现代生物医学进展www.shengwuyixue.com Progress in Modern Biomedicine Vol.14NO.1JAN.2014
·31·
DOI:10.13241/j.cnki.pmb.2014.01.007
煮沸裂解法和试剂盒法提取浸矿菌基因组DNA 的比较*
夏乐先1孙文娟1沈
振1梁昱婷1柳建设1陈建华2邱冠周1
(1中南大学资源加工与生物工程学院湖南长沙410083；2中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院湖南长沙410083)
摘要目的：在生物浸出中，微生物群落结构分析有着重要意义，而群落分析的基础是提取纯度高、损失少的基因组DNA 。为了解决这一问题，本实验通过比较两种较常用的DNA 提取方法，煮沸裂解法和试剂盒法，寻找一种灵敏、快速、经济实用的制备浸矿细菌基因组DNA 的方法。方法：分别用煮沸裂解法和试剂盒法提取6种浸矿菌的基因组DNA ，从所提取的基因组DNA 浓度、纯度、回收率和对PCR 扩增反应的影响方面比较了两种方法的提取效果；用两种方法来处理不同浓度梯度的一种菌，通过实时定量PCR 来比较两种方法的灵敏性。结果：相同处理量（108个）的革兰氏阳性菌（1株）、革兰氏阴性菌（4株）、古菌（1株）经两种方法提取的基因组DNA 差异较大，煮沸裂解法所得的6组基因组DNA 更纯，其OD260/OD280的值更接近1.8-2.0（纯DNA 的OD260/OD280在1.8-2.0之间），前者所提DNA 回收率最大可达后者的16.7倍；煮沸裂解法只需较少菌（102个）便能让实时定量PCR 检测到所提DNA 模板浓度，比试剂盒法灵敏。结论：两种方法提取的基因组DNA 均可用于后续的PCR 扩增，此外，前者提取的DNA 浓度随细菌浓度增加而呈线性增大，而后者随菌浓度增大，所提DNA 量增加有限，因此，在生物浸出中微生物基因组DNA 的提取可直接采用简单快速的煮沸提取法，为实验节约成本和时间。关键词：煮沸裂解法；试剂盒法；浸矿细菌；聚合酶链反应；实时荧光定量PCR Q93-3文献标识码：A 文章编号：1673-627301-31-05中图分类号：（2014）
Comparison of Genomic DNA Extraction from Bioleaching Acidophiles
by Two Methods:Boiling and Kit Methods*
XIA Le-xian 1, SUN Wen-juan 1, SHEN Zhen 1, LIANG Yu-ting 1, LIU Jian-she 1, CHEN Jian-hua 2, QIU Guan-zhou 1(1School of Minerals Processing and Bioengineering, Central South University, Changsha, Hunan, 410083, China; 2The Affiliated Tumor Hospital of Xiangya Medical School of Central South University, Changsha, Hunan, 410083, China) ABSTRACT Objective:In bioleaching process, the microbial community structure analysis, based on high purity, less loss of geno-mic DNA extraction, plays an important role. To solve this problem and find out a more sensitive, rapid, economical and practical way to extract genomic DNA from bioleaching acidophiles, two commonly used DNA extraction methods, boiling and Kit, were compared in the study. Methods:Boiling and Kit methods were used to extract genomic DNA from six different leaching bacteria. The extracting effects of the two methods were compared in terms of the concentration, purity and recovery of the extracted genomic DNA and the influ-ence of extracted genomic DNA on PCR (PolymeraseChain Reaction). The sensitivity of the two methods were compared through Real-time PCR where the same mesophilic acidophile was treated with different decimal amounts of cells. Results:The results showed that the genomic DNA extracted from the equal amount of bacteria (108cells) of gram positive bacteria (1strain), gram negative bacteria (4strains), archaea(1strain)bythetwomethodsareverydifferent.ThesixkindsofgenomicDNAextractedwiththeboilingmethodaremuchpurerthanthose extracted with Kit method, and the values of OD260/OD280of the former are closer to the value of 1.8to 2.0(the OD260/OD280value of pure DNA falls between 1.8to 2.0). Recovery of genomic DNA with the former method can be up to 16.7times that of the latter. While compared to the kit method, the concentration of extracted DNA template could be detected through Real-time PCR with lower concentration of cells (102cells) could be detected through Real-time PCR when DNA was extracted by boiling method. Thus, boiling method is higher sensitivity than kit method. Conclusion:The DNA extracted by the two methods could be used for subsequent PCR analysis. Additionally, the DNA concentrations with boiling method increase linearly with the increase of cell concentration, while, the increase of DNA concentration with kit method is limited when cell concentrations increase and arrive a high level. Therefore, the microbial genomic DNA extraction can directly use the boiling method to save cost and time in the bioleaching process.
