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实 验 日 期： 毕业论文 pH 对培养基凝固的影响 生命科学学院 生物工程30701班 2010年11月至2011年06月
目 录
毕业论文任务书……………………………………………………………………Ⅰ 开题报告……………………………………………………………………………Ⅱ 指导教师审查意见…………………………………………………………………Ⅲ 评阅教师评语………………………………………………………………………Ⅳ 答辩会议记录………………………………………………………………………Ⅴ 中文摘要……………………………………………………………………………Ⅵ 外文摘要……………………………………………………………………………Ⅶ
1 前言 ..................................................................................................................................................... 1
1.1 固体培养基凝固剂——琼脂简介 . .......................................................................................... 1
1.2 研究的思路、目的及意义 . ...................................................................................................... 2
1.3 国内外的研究现状与发展趋势 . .............................................................................................. 3
2 材料与方法 ......................................................................................................................................... 4
2.1 实验器材 .................................................................................................................................. 4
2.3 实验过程与步骤 . ...................................................................................................................... 5
3 结果与分析 ....................................................................................................................................... 7
3.1 培养基形态的观察结果 . .......................................................................................................... 7
3.2 培养基凝固强度试验结果 . ...................................................................................................... 9
4 讨论 ................................................................................................................................................... 10
参考文献 ................................................................................................................................................. 10
致谢 ......................................................................................................................................................... 12
pH 对培养基凝固的影响
学 生： 生命科学学院
指导教师： 生命科学学院
[摘要] 在植物组织培养过程中，配制培养基是非常关键的一步。同人公司在平常配制培养基过程中常常出现培养基不凝固，或半凝固，或一摇晃培养基就破碎或者太硬。而培养基是整个组织培养中开头的一步，如果正常的培养基不足，会影响到整个组培过程的进度。本实验以调节培养基灭菌前的pH 值，来观察pH 对灭菌后培养基的影响。这将使公司日后更好的节约成本，更好的提高效率，更好的增长产量。笔者使用进口琼脂粉，定量6.5g/L，设pH 梯度为3.8-5.8共六组，进行一系列实验。通过实验，我观察到，在配制MS 培养基时，灭菌前培养基pH 为5.4时，在灭菌后，培养基凝固最适宜组培接种使用；在添加了土豆的MS 培养基中，pH 为5.0时，在灭菌后培养基最适宜组培接种使用。
[关键词] MS 培养基；琼脂；培养基凝固；pH ；影响
Effects of pH on Solidification of Culture Medium
Student: He Cao, College of Life Science, Yangtze University
Tutor: Yan Han , College of Life Science, Yangtze University
