基因组测序技术

第4章基因组测序技术

基因组测序

技术进展

DNA复制

DNA的复制为半保留复制。由于DNA单链复制延伸时只能以核苷酸单体的5’-磷酸基团与前一个核苷酸的3’-羟基缩合生成磷酸酯键。因此DNA复制是以5’3’方式进行。

DNA

聚合酶

I

一个理想的链终止法测序DNA聚合酶应该具有以下特点：

1）复制时可有效掺入双

脱氧核苷酸（ddNTP）或其它修饰类似物（如荧光标记）；

2）具有较高的加工性能3）在缺少外切核酸酶活

性时仍然具有很高的保真度；

4）能产生清晰的一致的

信号用于读序。

天然DNA聚合酶不能直接

用于DNA测序，必须进行改造。

测序用DNA测序用DNA聚合酶聚合酶

DNA聚合酶加工性能（processivity）：系指在使用同一引物时DNA聚合

酶在不离开DNA模板时所能掺入的最多核苷酸数目。

1）Klenow(E.coliDNA聚合酶片段)：加工性能低（15 nt），具3’ –

5’外切核酸酶活性；已经很少使用

2）T7 DNA Pol: 需硫氧还蛋白辅助，加工性能达800 nt，具3’ –5’外切

核酸酶活性，保真度高；常规测序

3）TaqDNA Pol: 耐热聚合酶（最适温度72OC，100 nt/sec），具3’ –5’

和5’ –3’外切核酸酶活性，错配率1/9 000，合成3’ -端具A突出；PCR测序

4) PfuDNA Pol: 耐热聚合酶（最适温度72OC，10 nt/sec），具3’ –

5’和5’ –3’外切核酸酶活性，保真度高，错配率1.3/106，3’ -平端，加工性能差；辅助PCR测序

目前普遍采用的测序酶为T7 DNA聚合酶的改造型T7 Sequenase和改造型

TaqDNA Pol。

大肠杆菌DNA大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶II和T7 DNAT7 DNA聚合酶聚合酶

T7 DNA聚合酶T7 DNA聚合酶

噬菌体T7 DNA聚合酶

的特点如下：1）T7 DNA聚合酶的体内活性需要硫氧还蛋白，可提高T7 Pol加工性能100倍, 从一次延伸数个nt到一次延伸800 nt；2T7 DNA聚合酶缺少5’ –3’外切核酸酶活性；3）T7 DNA聚合酶具有很强的单链和双链DNA 3’ –5’外切核酸酶活性，这一活性受EDTA，还原剂及铁离子等影响。商品T7 DNA聚合酶含两个亚基：gp5和硫氧还蛋白，从克隆工程菌制备。

T7 DNA聚合酶结构简单，复制效率好于大肠杆菌DNA聚合酶I（DNA polymerase I）的Klenow片断，后者加工性能只有15nt。AMV逆转录酶可达200nt, 但复制速率太低，每秒仅延伸数个核苷酸。此外，T7 DNA聚合酶最大的优点是不排斥ddNTP,适合Sanger法测序。

TaqDNA聚合酶DNA聚合酶

TaqDNA聚合酶是

从栖热水生菌中分离的可耐受高温的DNA聚合酶。该酶在720C保温30 min后丧失活性10%，950C保温30 min活性丧失50%。TaqDNA聚合酶具有5’ –3’ 和5’ –3’ 外切核酸酶活性，错配率：T/G,10-3；A/A, 10-6。

保真度为1/9 000。该酶排斥ddNTP。

测序用DNADNA聚合酶的改造聚合酶的改造

1）T7 DNA Pol: 消除3’-5’ 外切核酸酶活性，可提高产生一致性清晰条带的能力；

2）TaqDNA Pol: 消除排斥ddNTP的倾向，提

高合成效率。

T7 DNA聚合酶T7 DNA聚合酶改造

T7 DNA聚合酶用于

Sanger法测序的一个阻碍是其3’ –5’外切核酸酶活性，在dNTP溶度降低时会干扰测序甚至降解

DNA。通过突变去除天然T7 DNA聚合酶外切核酸酶活性结构域中28个氨基酸可使3’ –5’外切核酸酶活性丢失，不影响其聚合酶功能，但保真度降低。这个修饰的TaqDNA Pol称为SequenaseVersion 2.0,即T7 2版测序酶。