Key words:Boiling methods; Kit method; Leaching bacteria; PCR; Real-time PCR Chinese Library Classification(CLC):Q93-3Document code:A Article ID:1673-627301-31-05（2014）
*基金项目：国家自然科学基金项目（20803094）；中国博士后特别资助（2012T50710）；湖南省科技计划项目（2011RS4068）作者简介：夏乐先（1973-），男，博士，副教授，从事生物冶金、选矿、微生物分子生态学等研究，0731-88836943，E-mail ：[email protected]电话：
2013-07-09接受日期：2013-07-29（收稿日期：）
·32·
现代生物医学进展www.shengwuyixue.com Progress in Modern Biomedicine Vol.14NO.1JAN.2014
前言
微生物冶金中涉及到的大多数浸矿微生物都是一些极端环境下生长的化能自养菌，包括细菌和古生菌[1-3]，相对于其他环境下的微生物具有生长速度慢，菌体浓度普遍较低的特点。在研究这些低丰度的微生物分子生物学特征时，需收集大量样品以满足DNA 提取的需要，且在提取的过程中易受到浸出体系中的pH 、离子浓度、矿渣等干扰，使DNA 提取也变得困难。尽管DNA 提取方法有很多，但是没有哪一种方法是被定为科学界的标准，每种方法都有它的优缺点[4]。目前，环境样品的DNA 提取可分为直接提取法、间接提取法及他们的改进，直接提取法可得到高回收率的DNA ，但其纯度较低，会影响到后续的PCR 扩增和使群落分析失真；间接提取法可得到较高纯度的DNA 和保真DNA 的多样性，但这种方法只适用于细菌[5]。SDS 裂解实验室常采用的细菌DNA 提取方法有碱裂解法、Chelex-100法、CTAB 法、法、液氮研磨法等，但这些常规提取细菌DNA 的方法往往只能针对革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌中的一类，缺乏通用性[6]，或者操作复杂、耗时长，易造成样品间的交叉污染且微生物基因组DNA 的回收率和质量不太稳定。选取方法不当导致提取效率低，使一些特低丰度的微生物往往不能被检测到，从而导致所分析的群落结构与实际情况存在很大的偏差。因而，选取能从样品中尽量毫无偏差地提取出高质量的、具有代表性的微生物群落总基因组DNA 的方法显
得尤为重要[7]。在此，本文作者就煮沸裂解法与常用的试剂盒法对浸矿微生物的DNA 提取进行研究，比较分析了两种方法提取冶金微生物基因组DNA 的浓度、纯度、回收率及灵敏度，便于寻找一种更为快速、灵敏和经济实用的方法。
1材料与方法
1.1菌株来源
本实验选取包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和古菌的6种不同常用浸矿菌作为代表：嗜酸氧化亚铁硫杆菌
Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC23270(G-) ，嗜酸氧化硫硫杆嗜铁钩端螺旋菌Leptos-菌Acithiobacillus thiooxidans A01(G-) ，
pirillum ferriphilum YSK(G-) ，喜温硫杆菌Acidithiobacillus cald-us S1(G-) ，嗜热硫氧化硫化杆菌Sulfobacillus thermosulfidooxid-a ns St(G+) ，（古嗜热嗜酸铁质菌Ferroplasma thermophilum L1菌），均来自中南大学生物冶金重点实验室菌种保藏室。1.2菌体的培养与收集
9K 培养基：(NH4) 2SO 43g/L，KCl 0.1g/L，K 2HPO 40.5g/L，Ca(NO3) 20.01g/L，MgSO 47H 2O 0.5g/L，不同菌株培养时另外·添加FeSO ·元素硫（S 0或酵母液（YE ）到9K 中。各菌的）47H 2O 、培养条件见表1。