[Abstract] Preparation of Culture medium is a key step in plant tissue culture. In the normal, Culture medium often appears not solidification or semi-solidification, or broken of rock or too in TORUN. However, Culture medium is the beginning of the step in plant tissue culture and it will affect the progress of the whole process of tissue culture if the normal Culture medium is not enough. In this study, ordered to observe the pH effect on the Culture medium after sterilization through adjust the pH of Culture medium before sterilization. It could make cost savings, efficiency improved and production increased. Author use agar powder imports, quantitative 6.5g / L, and set six groups of pH gradient of
3.8-5.8 to conducted a series of experiments. Through the experiment, I observed, in the preparation of MS culture medium when Culture medium pH=5.4 before sterilization the Culture medium solidification with the most appropriate use of tissue culture inoculation after sterilization. And in the MS medium who add the potatoes, when pH=5.0, it most appropriate use of tissue culture inoculation after sterilization.
[Keywords] MS culture medium, agar, solidification of medium, pH, effects
前言
pH 对培养基凝固的影响
1 前言
1.1 固体培养基凝固剂——琼脂简介
在一般常态培养温度下呈固体状态的培养基都称固体培养基。固体培养基的凝固剂一般不是所培养生物的营养成分，只起固化或粘合作用。常见凝固剂有琼脂、明胶、无机硅胶等[1]。植物组织培养分为固体培养和液体培养两大类。固体培养最常用的凝固剂为琼脂[2]。
琼脂又名琼胶，俗称洋菜、冻粉，英文名称为Agar ，是由马来语Agar-Agar 略称而来。琼脂是从石花菜、江篱及紫菜等红藻类植物中提取而制成的一种藻胶[3]。其属于半乳糖的硫酸脂，含人体必需的碘、钙、铁、钠和镁等元素[4]。其多糖成分在人体内如同膳食纤维一样对肠道无刺激性，能促进肠道蠕动，有润肠功效[5]。此外，它还具有开胃健脾，止渴生津，促进人体新陈代谢和养颜驻容等功效，对高血压和肝炎还有一定的辅助治疗作用[6]。琼脂是常用的食品添加剂，广泛应用于肉制品、果冻、布丁各种饮料糖果、糕点和啤酒或米酒等中[7～10]。在添加琼脂的食品中，琼脂的功能特性与产品的质量紧密相关，例如：在肉糜制品中添加琼脂能明显改变肉制品的硬度、弹性和黏性，由于其能提高产品的保水性而明显提高产品的得率[4]。
琼脂是一种海藻多糖，其水解物的组成有40%的D-半乳糖、40%的3，6-失水L 半乳糖、3%硫酸酯和2%丙酮酸。实际上，它是琼脂胶和琼脂糖两种成分的混合物。琼脂胶是琼脂糖的硫酸酯，琼脂糖主要依靠氢键的引力，形成网状结构[11]。因此，琼脂糖凝胶的稳定性比那些以化学键交链而形成网状结构的凝固剂的稳定性要差一些
[12]。琼脂溶于热水而不溶于冷水，因此在配制培养基时需煮制琼脂。随着温度的升高，琼脂逐渐溶解，当温度下降到40℃时则开始凝固。0.7%～0.8%的琼脂水溶液在冷却后会很好凝固[13]。 配制培养基时应注意，由于各地生产的琼脂的质量不同，同样浓度的琼脂水溶液凝固后在硬度、透明度及色泽上会有所差异。劣质琼脂不仅凝固性差，而且带有很多杂质。
pH 对培养基凝固的影响
凝胶化是指线性高分子化合物由于分子间的交联反应，使反应体系粘度无限增大，而产生的凝胶现象。此时，体系中包含了两部分：一部分是凝胶，它具巨型网络结构，不溶于一切溶剂；另一部分是溶胶，其分子量较小，被笼罩在凝胶的网络结构中[14]。根据交联方式，凝胶可分为化学交联和物理交联两种[15]。化学交联是高分子链段间以共价键交联起来，这种交联很牢固，使高分子只发生溶胀，而不能熔融更不溶解。物理交联包括有氢键、库伦力、配位键及物理缠结等形成的线性分子间的交联
[16]。琼脂依靠高分子链段相互作用间可形成氢键而成为凝胶结构。这种氢键会因加热等而被破坏，使凝胶变为溶胶[17]。
琼脂的凝胶化主要是其琼脂糖之间氢键结合的结果，其含有的大量的水在网络结构稳定上发挥了重要的作用[18]。凝胶中水有几种状态存在，在高分子网络附近的水与网络有很强的相互作用。将紧挨着高分子网络的，在极低温度下也不冻结的水称为不冻水；而将在-10℃-20℃才冻结的水称为束缚水；离网络很远的水，显示与普通水同样的性质，称作自由水[16]。在溶胶状态，温度接近水沸点时，琼脂分子是一种随机卷曲状态。温度降至凝固点，在凝胶状态时，琼脂分子相互交联，形成三维网络结构，基本结构为左手双螺旋。沿着螺旋轴两侧有很大的空穴，使琼脂能结合足够多的水[19]。
琼脂的流变性变化是琼脂凝胶化过程中的一个重要特征。在温度高时，其流变行为与稀溶液中的聚合物流变行为相似；在温度低至凝固点以下时，流变行为像交联的聚合物。温度在溶胶和凝胶的变化过程中，流变性更为复杂。另外，琼脂的流变性受琼脂的浓度、分子量以及其它的物质（如甘油）的影响[20～22]。
1.2 研究的思路、目的及意义
本实验采用两种固体培养基配方，研究pH 值对这两种培养基凝固的影响。培养基作为植物组织培养必要因素，它的好坏直接关系到组织培养全过程。根据公司平常配制培养基的方法，然后利用酸碱调节培养基灭菌前的pH 值，然后灭菌。马云等[4]，研究表明琼脂浓度是影响凝胶硬度的显著因素，与改变离子强度和pH 相比，改变琼脂溶液的浓度是控制琼脂凝胶硬度的最有效方法。但同人生物科技有限公司（实验地点，以下简称同人公司）已经有人研究琼脂浓度对培养基凝固的影响，同人公司为了使平常所配制的培养基凝固程度有高度的稳定性。就选取了调节pH 来研究pH 值对培养基凝固的影响。
前言
MS 培养基是目前普遍使用的培养基。它可用来诱导愈伤组织，或用于胚、茎段、茎尖及花药培养。与其他培养基基本成分相比，MS 培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量较高，这是它的明显特点。这是目前应用最广泛的一种培养基[23]。同人公司也使用MS 培养基或其中加入天然添加物作为组织培养的培养基。