耐热Taq耐热TaqDNA聚合DNA聚合酶的改造

耐热性DNA聚合酶在PCR循环测序中有特别的优势，但有排斥ddNTP的倾向，可达10 000倍。这一特点决定于DNA聚合酶中的单个氨基酸

（T7, 526F苯丙氨酸; DNAPolI, Y762，酪氨酸; Taq, F667）。更换这一氨基酸，可消除聚合酶对ddNTP的排斥倾向。

注：聚合酶O螺旋位置酪氨酸排斥ddNTP

第一代DNA测序

第一代DNA测序的特点：

1）间断测序（双脱氧核苷酸）2）单一测序（单一模板DNA）3）携带标记（同位素或荧光）4）限长测序（长度有限）

Sanger

测序法

原理

Sanger测序法---单一标记，分组反应及读序

第一代DNA测序的原理是依据Sanger设计的双脱氧核苷酸渗入法，必须同时分别进行4组反应。每组反

应中都有一种不同的用32P同位素标记的双脱氧核苷酸加入DNA复制单个反应液。终止反应双脱氧核苷酸的位置可以通过测序凝胶DNA电泳检测，经X-光片曝光显示。根据每个泳道相邻的碱基条带推测DNA序列。

荧光标记

-

同组反应

双脱氧核苷酸的荧光标记技术对实现DNA的自动化测序具有非常重要的意义。由于不同的4种双脱氧核苷酸可用不同颜色的荧光物质标记，因而在同一组反应中，不同颜色的荧光标记核苷酸可以渗入到相应的测序位置。通过检测仪分辨荧光的颜色，即可判读碱基序列

毛细管电

泳测序

A. 一束并列的充满凝胶的用于DNA测序的毛细管。B.共聚焦荧光扫描显微镜，可将核苷酸的荧光标记信号放大并由计算机读取碱基序列，完成自动化测序。

Nature Biotechnology 30：434–439，2012

第二代DNA测序

第二代DNA测序的特点：1）连续测序（焦磷酸反应）2）平行测序（芯片设计）3）自动化测序（荧光判读）4）高通量测序（达到Gb级）

焦磷酸测序-pyrosequencing

Science 281：363-365，1998

焦磷酸测序技术是一种新的实时DNA测序技术。它在DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用

下，使引物延伸聚合脱氧核糖核酸。dNTP释放焦磷酸PPi、PPi转换为三磷酸腺苷（ATP）、ATP在荧光素酶作用下催化荧光素磷酸化，随后发生氧化反应放出荧光。如果掺入的dNTP与模板DNA碱基不配对，则不发生反应。当掺入dNTP时，仪器可自动记录，判读掺入的碱基。454测序仪每次的测序长度最高达400-500 bp，平均为100 bp

DNA

模板制备-磁珠与乳化液

第二代DNA测序模板制备a) 基因组DNA在打断之后尽可能稀释，达到每

液滴含一个DNA。b) 给DNA片段加上接头，连接到磁珠上。c)制备悬浮乳液，每个液滴含PCR单克隆

DNA。d) 将乳液加热使DNA变性成单链，使单个液滴含单个磁珠。e) 携带PCR扩增的DNA模板磁珠。f)反应槽中引物起始DNA测序。Nature 437：376-80，2005

第二代DNA测

序装置

第二代DNA测序装置由3

个主要部件组成：a) 4个核苷酸供应池，分别盛有A,T,C, G，通过输送管与芯片连接。b) 芯片反应槽板每个小槽中含有携带DNA模板的磁珠。c) 成像判读装置，包括摄像头，计算机与可视频幕。

第二代

DNA测序

实时连续测序第二代DNA测序是实时连续测序。如果掺入的碱基正确配对，测序反应槽会发出荧光，仪器将记录掺入的核苷酸。如果连续掺入的核苷酸是相同的，则会发生等摩尔倍数亮度的荧光。参照设立

的对照，计算机可正确记录测序的碱基数。

第二代DNA

测序

效率与

准确度第二代DNA测序结合了芯片技术，在60x60毫米的芯片上含有160万个反应槽，完成2.5x107碱基测序。每个小槽含一个磁珠，直径约28 um ，可携带1000万个DNA模板，产生足够的荧光供检测分辨。每个反应槽，可平行测序。每轮4次加样，依次为A, T, C, G。一次测序执行44轮总计约156次反应，最高测序量达4-6亿bp。根据统计，二代测