待各菌长到对数期时，收集菌液，于12000r/m离心3min ，收集菌体，用pH 2.0的无菌水洗涤两次，再用pH 7.0左右的无菌水洗涤两次，然后用无菌水悬浮各菌液，以血球计数板计数，
表1各种菌的培养条件
Table 1Cultured conditions of all kinds of bacteria
Strains ATCC23270
A01YSK Strains S1St L1
Culture
9K+FeSO ·47H 2O(44.71g/L)
9K+S0(10g/L)7H 2O(44.71g/L)9K+FeSO 4·
Culture 9K+S0(10g/L)
9K+FeSO·47H 2O(20g/L)+YE(0.2g/L)9K+FeSO·47H 2O(20g/L)+YE(0.1g/L)
pH 2.02.01.6pH 2.01.51.0
T(℃) 303040T(℃) 404040
最后每种菌液各取两份，每一份含菌量为108个。1.3方法
1.3.1细菌DNA 提取（一）试剂盒提DNA ：所用试剂盒为上海申能博彩3S Spin Genomic DNA Minipreps Kit 。提取步骤：
112000）取含108个菌的菌悬液到1.5mL 的离心管中，r/min，离心3min ，然后吸净上清，加入150μL TE 将细胞悬浮2起来，加入10μL 溶菌酶，混匀室温放置10min ；）加入50055℃μL Digestion Buffer 混匀后，加入3μL Protease K ，混匀，3保温20min ；）高速室温12000r/min离心5min ，将上清转移4到1.5mL 无菌离心管中，加入300μL Solution B, 混匀；）将样品全部转移到3S 柱，柱子放入2.0mL Collection Tube ，转移12,000r/min，时用1mL Tip 头取样品；用台式离心机，室温离5心1min ；）取下3S 柱，弃去离心管中的废液；将柱子放回同一根离心管中，加入500μL Wash Solution, 12,000r/min，室温
6离心1min ；重复该步骤一次；）取下3S 柱，弃去离心管中的10000r/min，全部废液。将柱子放回同一根离心管中，室温离心2min ，7以除去残留的Wash Solution ；）在柱子中央加入60μL TE, 将柱子放入新的干净1.5mL 或2.0mL 离心管中，室温或37-55℃放置2min ；12000r/min，室温离心1min ；收集管中的-20液体即为基因组DNA ，将DNA 转移到200μL EP 管中，℃保藏备用。
（二）煮沸法提DNA ：分别取上述6株菌液各两份，每份含108个菌体，12000r/min，离心3min ，加到1.5mL 的离心管中，100℃水浴2然后吸净上清，加入60μL TE 将细胞悬浮起来，
min ，13000×g 高速离心1min ，-20℃保上清作为DNA 模板，存备用。
1.3.2DNA 纯度、浓度和回收率的检测取上述提取的DNA 样品，以TE 为空白对照，在NanoDrop 微量分光光度计上测定
现代生物医学进展www.shengwuyixue.com Progress in Modern Biomedicine Vol.14NO.1JAN.2014
·33·
DNA 浓度，OD260/OD280，每个样品测三次求平均值。计算回收率，见公式（1-1）：
=浓度（ng/μL ×60μL 回收率（ng/108个））
（1-1）
1.3.3PCR 扩增这六对引物分别是针对六株菌的gyrB 、arsB 或16S rRNA 而设计的特异性PCR 引物，扩增体系和条件相PCR 体系：2×PCR Master Mix 12.5同。上下游引物各0.5μL ，