在植物组织培养过程中，配制培养基是非常关键的一步。同人公司在平常配制培养基过程中常常出现培养基不凝固，或半凝固，或一摇晃培养基就破碎的现象。而培养基是整个组织培养中开头的一步，如果正常的培养基不足，会导致整个组培过程的进度，影响公司正常运营，同时配制的培养基不合格会浪费资源和公司资产。所以同人公司对培养基的配制非常重视。杜永光等[24]，观察到培养基凝固程度受pH 影响较大。
因此，研究pH 对培养基凝固的影响是同人公司势在必行的项目，这将使公司日后可以更好的节约成本，更好的提高效率，更高的增长产值。
1.3 国内外的研究现状与发展趋势
目前国内外，研究培养基凝固的影响因素，主要是pH 、琼脂浓度、培养基成分，灭菌温度和时间，还有琼脂的质量。贾秀玲[25]研究了pH 对察氏培养基、马铃薯—葡萄糖琼脂培养基、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，另外还有不加任何营养物质的琼脂对照培养基的影响。贾秀玲的实验证明样品中添加营养成分对琼脂凝固性无影响，在琼脂含量为2%时影响琼脂凝固的主要因素为是pH 值，当pH 值低于4时，琼脂失去凝固能力。王泉，孙珮石等[26]，实验得出：当配制的固体培养基pH 低于3.44时，其凝固性会受到灭菌温度、灭菌时间、琼脂量和 pH 值的影响。其中灭菌温度、灭菌时间与琼脂凝固性呈负相关，琼脂量、pH 值与琼脂凝固性呈正相关。杜永光，郝丽珍等[24]把培养基的凝固等级分为分0级(未凝固) 、1级(轻微晃动培养基即碎裂) 、2级(轻微晃动培养基不易碎裂) 、3 级(用力晃动培养基易碎裂) ，4级(用力晃动培养基不碎裂) 。杜永光的实验说明pH 和琼脂浓度共同影响培养基的凝固等级，pH 较低(≤4.0)时，pH 是影响凝固等级的主要因素，pH 较高(5.0~8.0)时，琼脂浓度是影响凝固等级的主要因素。有文献建议[27]：在用琼脂配制酸性(pH在6以下：如沙氏琼脂) 固体培养基时，必须在中性条件下进行加压灭菌，等灭菌完毕后再调节到所需的低pH 值。M.H. Norziah 等[28]，在研究琼脂和卡拉胶混合凝胶的粘弹性时发现，当凝胶的pH 小于4.5时，凝胶的粘弹性明显降低，凝胶变弱并且易碎。
pH 对培养基凝固的影响
植物组织培养是指在无菌条件下利用人工培养满足植物组织培养生长发育的需求。从广义上来说包括植物的一个器官、一颗种子、一个胚胎、一粒花粉、一个细胞，还包括去了细胞壁的原生质体的离体无菌培养，统称为植物组织培养。因此拥有几种不同水平的培养技术，即整体的、器官的、组织的、细胞的和原生质体的培养技术[29]。
植物组织培养是20世纪发展起来的以先进的生物技术为基础的新兴产业，被世人誉为农业发展史上的第四次绿色革命。在欧美、日本等发达国家和一些发展中的国家，都把植物组织培养技术用于商品种苗生产，大规模的植物工厂化生产技术已日益成熟，并在实际生产获得了巨大的经济效益[30]。
随着快繁技术的发展，组培技术逐渐商业化，更多的公司将需求组培技术作为坚强的后盾，植物组培中，培养基的好坏变得格外重要，目前对培养基凝固的研究还较少，而更多的需求将会刺激更多的研究。
2 材料与方法
2.1 实验器材
本次实验仪器由同人公司提供：烧杯（若干），1L 容量瓶，电磁炉，100mL 量筒，培养瓶，玻璃棒，照相机，镊子，解剖刀，酒精灯，托盘，10mL 移液管，1L 刻度瓷缸，FA1004型电子分析天平，JY10001电子天平，HR1724飞利浦搅拌机，YXQ.WF 21S-0.8卧式矩形压力蒸汽灭菌器，MJQ-102灭菌控制仪，PHS-P1型pH 计，SA-1600-2双人水平超净工作台，JZ-100-B 接种器具杀菌器等。
实验材料由同人公司提供的石斛TR7010。
2.2 实验药品
本次实验药品由同人公司提供：蒸馏水、去离子水、进口琼脂粉、蔗糖、土豆、邻苯二甲酸氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾；盐酸、氢氧化钠、吸水纸，酒精；
大量元素母液：KNO 3、NH 4NO 3、MgSO 4·7H 2O 、KH 2PO 4、CaCl 2·2H 2O ；
微量元素母液：MnSO 4·H 2O 、ZnSO 4·7H 2O 、H 3BO 3、KI 、NaMoO 4·2H 2O 、
CuSO 4·5H 2O 、CoCl 2·6H 2O ；
有机盐母液：烟酸（VB 3）、甘氨酸、VB 1、VB 6；
Fe 盐母液：Na 2-EDTA 、FeSO 4·7H 2O ；
肌醇母液：肌醇。
材料与方法
2.3 实验过程与步骤
2.3.1 pH计校正
缓冲液①（pH=4）配置：用FA1004型电子分析天平准确称量1.012g 邻苯二甲酸氢钾，于烧杯中用适量去离子水充分溶解。然后取一只100ml 的容量瓶，利用去离子水对其进行定容，摇匀备用。
缓冲液②（pH=7）配置：使用FA1004型电子分析天平准确称量0.3533g 磷酸氢二钠，0.3387g 磷酸二氢钾，于烧杯中用适量去离子水充分溶解。然后取一只100ml 的容量瓶，利用去离子水对其进行定容，摇匀备用。
校正定位：将pH 计的温度补偿选在标准缓冲溶液的温度，通常也就是环境温度；将电极泡在缓冲液②里几分钟，等数值稳定后，调节仪器定位，使数值显示为该温度下的pH 值，定位校正完成。
校正斜率：电极从缓冲液②中取出后用去离子水冲洗几次，用干净的吸水纸吸干水分，放入缓冲液①中几分钟，数值稳定后，调仪器斜率，使数值显示为该温度下的pH 值，斜率校正完成。
电极从缓冲液①中取出后用去离子水冲洗几次，校正完毕。
2.3.2 大量元素母液配制
用JY10001电子天平分别称量38g KNO3、33g NH4NO 3、7.4g MgSO4·7H 2O 、3.4g KH 2PO 4、8.8g CaCl2·2H 2O ，依次用适量去蒸馏水于烧杯中充分溶解。然后取一只1L 的容量瓶，利用蒸馏水对其进行定容，摇匀备用。在烧杯中溶解时必须使一种药品完全溶解再添加另一种药品，以下母液皆是如此。
2.3.3 微量元素母液配制
用FA1004型电子分析天平分别称量1.69g MnSO4·H 2O ，0.86g ZnSO4·7H 2O ，0.62g H 3BO 3，0.83g KI，0.025g NaMoO4·2H 2O ，0.0025g CuSO4·5H 2O ，0.0025g CoCl2·6H 2O ，依次用适量蒸馏水于烧杯中充分溶解。然后取一只1L 的容量瓶，利用蒸馏水对其进行定容，摇匀备用。
2.3.4 有机物母液配制
用FA1004型电子分析天平分别称量0.05 g烟酸（VB 3），0.02 g甘氨酸，0.01g VB1，
pH 对培养基凝固的影响