序的平均长度为109.9 bp, 精确度为98%。

Nature 437：376-80，2005

第三代DNA测序

第三代DNA测序的主要特征可以归结为单分子测序（single -molecule sequencing，SMS），包括三种技术路线：

1）基于单分子DNA合成的实时测序（single-molecule real-time sequencing）；

2）纳米孔单分子DNA电流阻遏(current blockage)测序3）纳米孔单分子DNA碱基序列的电子阅读。目前单分子DNA测序技术总体上极不成熟。

纳米

孔

蛋白

纳米孔蛋白α-HL（A）和MspA(B)均为跨膜蛋白MspA的收缩孔道直径为1.3nm，比α-HL的孔道更宽，但孔道的长度更短。此外MspA上部的空腔空间更大，这一构型使其可容纳更多的溶液。DNA分子直径约1 nm

, 进入纳米孔蛋白内腔后，在离子电流作用下穿越收缩区纳米孔狭道（C），引起离子电流改变。箭头为DNA分子运动方向。当单链DNA分子通过纳米孔道时，由于碱基会对电流产生阻遏引起电流数值的变化，可据此判别碱基的组成。Nat Biotechnol30: 326–328，2012

固

相

纳

米

孔

硅片上放置一层极薄的碳膜，中间留出纳米孔道。纳米孔道两侧的碳薄膜与电极相连，通过横向电流

的监测识别逐个移动的单分子DNA中的碱基。上下位置的电极用于推动溶液中的DNA单分子沿纳米孔移动。Ib和It：记录瞬时电流参数。Nanotechnology 23:268-296, 2012

单分子DNA测序的难点实现单分子DNA的电子阅读必须克服一系列的技术难点, 主要涉及:

1) 建立适合纳米孔单分子DNA测序的平台; 2) 确定识别单分子DNA序列的技术参数; 3) 控制单分子DNA在纳米孔道中的移动速度, 便于电子阅读与记录。

谢谢!

第4章基因组测序技术

基因组测序

技术进展

DNA复制

DNA的复制为半保留复制。由于DNA单链复制延伸时只能以核苷酸单体的5’-磷酸基团与前一个核苷酸的3’-羟基缩合生成磷酸酯键。因此DNA复制是以5’3’方式进行。

DNA

聚合酶

I

一个理想的链终止法测序DNA聚合酶应该具有以下特点：

1）复制时可有效掺入双

脱氧核苷酸（ddNTP）或其它修饰类似物（如荧光标记）；

2）具有较高的加工性能3）在缺少外切核酸酶活

性时仍然具有很高的保真度；

4）能产生清晰的一致的

信号用于读序。

天然DNA聚合酶不能直接

用于DNA测序，必须进行改造。

测序用DNA测序用DNA聚合酶聚合酶

DNA聚合酶加工性能（processivity）：系指在使用同一引物时DNA聚合

酶在不离开DNA模板时所能掺入的最多核苷酸数目。

1）Klenow(E.coliDNA聚合酶片段)：加工性能低（15 nt），具3’ –

5’外切核酸酶活性；已经很少使用

2）T7 DNA Pol: 需硫氧还蛋白辅助，加工性能达800 nt，具3’ –5’外切

核酸酶活性，保真度高；常规测序

3）TaqDNA Pol: 耐热聚合酶（最适温度72OC，100 nt/sec），具3’ –5’

和5’ –3’外切核酸酶活性，错配率1/9 000，合成3’ -端具A突出；PCR测序

4) PfuDNA Pol: 耐热聚合酶（最适温度72OC，10 nt/sec），具3’ –

5’和5’ –3’外切核酸酶活性，保真度高，错配率1.3/106，3’ -平端，加工性能差；辅助PCR测序

目前普遍采用的测序酶为T7 DNA聚合酶的改造型T7 Sequenase和改造型

TaqDNA Pol。

大肠杆菌DNA大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶II和T7 DNAT7 DNA聚合酶聚合酶

