.5 g 加入 pH7.8 的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至 25 mL 容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容， 4000 r/min 离心 15 min ，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
2 ．取 50 mL 三角瓶 4 个（ 2 个测定， 2 个对照），测定瓶中加入酶液 2.5 mL ，对照瓶中加入煮死酶液 2.5 mL ，再加入 2.5 mL 0.1 mol/L H 2 O 2 ，同时计时，于 30 ℃恒温水浴中保温 10 min 后，立即加入 10 ％ H 2 SO 4 2.5 mL 。
3 ．用 0.1 mol/L KMnO 4 标准溶液滴定 H 2 O 2 ，至出现粉红色（在 30 min 内不消失）为终点。
四、结果计算
酶活性用每克鲜重样品 l min 内分解 H 2 O 2 的毫克数表示：
酶活 [mg/ （ g ? min ）
] =
式中： A ——对照 KMnO 4 滴定毫升数（ mL ）。
B ——酶反应后 KMnO 4 滴定毫升数（ mL ）。
V T ——酶液总量（ mL ）。
1.7 —— l mL 0.1 mol/L 的 KMnO 4 相当于 1.7 mg H 2 O 2 。
FW ——样品鲜重（ g ）。
V 1 ——反应所用酶液量（ mL ）。
t ——反应时间（ min ）。
注意：所用 KMnO 4 溶液及 H 2 O 2 溶液临用前要经过重新标定。
Ⅱ 紫外吸收法
一、原理
H 2 O 2 在 240nm 波长下有强吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（ A 240 ）随反应时间而降低。根据测量吸光度的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
小麦叶片或其他植物组织。
（二）试剂
1 ． 0.2 mol/L pH7.8 磷酸缓冲液（内含 1 ％聚乙烯吡咯烷酮）。
2 ． 0.1 mol/L H 2 O 2 （用 0.1 mol/L 高锰酸钾标定）。
（三）仪器设备
紫外分光光度计，离心机，研钵， 25 mL 容量瓶 1 个，刻度吸管 0.5 mL 2 支， 2 mL 1 支， 10 mL 试管 3 支，恒温水浴锅。
三、实验步骤
1 ．酶液提取 称取新鲜小麦叶片或其他植物组织 0.5g ，置研钵中，加 2 ～ 3mL 4 ℃下预冷的 pH7.8 磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入 25 mL 容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并缓冲洗液，并定容到刻度。混合均匀，将容量瓶置 5 ℃冰箱中静置 l0 min ，取上部澄清液在 4000 r/min 下离心 15 min ，上清液即为过氧化氢酶粗提液， 5 ℃下保存备用。
2 ．测定 取 l0mL 试管 3 支，其中 2 支为样品测定管， 1 支为空白管（将酶液煮死），按表 49 – 1 顺序加入试剂。
表 49-1 紫外吸收待测样品测定液配制表
25 ℃预热后，逐管加入 0.3 mL 0.1 mol/L 的 H 2 O 2 ，每加完 1 管立即计时，并迅速倒入石英比色杯中， 240 nm 下测定吸光度，每隔 l min 读数 1 次，共测 4 min ，待 3 支管全部测定完后，计算酶活性。
四、结果计算
以 1 min 内 A 240 减少 0.1 的酶量为 1 个酶活单位（ u ）。
过氧化氢酶活性 [u / （ g · min ）
=
式中： ΔA 240 —— A S0 – （ A S1 +A S2 ） /2 。
A S0 ——加入煮死酶液的对照管吸光度。
A S1 、 A S2 ——样品管吸光度。
V t ——粗酶提取液总体积（ mL ）。
V 1 ——测定用粗酶液体积（ mL ）。
FW ——样品鲜重（ g ）。
0.1 —— A 240 每下降 0.1 为 1 个酶活单位（ u ）。 t ——加过氧化氢到最后一次读数时间（ min ）。
注意：凡在 240 nm 下有强吸收的物质对本实验有干扰。
[ 思考题 ]
影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些？