0.05g VB6；依次用适量去蒸馏水于烧杯中充分溶解。然后取一只1L 的容量瓶，利用蒸馏水对其进行定容，摇匀备用。
2.3.5 铁盐母液配制
用FA1004型电子分析分别称量3.73g Na2-EDTA ，2.78g FeSO4·7H 2O ；依次用适量去蒸馏水于烧杯中充分溶解。然后取一只1L 的容量瓶，利用蒸馏水对其进行定容，摇匀备用。
2.3.6 肌醇母液配制
用JY10001电子天平准确称量10g 肌醇，用适量去蒸馏水于烧杯中充分溶解。然后取一只1L 的容瓶，利用蒸馏水对其进行定容，摇匀备用。
2.3.7 MS培养基配制
在1L 刻度瓷缸中放入适量蒸馏水。然后依次取肌醇母液10ml ，微量元素母液10ml ，有机盐母液10ml ，Fe 盐母液10ml ，大量元素母液50ml 放入其中, 定容至1L 。接着用JY10001电子天平称量25g 蔗糖，6.5g 琼脂粉加入其中，搅拌均匀，再边搅拌边加入适量酸碱调节pH （本实验设置pH 梯度为3.8～5.8共6组），加热并搅拌均匀。将其分别灌装入13个培养瓶。标记为①号类培养基。并分别标记不同pH 的培养基。
2.3.8 含有土豆添加物的MS 培养基配制
洗净并称取70g 土豆，切成土豆粒。在搅拌机中加入适量蒸馏水，放入切好的土豆粒进行搅拌。将土豆汁倒入刻度瓷缸，再加入适量蒸馏水。然后依次取肌醇母液10ml ，微量元素母液10ml ，有机盐母液10ml ，Fe 盐母液10ml ，大量元素母液50ml 放入其中，定容至1L 。接着加入25g 蔗糖，6.5g 琼脂粉，加入适量酸碱调节pH ，加热并搅拌均匀。将其分别灌装入13个培养瓶。标记为②号类培养基。并分别标记不同pH 的培养基。
2.3.9 培养基灭菌
将①号类和②号类培养基一起放入YXQ.WF 21S-0.8卧式矩形压力蒸汽灭菌器中，调控MJQ-102灭菌控制仪，使锅内温度121℃，压强0.1MPa ，维持时间为20分
结果与分析
钟。灭菌完后，放置在冷凝室冷却。
2.3.10 观察并记录
将灭完菌的培养基放置一天，以让其完全冷却，观察培养基状态，并轻晃培养基观察。拍照记录。
2.3.11 接种试验凝固的培养基的强度并记录
将凝固的培养基拿入接种室，打开SA-1600-2双人水平超净工作台灯开关和风机，打开JZ-100-B 接种器具杀菌器。
带上乳胶手套，用75%的酒精擦拭工作台五个面，及接种器具（酒精灯，火机，铁架，装75%酒精的瓶，3把小刀，3把镊子）；将2把刀和2把镊子插入JZ-100-B 接种器具杀菌器，再将培养基瓶和装有TR7010型石斛的原材料瓶擦拭后放在工作台上。
点燃酒精灯，灼烧铁架上的铁丝5分钟，再将灭菌了的刀和镊子搁置铁架铁丝上，待刀和镊子冷却；把灭菌的牛皮纸放置在工作台上。
接着打开原材料瓶，用镊子夹出石斛放置在牛皮纸上，用刀和镊子分苗；再打开培养基瓶，用镊子将石斛夹住插入培养基，感受培养基的硬度。并记录。
3 结果与分析
3. 1 培养基形态的观察结果
将冷却的培养基拍照，见图1。
在①号类培养基中：
pH=3.8时为液态，见图1中①；
pH=4.2, 4.6时为稀糊状，见图1中②；
pH=5.0时为固态，见图1中③，但摇晃后破碎，出现④的情况；
pH=5.4, 5.8时为固态，见图1中⑤。
在②号类培养基中：
pH=3.8时为液态，见图1中①；
pH=4.2时为稀糊状，见图1中②；
pH=4.6时为固态，见图1中③，但摇晃后破碎，出现④的情况；
pH=5.0, 5.4, 5.8时为固态，见图中⑤，摇晃不破碎。
pH 对培养基凝固的影响
图1 各种pH 下的培养基形态
注：①为液态；②为稀糊状；③为固态，但摇晃后破碎成④；⑤为固态，摇晃不破碎。
琼脂的凝胶化主要是其琼脂糖之间氢键结合的结果，马云等[4]认为pH 影响琼脂凝胶特性还可能在于影响多糖分子之间氢键的形成。王泉等[26]实验结论也有pH 值与琼脂凝固性呈正相关。与我实验结果相符。图1中现①、②、③~④的情况，可能如马云等[4]的研究所说，酸性环境可能影响了琼脂多糖分子之间的形成，使培养基没有凝固，或者凝固不强。
结果与分析
3.2 培养基凝固强度试验结果
通过接种手感，在两类培养基中都是pH 值越高培养基更硬。而在相同pH 下的②号类培养基比①号类培养基硬。
①号类培养基中，pH 为5.4时硬度适中，pH 为5.8时偏硬；②号类培养基中，pH 为5.0时适中，pH 为5.4时偏硬，pH 为5.8时很硬。
将观察与接种试验所得结果记录如下表（表1）。从表中可以看到，随着pH 值的增加，两种培养基的凝固强度都是增加；一定pH 值下，添加了土豆的培养基凝固的比没加土豆的强度高。
但贾秀玲[25]研究认为培养基中加入营养成分对琼脂凝固无影响。这与我做的实验结果不同，可能是由于实验的一些内在和外在因素的影响。
表1 pH 对培养基凝固的影响
pH ①号类培养基
液态，完全不凝固，
图1中① ②号类培养基 液态完全不凝固； 图1中① 3.8
4.2 稀糊状，图1中② 稀糊状，图1中②
4.6 稀糊状，图1中② 凝固，图1中③；
摇晃破碎，图1中④
5.0 凝固，图1中③；
摇晃破碎，图1中④ 凝固，摇晃不破碎 图1中⑤；硬度适中
5.4 凝固，摇晃不破碎，
图1中⑤；硬度适中 凝固，摇晃不破碎， 图1中⑤；偏硬
5.8 凝固，摇晃不破碎，
图1中⑤；偏硬 凝固，摇晃不破碎 图1中⑤；很硬
pH 对培养基凝固的影响
4 讨论
本实验采用两种培养基，研究pH 对培养基凝固的影响，得出随着pH 值增长，培养基凝固更强；培养基中加入土豆，可能会使培养基凝固增强的结论。在灭菌前，MS 培养基pH 为5.4左右时最适宜组培接种；在添加了土豆的MS 培养基中，pH 为5.0左右时最适宜组培接种。虽然影响培养基的因素不仅仅只有pH ，但在其他条件相同下，改变一个变量，得出的结论还是有一定可信度的。
通过实验和查阅文献，我认为加入了天然添加物——土豆的培养基的凝固强度不好调控，可能是不可重复实验，因为，我们不能保证，每次添加的土豆的产地、品种、大小、生长时间和存储时间都相同；而这些因素就可能影响了每个土豆之间的成分或成分比例不相同。我认为要确定土豆对琼脂凝固是否有影响，先要研究清楚煮熟的土豆中所有的成分单独对琼脂凝固的是否有影响，然后找出影响因子。
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pH 对培养基凝固的影响
致谢
本实验及论文是在我的指导老师严寒老师的亲切关怀和悉心指导下完成的。此次论文工作让我收获了许多，培养了我的独立思考能力和实验操作能力，期间严老师给我许多细心的指导，和许多宝贵的实验经验从而避免我少走了很多弯路。在此谨向严老师致以崇高的敬意和诚挚的谢意。
此次实验是在江苏同人生物科技有限公司完成，衷心感谢同人公司为我实验提供所有器材药品及实验过程中给我的帮助。
签名:
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学 院（系）：