T7 DNA聚合酶T7 DNA聚合酶

噬菌体T7 DNA聚合酶

的特点如下：1）T7 DNA聚合酶的体内活性需要硫氧还蛋白，可提高T7 Pol加工性能100倍, 从一次延伸数个nt到一次延伸800 nt；2T7 DNA聚合酶缺少5’ –3’外切核酸酶活性；3）T7 DNA聚合酶具有很强的单链和双链DNA 3’ –5’外切核酸酶活性，这一活性受EDTA，还原剂及铁离子等影响。商品T7 DNA聚合酶含两个亚基：gp5和硫氧还蛋白，从克隆工程菌制备。

T7 DNA聚合酶结构简单，复制效率好于大肠杆菌DNA聚合酶I（DNA polymerase I）的Klenow片断，后者加工性能只有15nt。AMV逆转录酶可达200nt, 但复制速率太低，每秒仅延伸数个核苷酸。此外，T7 DNA聚合酶最大的优点是不排斥ddNTP,适合Sanger法测序。

TaqDNA聚合酶DNA聚合酶

TaqDNA聚合酶是

从栖热水生菌中分离的可耐受高温的DNA聚合酶。该酶在720C保温30 min后丧失活性10%，950C保温30 min活性丧失50%。TaqDNA聚合酶具有5’ –3’ 和5’ –3’ 外切核酸酶活性，错配率：T/G,10-3；A/A, 10-6。

保真度为1/9 000。该酶排斥ddNTP。

测序用DNADNA聚合酶的改造聚合酶的改造

1）T7 DNA Pol: 消除3’-5’ 外切核酸酶活性，可提高产生一致性清晰条带的能力；

2）TaqDNA Pol: 消除排斥ddNTP的倾向，提

高合成效率。

T7 DNA聚合酶T7 DNA聚合酶改造

T7 DNA聚合酶用于

Sanger法测序的一个阻碍是其3’ –5’外切核酸酶活性，在dNTP溶度降低时会干扰测序甚至降解

DNA。通过突变去除天然T7 DNA聚合酶外切核酸酶活性结构域中28个氨基酸可使3’ –5’外切核酸酶活性丢失，不影响其聚合酶功能，但保真度降低。这个修饰的TaqDNA Pol称为SequenaseVersion 2.0,即T7 2版测序酶。

耐热Taq耐热TaqDNA聚合DNA聚合酶的改造

耐热性DNA聚合酶在PCR循环测序中有特别的优势，但有排斥ddNTP的倾向，可达10 000倍。这一特点决定于DNA聚合酶中的单个氨基酸

（T7, 526F苯丙氨酸; DNAPolI, Y762，酪氨酸; Taq, F667）。更换这一氨基酸，可消除聚合酶对ddNTP的排斥倾向。

注：聚合酶O螺旋位置酪氨酸排斥ddNTP

第一代DNA测序

第一代DNA测序的特点：

1）间断测序（双脱氧核苷酸）2）单一测序（单一模板DNA）3）携带标记（同位素或荧光）4）限长测序（长度有限）

Sanger

测序法

原理

Sanger测序法---单一标记，分组反应及读序

第一代DNA测序的原理是依据Sanger设计的双脱氧核苷酸渗入法，必须同时分别进行4组反应。每组反

应中都有一种不同的用32P同位素标记的双脱氧核苷酸加入DNA复制单个反应液。终止反应双脱氧核苷酸的位置可以通过测序凝胶DNA电泳检测，经X-光片曝光显示。根据每个泳道相邻的碱基条带推测DNA序列。

荧光标记

-

同组反应

双脱氧核苷酸的荧光标记技术对实现DNA的自动化测序具有非常重要的意义。由于不同的4种双脱氧核苷酸可用不同颜色的荧光物质标记，因而在同一组反应中，不同颜色的荧光标记核苷酸可以渗入到相应的测序位置。通过检测仪分辨荧光的颜色，即可判读碱基序列