于微量离心管中在μL ，模板1μL ，用无菌dd H 2O 补至25μL ，PCR 仪上按下列参数扩增。PCR 条件：95℃预处理3min ，95%30s ，56℃30s ，72℃30s （32个循环），经72℃延伸10min ，取10μL 扩增产物2%琼脂糖凝胶电泳，以250bp-ⅠDNA ladder EB 染色，作为分子量标准，空白对照为阴性对照，凝胶成像系统下观察。
表2两种方法提取的6株菌基因组DNA 浓度、纯度和回收率
Table 2Concentration, purity and recovery of genomic DNA from six bacteria extracted by two methods
Kit
Strains
Concentration （ng/μL ）
ATCC23270
A01YSK S1St L1
6.975.074.1763.65.83
OD260/OD2801.611.671.551.71.131.41
Recovery （ng/108
cells ）407.4304.2250.2360216349.8
Concentration （ng/μL ）
8.611.65.46.9324.597.47
Boiling OD260/OD2801.961.922.051.671.461.56
Recovery （ng/108
cells ）[1**********]5.81470
5848.2
1.3.4灵敏度测定两种方法的灵敏度测定选取浸矿过程中常用到的嗜酸氧化亚铁硫杆菌，将该菌液以1:10倍比稀释后，取6组菌液作为样本，102、103、104、105、106个。菌量分别为1、用上然后进行Re-述两种方法分别提取这6组样本的基因组DNA ，
al-time PCR 扩增，扩增条件与上步PCR 扩增条件相同。以嗜酸氧化亚铁硫杆菌纯菌的全基因组DNA 为模板进行PCR 扩增，将产物按1:10倍稀释（拷贝数为10-109copy/mL）后作为Real-time PCR 标准品，以此作标准曲线。反应条件：95℃预变性3min ；72℃延伸然后95℃变性30s ，特异性退火温度退火30s ，30s ，95℃1min ，实时荧光检测，共40个循环；熔解曲线分析：55℃10s ，每个循环后温度上升0.5℃，时间10s ，产物特异性分析，共80个循环。
2结果
2.1两种方法提取的DNA 浓度和纯度
同一株菌经两种不同的方法提取得到的DNA 纯度、浓度及回收率各不相同，且同一株方法针对不同的菌提取的效果也
图1不同方法提取的基因组DNA 做模板的PCR 产物凝胶电泳分析
（A. 煮沸法; B. 试剂盒法）
1，7所对应的菌株为氧化亚铁硫杆菌2，8所对注：（产物长度160bp ）；3，9所对应的菌株为嗜铁应的菌株为氧化硫硫杆菌（产物长度175bp) ；4，10所对应的菌株为喜温硫杆菌钩端螺旋菌（产物长度168bp ）；（产5，11所对应的菌株为嗜热硫氧化硫化杆菌物长度150bp) ；（产物长度261bp 6，12所对应的菌株为嗜热嗜酸铁质菌）；（产物长度为248bp ）Fig.1Gel electrophoresis of PCR products generated from genomic DNA as templates by two extraction methods （A. kit method; B. boiling method ）Note:1, 7for the A. ferrooxidans (productlength 160bp); 2, 8for A. thiooxidans (productlength 175bp); 3, 9for L. ferriphilum (productlength
168bp) ；4, 10for A. caldus (productlength 150bp) ；5, 11for S. thermosulfidooxidans (productlength 261bp) ；6, 12for F. thermophilum