专 业 班 级：
学 生 姓 名：
指 导 教 师：
辅 导 教 师：
实 验 日 期： 毕业论文 pH 对培养基凝固的影响 生命科学学院 生物工程30701班 2010年11月至2011年06月
目 录
毕业论文任务书……………………………………………………………………Ⅰ 开题报告……………………………………………………………………………Ⅱ 指导教师审查意见…………………………………………………………………Ⅲ 评阅教师评语………………………………………………………………………Ⅳ 答辩会议记录………………………………………………………………………Ⅴ 中文摘要……………………………………………………………………………Ⅵ 外文摘要……………………………………………………………………………Ⅶ
1 前言 ..................................................................................................................................................... 1
1.1 固体培养基凝固剂——琼脂简介 . .......................................................................................... 1
1.2 研究的思路、目的及意义 . ...................................................................................................... 2
1.3 国内外的研究现状与发展趋势 . .............................................................................................. 3
2 材料与方法 ......................................................................................................................................... 4
2.1 实验器材 .................................................................................................................................. 4
2.3 实验过程与步骤 . ...................................................................................................................... 5
3 结果与分析 ....................................................................................................................................... 7
3.1 培养基形态的观察结果 . .......................................................................................................... 7
3.2 培养基凝固强度试验结果 . ...................................................................................................... 9
4 讨论 ................................................................................................................................................... 10
参考文献 ................................................................................................................................................. 10
致谢 ......................................................................................................................................................... 12
pH 对培养基凝固的影响
学 生： 生命科学学院
指导教师： 生命科学学院
[摘要] 在植物组织培养过程中，配制培养基是非常关键的一步。同人公司在平常配制培养基过程中常常出现培养基不凝固，或半凝固，或一摇晃培养基就破碎或者太硬。而培养基是整个组织培养中开头的一步，如果正常的培养基不足，会影响到整个组培过程的进度。本实验以调节培养基灭菌前的pH 值，来观察pH 对灭菌后培养基的影响。这将使公司日后更好的节约成本，更好的提高效率，更好的增长产量。笔者使用进口琼脂粉，定量6.5g/L，设pH 梯度为3.8-5.8共六组，进行一系列实验。通过实验，我观察到，在配制MS 培养基时，灭菌前培养基pH 为5.4时，在灭菌后，培养基凝固最适宜组培接种使用；在添加了土豆的MS 培养基中，pH 为5.0时，在灭菌后培养基最适宜组培接种使用。
[关键词] MS 培养基；琼脂；培养基凝固；pH ；影响
Effects of pH on Solidification of Culture Medium
Student: He Cao, College of Life Science, Yangtze University
Tutor: Yan Han , College of Life Science, Yangtze University