毛细管电

泳测序

A. 一束并列的充满凝胶的用于DNA测序的毛细管。B.共聚焦荧光扫描显微镜，可将核苷酸的荧光标记信号放大并由计算机读取碱基序列，完成自动化测序。

Nature Biotechnology 30：434–439，2012

第二代DNA测序

第二代DNA测序的特点：1）连续测序（焦磷酸反应）2）平行测序（芯片设计）3）自动化测序（荧光判读）4）高通量测序（达到Gb级）

焦磷酸测序-pyrosequencing

Science 281：363-365，1998

焦磷酸测序技术是一种新的实时DNA测序技术。它在DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用

下，使引物延伸聚合脱氧核糖核酸。dNTP释放焦磷酸PPi、PPi转换为三磷酸腺苷（ATP）、ATP在荧光素酶作用下催化荧光素磷酸化，随后发生氧化反应放出荧光。如果掺入的dNTP与模板DNA碱基不配对，则不发生反应。当掺入dNTP时，仪器可自动记录，判读掺入的碱基。454测序仪每次的测序长度最高达400-500 bp，平均为100 bp

DNA

模板制备-磁珠与乳化液

第二代DNA测序模板制备a) 基因组DNA在打断之后尽可能稀释，达到每

液滴含一个DNA。b) 给DNA片段加上接头，连接到磁珠上。c)制备悬浮乳液，每个液滴含PCR单克隆

DNA。d) 将乳液加热使DNA变性成单链，使单个液滴含单个磁珠。e) 携带PCR扩增的DNA模板磁珠。f)反应槽中引物起始DNA测序。Nature 437：376-80，2005

第二代DNA测

序装置

第二代DNA测序装置由3

个主要部件组成：a) 4个核苷酸供应池，分别盛有A,T,C, G，通过输送管与芯片连接。b) 芯片反应槽板每个小槽中含有携带DNA模板的磁珠。c) 成像判读装置，包括摄像头，计算机与可视频幕。

第二代

DNA测序

实时连续测序第二代DNA测序是实时连续测序。如果掺入的碱基正确配对，测序反应槽会发出荧光，仪器将记录掺入的核苷酸。如果连续掺入的核苷酸是相同的，则会发生等摩尔倍数亮度的荧光。参照设立

的对照，计算机可正确记录测序的碱基数。

第二代DNA

测序

效率与

准确度第二代DNA测序结合了芯片技术，在60x60毫米的芯片上含有160万个反应槽，完成2.5x107碱基测序。每个小槽含一个磁珠，直径约28 um ，可携带1000万个DNA模板，产生足够的荧光供检测分辨。每个反应槽，可平行测序。每轮4次加样，依次为A, T, C, G。一次测序执行44轮总计约156次反应，最高测序量达4-6亿bp。根据统计，二代测

序的平均长度为109.9 bp, 精确度为98%。

Nature 437：376-80，2005

第三代DNA测序

第三代DNA测序的主要特征可以归结为单分子测序（single -molecule sequencing，SMS），包括三种技术路线：

1）基于单分子DNA合成的实时测序（single-molecule real-time sequencing）；

2）纳米孔单分子DNA电流阻遏(current blockage)测序3）纳米孔单分子DNA碱基序列的电子阅读。目前单分子DNA测序技术总体上极不成熟。

纳米

孔

蛋白

纳米孔蛋白α-HL（A）和MspA(B)均为跨膜蛋白MspA的收缩孔道直径为1.3nm，比α-HL的孔道更宽，但孔道的长度更短。此外MspA上部的空腔空间更大，这一构型使其可容纳更多的溶液。DNA分子直径约1 nm

, 进入纳米孔蛋白内腔后，在离子电流作用下穿越收缩区纳米孔狭道（C），引起离子电流改变。箭头为DNA分子运动方向。当单链DNA分子通过纳米孔道时，由于碱基会对电流产生阻遏引起电流数值的变化，可据此判别碱基的组成。Nat Biotechnol30: 326–328，2012

固

相

纳

米

孔

硅片上放置一层极薄的碳膜，中间留出纳米孔道。纳米孔道两侧的碳薄膜与电极相连，通过横向电流

的监测识别逐个移动的单分子DNA中的碱基。上下位置的电极用于推动溶液中的DNA单分子沿纳米孔移动。Ib和It：记录瞬时电流参数。Nanotechnology 23:268-296, 2012

单分子DNA测序的难点实现单分子DNA的电子阅读必须克服一系列的技术难点, 主要涉及:

1) 建立适合纳米孔单分子DNA测序的平台; 2) 确定识别单分子DNA序列的技术参数; 3) 控制单分子DNA在纳米孔道中的移动速度, 便于电子阅读与记录。

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