[Abstract] Preparation of Culture medium is a key step in plant tissue culture. In the normal, Culture medium often appears not solidification or semi-solidification, or broken of rock or too in TORUN. However, Culture medium is the beginning of the step in plant tissue culture and it will affect the progress of the whole process of tissue culture if the normal Culture medium is not enough. In this study, ordered to observe the pH effect on the Culture medium after sterilization through adjust the pH of Culture medium before sterilization. It could make cost savings, efficiency improved and production increased. Author use agar powder imports, quantitative 6.5g / L, and set six groups of pH gradient of
3.8-5.8 to conducted a series of experiments. Through the experiment, I observed, in the preparation of MS culture medium when Culture medium pH=5.4 before sterilization the Culture medium solidification with the most appropriate use of tissue culture inoculation after sterilization. And in the MS medium who add the potatoes, when pH=5.0, it most appropriate use of tissue culture inoculation after sterilization.
[Keywords] MS culture medium, agar, solidification of medium, pH, effects
前言
pH 对培养基凝固的影响
1 前言
1.1 固体培养基凝固剂——琼脂简介
在一般常态培养温度下呈固体状态的培养基都称固体培养基。固体培养基的凝固剂一般不是所培养生物的营养成分，只起固化或粘合作用。常见凝固剂有琼脂、明胶、无机硅胶等[1]。植物组织培养分为固体培养和液体培养两大类。固体培养最常用的凝固剂为琼脂[2]。
琼脂又名琼胶，俗称洋菜、冻粉，英文名称为Agar ，是由马来语Agar-Agar 略称而来。琼脂是从石花菜、江篱及紫菜等红藻类植物中提取而制成的一种藻胶[3]。其属于半乳糖的硫酸脂，含人体必需的碘、钙、铁、钠和镁等元素[4]。其多糖成分在人体内如同膳食纤维一样对肠道无刺激性，能促进肠道蠕动，有润肠功效[5]。此外，它还具有开胃健脾，止渴生津，促进人体新陈代谢和养颜驻容等功效，对高血压和肝炎还有一定的辅助治疗作用[6]。琼脂是常用的食品添加剂，广泛应用于肉制品、果冻、布丁各种饮料糖果、糕点和啤酒或米酒等中[7～10]。在添加琼脂的食品中，琼脂的功能特性与产品的质量紧密相关，例如：在肉糜制品中添加琼脂能明显改变肉制品的硬度、弹性和黏性，由于其能提高产品的保水性而明显提高产品的得率[4]。
琼脂是一种海藻多糖，其水解物的组成有40%的D-半乳糖、40%的3，6-失水L 半乳糖、3%硫酸酯和2%丙酮酸。实际上，它是琼脂胶和琼脂糖两种成分的混合物。琼脂胶是琼脂糖的硫酸酯，琼脂糖主要依靠氢键的引力，形成网状结构[11]。因此，琼脂糖凝胶的稳定性比那些以化学键交链而形成网状结构的凝固剂的稳定性要差一些
[12]。琼脂溶于热水而不溶于冷水，因此在配制培养基时需煮制琼脂。随着温度的升高，琼脂逐渐溶解，当温度下降到40℃时则开始凝固。0.7%～0.8%的琼脂水溶液在冷却后会很好凝固[13]。 配制培养基时应注意，由于各地生产的琼脂的质量不同，同样浓度的琼脂水溶液凝固后在硬度、透明度及色泽上会有所差异。劣质琼脂不仅凝固性差，而且带有很多杂质。
pH 对培养基凝固的影响
凝胶化是指线性高分子化合物由于分子间的交联反应，使反应体系粘度无限增大，而产生的凝胶现象。此时，体系中包含了两部分：一部分是凝胶，它具巨型网络结构，不溶于一切溶剂；另一部分是溶胶，其分子量较小，被笼罩在凝胶的网络结构中[14]。根据交联方式，凝胶可分为化学交联和物理交联两种[15]。化学交联是高分子链段间以共价键交联起来，这种交联很牢固，使高分子只发生溶胀，而不能熔融更不溶解。物理交联包括有氢键、库伦力、配位键及物理缠结等形成的线性分子间的交联
[16]。琼脂依靠高分子链段相互作用间可形成氢键而成为凝胶结构。这种氢键会因加热等而被破坏，使凝胶变为溶胶[17]。
琼脂的凝胶化主要是其琼脂糖之间氢键结合的结果，其含有的大量的水在网络结构稳定上发挥了重要的作用[18]。凝胶中水有几种状态存在，在高分子网络附近的水与网络有很强的相互作用。将紧挨着高分子网络的，在极低温度下也不冻结的水称为不冻水；而将在-10℃-20℃才冻结的水称为束缚水；离网络很远的水，显示与普通水同样的性质，称作自由水[16]。在溶胶状态，温度接近水沸点时，琼脂分子是一种随机卷曲状态。温度降至凝固点，在凝胶状态时，琼脂分子相互交联，形成三维网络结构，基本结构为左手双螺旋。沿着螺旋轴两侧有很大的空穴，使琼脂能结合足够多的水[19]。
琼脂的流变性变化是琼脂凝胶化过程中的一个重要特征。在温度高时，其流变行为与稀溶液中的聚合物流变行为相似；在温度低至凝固点以下时，流变行为像交联的聚合物。温度在溶胶和凝胶的变化过程中，流变性更为复杂。另外，琼脂的流变性受琼脂的浓度、分子量以及其它的物质（如甘油）的影响[20～22]。
1.2 研究的思路、目的及意义
本实验采用两种固体培养基配方，研究pH 值对这两种培养基凝固的影响。培养基作为植物组织培养必要因素，它的好坏直接关系到组织培养全过程。根据公司平常配制培养基的方法，然后利用酸碱调节培养基灭菌前的pH 值，然后灭菌。马云等[4]，研究表明琼脂浓度是影响凝胶硬度的显著因素，与改变离子强度和pH 相比，改变琼脂溶液的浓度是控制琼脂凝胶硬度的最有效方法。但同人生物科技有限公司（实验地点，以下简称同人公司）已经有人研究琼脂浓度对培养基凝固的影响，同人公司为了使平常所配制的培养基凝固程度有高度的稳定性。就选取了调节pH 来研究pH 值对培养基凝固的影响。
前言
MS 培养基是目前普遍使用的培养基。它可用来诱导愈伤组织，或用于胚、茎段、茎尖及花药培养。与其他培养基基本成分相比，MS 培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量较高，这是它的明显特点。这是目前应用最广泛的一种培养基[23]。同人公司也使用MS 培养基或其中加入天然添加物作为组织培养的培养基。
在植物组织培养过程中，配制培养基是非常关键的一步。同人公司在平常配制培养基过程中常常出现培养基不凝固，或半凝固，或一摇晃培养基就破碎的现象。而培养基是整个组织培养中开头的一步，如果正常的培养基不足，会导致整个组培过程的进度，影响公司正常运营，同时配制的培养基不合格会浪费资源和公司资产。所以同人公司对培养基的配制非常重视。杜永光等[24]，观察到培养基凝固程度受pH 影响较大。
因此，研究pH 对培养基凝固的影响是同人公司势在必行的项目，这将使公司日后可以更好的节约成本，更好的提高效率，更高的增长产值。
1.3 国内外的研究现状与发展趋势
目前国内外，研究培养基凝固的影响因素，主要是pH 、琼脂浓度、培养基成分，灭菌温度和时间，还有琼脂的质量。贾秀玲[25]研究了pH 对察氏培养基、马铃薯—葡萄糖琼脂培养基、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，另外还有不加任何营养物质的琼脂对照培养基的影响。贾秀玲的实验证明样品中添加营养成分对琼脂凝固性无影响，在琼脂含量为2%时影响琼脂凝固的主要因素为是pH 值，当pH 值低于4时，琼脂失去凝固能力。王泉，孙珮石等[26]，实验得出：当配制的固体培养基pH 低于3.44时，其凝固性会受到灭菌温度、灭菌时间、琼脂量和 pH 值的影响。其中灭菌温度、灭菌时间与琼脂凝固性呈负相关，琼脂量、pH 值与琼脂凝固性呈正相关。杜永光，郝丽珍等[24]把培养基的凝固等级分为分0级(未凝固) 、1级(轻微晃动培养基即碎裂) 、2级(轻微晃动培养基不易碎裂) 、3 级(用力晃动培养基易碎裂) ，4级(用力晃动培养基不碎裂) 。杜永光的实验说明pH 和琼脂浓度共同影响培养基的凝固等级，pH 较低(≤4.0)时，pH 是影响凝固等级的主要因素，pH 较高(5.0~8.0)时，琼脂浓度是影响凝固等级的主要因素。有文献建议[27]：在用琼脂配制酸性(pH在6以下：如沙氏琼脂) 固体培养基时，必须在中性条件下进行加压灭菌，等灭菌完毕后再调节到所需的低pH 值。M.H. Norziah 等[28]，在研究琼脂和卡拉胶混合凝胶的粘弹性时发现，当凝胶的pH 小于4.5时，凝胶的粘弹性明显降低，凝胶变弱并且易碎。
pH 对培养基凝固的影响
植物组织培养是指在无菌条件下利用人工培养满足植物组织培养生长发育的需求。从广义上来说包括植物的一个器官、一颗种子、一个胚胎、一粒花粉、一个细胞，还包括去了细胞壁的原生质体的离体无菌培养，统称为植物组织培养。因此拥有几种不同水平的培养技术，即整体的、器官的、组织的、细胞的和原生质体的培养技术[29]。
植物组织培养是20世纪发展起来的以先进的生物技术为基础的新兴产业，被世人誉为农业发展史上的第四次绿色革命。在欧美、日本等发达国家和一些发展中的国家，都把植物组织培养技术用于商品种苗生产，大规模的植物工厂化生产技术已日益成熟，并在实际生产获得了巨大的经济效益[30]。
随着快繁技术的发展，组培技术逐渐商业化，更多的公司将需求组培技术作为坚强的后盾，植物组培中，培养基的好坏变得格外重要，目前对培养基凝固的研究还较少，而更多的需求将会刺激更多的研究。
2 材料与方法
2.1 实验器材
本次实验仪器由同人公司提供：烧杯（若干），1L 容量瓶，电磁炉，100mL 量筒，培养瓶，玻璃棒，照相机，镊子，解剖刀，酒精灯，托盘，10mL 移液管，1L 刻度瓷缸，FA1004型电子分析天平，JY10001电子天平，HR1724飞利浦搅拌机，YXQ.WF 21S-0.8卧式矩形压力蒸汽灭菌器，MJQ-102灭菌控制仪，PHS-P1型pH 计，SA-1600-2双人水平超净工作台，JZ-100-B 接种器具杀菌器等。
实验材料由同人公司提供的石斛TR7010。
2.2 实验药品
本次实验药品由同人公司提供：蒸馏水、去离子水、进口琼脂粉、蔗糖、土豆、邻苯二甲酸氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾；盐酸、氢氧化钠、吸水纸，酒精；
大量元素母液：KNO 3、NH 4NO 3、MgSO 4·7H 2O 、KH 2PO 4、CaCl 2·2H 2O ；
微量元素母液：MnSO 4·H 2O 、ZnSO 4·7H 2O 、H 3BO 3、KI 、NaMoO 4·2H 2O 、
CuSO 4·5H 2O 、CoCl 2·6H 2O ；
有机盐母液：烟酸（VB 3）、甘氨酸、VB 1、VB 6；
Fe 盐母液：Na 2-EDTA 、FeSO 4·7H 2O ；
肌醇母液：肌醇。
材料与方法
2.3 实验过程与步骤
2.3.1 pH计校正
缓冲液①（pH=4）配置：用FA1004型电子分析天平准确称量1.012g 邻苯二甲酸氢钾，于烧杯中用适量去离子水充分溶解。然后取一只100ml 的容量瓶，利用去离子水对其进行定容，摇匀备用。
缓冲液②（pH=7）配置：使用FA1004型电子分析天平准确称量0.3533g 磷酸氢二钠，0.3387g 磷酸二氢钾，于烧杯中用适量去离子水充分溶解。然后取一只100ml 的容量瓶，利用去离子水对其进行定容，摇匀备用。
校正定位：将pH 计的温度补偿选在标准缓冲溶液的温度，通常也就是环境温度；将电极泡在缓冲液②里几分钟，等数值稳定后，调节仪器定位，使数值显示为该温度下的pH 值，定位校正完成。
校正斜率：电极从缓冲液②中取出后用去离子水冲洗几次，用干净的吸水纸吸干水分，放入缓冲液①中几分钟，数值稳定后，调仪器斜率，使数值显示为该温度下的pH 值，斜率校正完成。
电极从缓冲液①中取出后用去离子水冲洗几次，校正完毕。
2.3.2 大量元素母液配制
用JY10001电子天平分别称量38g KNO3、33g NH4NO 3、7.4g MgSO4·7H 2O 、3.4g KH 2PO 4、8.8g CaCl2·2H 2O ，依次用适量去蒸馏水于烧杯中充分溶解。然后取一只1L 的容量瓶，利用蒸馏水对其进行定容，摇匀备用。在烧杯中溶解时必须使一种药品完全溶解再添加另一种药品，以下母液皆是如此。
2.3.3 微量元素母液配制
用FA1004型电子分析天平分别称量1.69g MnSO4·H 2O ，0.86g ZnSO4·7H 2O ，0.62g H 3BO 3，0.83g KI，0.025g NaMoO4·2H 2O ，0.0025g CuSO4·5H 2O ，0.0025g CoCl2·6H 2O ，依次用适量蒸馏水于烧杯中充分溶解。然后取一只1L 的容量瓶，利用蒸馏水对其进行定容，摇匀备用。
2.3.4 有机物母液配制
用FA1004型电子分析天平分别称量0.05 g烟酸（VB 3），0.02 g甘氨酸，0.01g VB1，
pH 对培养基凝固的影响
0.05g VB6；依次用适量去蒸馏水于烧杯中充分溶解。然后取一只1L 的容量瓶，利用蒸馏水对其进行定容，摇匀备用。
2.3.5 铁盐母液配制
用FA1004型电子分析分别称量3.73g Na2-EDTA ，2.78g FeSO4·7H 2O ；依次用适量去蒸馏水于烧杯中充分溶解。然后取一只1L 的容量瓶，利用蒸馏水对其进行定容，摇匀备用。
2.3.6 肌醇母液配制
用JY10001电子天平准确称量10g 肌醇，用适量去蒸馏水于烧杯中充分溶解。然后取一只1L 的容瓶，利用蒸馏水对其进行定容，摇匀备用。
2.3.7 MS培养基配制
在1L 刻度瓷缸中放入适量蒸馏水。然后依次取肌醇母液10ml ，微量元素母液10ml ，有机盐母液10ml ，Fe 盐母液10ml ，大量元素母液50ml 放入其中, 定容至1L 。接着用JY10001电子天平称量25g 蔗糖，6.5g 琼脂粉加入其中，搅拌均匀，再边搅拌边加入适量酸碱调节pH （本实验设置pH 梯度为3.8～5.8共6组），加热并搅拌均匀。将其分别灌装入13个培养瓶。标记为①号类培养基。并分别标记不同pH 的培养基。
2.3.8 含有土豆添加物的MS 培养基配制
洗净并称取70g 土豆，切成土豆粒。在搅拌机中加入适量蒸馏水，放入切好的土豆粒进行搅拌。将土豆汁倒入刻度瓷缸，再加入适量蒸馏水。然后依次取肌醇母液10ml ，微量元素母液10ml ，有机盐母液10ml ，Fe 盐母液10ml ，大量元素母液50ml 放入其中，定容至1L 。接着加入25g 蔗糖，6.5g 琼脂粉，加入适量酸碱调节pH ，加热并搅拌均匀。将其分别灌装入13个培养瓶。标记为②号类培养基。并分别标记不同pH 的培养基。
2.3.9 培养基灭菌
将①号类和②号类培养基一起放入YXQ.WF 21S-0.8卧式矩形压力蒸汽灭菌器中，调控MJQ-102灭菌控制仪，使锅内温度121℃，压强0.1MPa ，维持时间为20分
结果与分析
钟。灭菌完后，放置在冷凝室冷却。
2.3.10 观察并记录
将灭完菌的培养基放置一天，以让其完全冷却，观察培养基状态，并轻晃培养基观察。拍照记录。
2.3.11 接种试验凝固的培养基的强度并记录
将凝固的培养基拿入接种室，打开SA-1600-2双人水平超净工作台灯开关和风机，打开JZ-100-B 接种器具杀菌器。
带上乳胶手套，用75%的酒精擦拭工作台五个面，及接种器具（酒精灯，火机，铁架，装75%酒精的瓶，3把小刀，3把镊子）；将2把刀和2把镊子插入JZ-100-B 接种器具杀菌器，再将培养基瓶和装有TR7010型石斛的原材料瓶擦拭后放在工作台上。
点燃酒精灯，灼烧铁架上的铁丝5分钟，再将灭菌了的刀和镊子搁置铁架铁丝上，待刀和镊子冷却；把灭菌的牛皮纸放置在工作台上。
接着打开原材料瓶，用镊子夹出石斛放置在牛皮纸上，用刀和镊子分苗；再打开培养基瓶，用镊子将石斛夹住插入培养基，感受培养基的硬度。并记录。
3 结果与分析
3. 1 培养基形态的观察结果
将冷却的培养基拍照，见图1。
在①号类培养基中：
pH=3.8时为液态，见图1中①；
pH=4.2, 4.6时为稀糊状，见图1中②；
pH=5.0时为固态，见图1中③，但摇晃后破碎，出现④的情况；
pH=5.4, 5.8时为固态，见图1中⑤。
在②号类培养基中：
pH=3.8时为液态，见图1中①；
pH=4.2时为稀糊状，见图1中②；
pH=4.6时为固态，见图1中③，但摇晃后破碎，出现④的情况；
pH=5.0, 5.4, 5.8时为固态，见图中⑤，摇晃不破碎。
pH 对培养基凝固的影响
图1 各种pH 下的培养基形态
注：①为液态；②为稀糊状；③为固态，但摇晃后破碎成④；⑤为固态，摇晃不破碎。
琼脂的凝胶化主要是其琼脂糖之间氢键结合的结果，马云等[4]认为pH 影响琼脂凝胶特性还可能在于影响多糖分子之间氢键的形成。王泉等[26]实验结论也有pH 值与琼脂凝固性呈正相关。与我实验结果相符。图1中现①、②、③~④的情况，可能如马云等[4]的研究所说，酸性环境可能影响了琼脂多糖分子之间的形成，使培养基没有凝固，或者凝固不强。
结果与分析
3.2 培养基凝固强度试验结果
通过接种手感，在两类培养基中都是pH 值越高培养基更硬。而在相同pH 下的②号类培养基比①号类培养基硬。
①号类培养基中，pH 为5.4时硬度适中，pH 为5.8时偏硬；②号类培养基中，pH 为5.0时适中，pH 为5.4时偏硬，pH 为5.8时很硬。
将观察与接种试验所得结果记录如下表（表1）。从表中可以看到，随着pH 值的增加，两种培养基的凝固强度都是增加；一定pH 值下，添加了土豆的培养基凝固的比没加土豆的强度高。
但贾秀玲[25]研究认为培养基中加入营养成分对琼脂凝固无影响。这与我做的实验结果不同，可能是由于实验的一些内在和外在因素的影响。
表1 pH 对培养基凝固的影响
pH ①号类培养基
液态，完全不凝固，
图1中① ②号类培养基 液态完全不凝固； 图1中① 3.8
4.2 稀糊状，图1中② 稀糊状，图1中②
4.6 稀糊状，图1中② 凝固，图1中③；
摇晃破碎，图1中④
5.0 凝固，图1中③；
摇晃破碎，图1中④ 凝固，摇晃不破碎 图1中⑤；硬度适中
5.4 凝固，摇晃不破碎，
图1中⑤；硬度适中 凝固，摇晃不破碎， 图1中⑤；偏硬
5.8 凝固，摇晃不破碎，
图1中⑤；偏硬 凝固，摇晃不破碎 图1中⑤；很硬
pH 对培养基凝固的影响
4 讨论
本实验采用两种培养基，研究pH 对培养基凝固的影响，得出随着pH 值增长，培养基凝固更强；培养基中加入土豆，可能会使培养基凝固增强的结论。在灭菌前，MS 培养基pH 为5.4左右时最适宜组培接种；在添加了土豆的MS 培养基中，pH 为5.0左右时最适宜组培接种。虽然影响培养基的因素不仅仅只有pH ，但在其他条件相同下，改变一个变量，得出的结论还是有一定可信度的。
通过实验和查阅文献，我认为加入了天然添加物——土豆的培养基的凝固强度不好调控，可能是不可重复实验，因为，我们不能保证，每次添加的土豆的产地、品种、大小、生长时间和存储时间都相同；而这些因素就可能影响了每个土豆之间的成分或成分比例不相同。我认为要确定土豆对琼脂凝固是否有影响，先要研究清楚煮熟的土豆中所有的成分单独对琼脂凝固的是否有影响，然后找出影响因子。
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pH 对培养基凝固的影响
致谢
本实验及论文是在我的指导老师严寒老师的亲切关怀和悉心指导下完成的。此次论文工作让我收获了许多，培养了我的独立思考能力和实验操作能力，期间严老师给我许多细心的指导，和许多宝贵的实验经验从而避免我少走了很多弯路。在此谨向严老师致以崇高的敬意和诚挚的谢意。
此次实验是在江苏同人生物科技有限公司完成，衷心感谢同人公司为我实验提供所有器材药品及实验过程中给我的帮助。
签名:
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