(productlength 248bp)
不尽相同，如表2所示。在起始菌量相同的情况下，试剂盒法提取革兰氏阳性菌得到的DNA 浓度要低于革兰氏阴性菌和古菌。煮沸裂解法提取后，古菌所得DNA 浓度高于细菌。整体上，煮沸裂解法提取的基因组DNA 浓度和回收率要明显高于试剂盒提取的，这种差异在革兰氏阳性菌S. thermosulfidooxidans 的提取上表现出的差别达7倍，在古菌F. thermophilum 的提取上差别达16.7倍，由于革兰氏阴性菌细胞壁结构简单，提取革兰氏阴性菌时这种差异稍小些。煮沸法并没有经过去蛋白和多糖的步骤，但OD260/OD280仍比试剂盒法接近1.8-2.0（纯DNA 的OD260/OD280阈值在1.8-2.0之间），前者所得DNA 纯度高于后者。
2.2PCR 产物电泳结果
为了验证上述两种方法提取的基因组DNA 中杂质是否影
·34·
现代生物医学进展www.shengwuyixue.com Progress in Modern Biomedicine Vol.14NO.1
JAN.2014
图2Real-time PCR 标准曲线Fig.2Standard curve of Real-time PCR
响后续实验，以6对特异引物进行PCR 扩增，电泳结果见图1。两种方法提取的6种基因组DNA 均能作为模板扩增出各自的目的片段（150bp-250bp ），没有出现杂带和拖带的现象。尽管操作上存在误差，煮沸法提取的6组基因组DNA 扩增后的产物条带还是比试剂盒法的条带亮，与DNA 的浓度测定结果相吻合。两组PCR 产物电泳结果说明，煮沸法在既定煮沸破壁的时间内，导致的蛋白，多糖变性沉淀效果好，而DNA 抗热变性PCR 扩增实能力较高，经高速离心能较好的分离出高纯度的，
验表明，即使DNA 中存在少量蛋白质或多糖等杂质，也对PCR 扩增影响不大，与实验室常用的试剂盒法相比能达到相同的效果。2.3灵敏度检验
用两种方法分别提取6种浓度（106-10个）的嗜酸氧化亚
铁硫杆菌，以提取的基因组DNA 为模板，经过Real-time PCR [8]扩增效率为扩增后，标准曲线如图2所示。相关系数为99.6%，96.8%的情况下，两种方法提取得到的基因组DNA 拷贝数如表3所示。从表3可以看出，煮沸裂解法能从较少（102个的菌）体中提取得到DNA ，且不同浓度的提取拷贝数与原始菌量以大致相同的倍数（10倍）增加，变化较一致。试剂盒法要从含103个菌体的样品中才能提取到DNA ，但是提取的基因组DNA 随着着菌体的10倍增加而呈2倍递增的趋势，DNA 拷DNA 贝数与初始菌量偏差较大，且在提取过程中，菌量越多，损失越严重，这是由于提取的过程中细胞裂解不完全，要经过多次转管，导致DNA 提取不出来或丢失。在处理相同菌量时，煮沸裂解法处理的效果是试剂盒的若干倍，验证了前面的煮沸法比试剂盒法提取的DNA 浓度高。
表3两种方法在不同浓度梯度的比较
Table 3Comparison of recovery of DNA by two kinds of methods
Initial cells
Methods Kit Boiling
1065.37×1023.09×105
1052.75×1023.96×104
1041.46×1021.61×103
1037.16×106.40×102
10202.8×10
1000
3讨论
基于核酸技术能精确定量混合微生物中各种菌的数量及分析不同时期环境中的群落结构，所以从整个微生物菌群中提取出有代表性和高质量的核酸显得极为重要[9]。DNA 的浓度、纯度、产率及PCR 产物电泳条带是反映所提DNA 质量高低的重要参数，直接影响后续分子学实验操作。Real-time PCR 可精确、灵敏、快速的检测出少量的微生物，而这种细胞计数主要依据的是DNA 提取时获得的模板量，所以DNA 的提取效率决定了检测结果的偏差大小[4]。本文比较了煮沸裂解法和试剂盒法，结果显示两种方法提取的DNA 各种参数都有较明显差异。
在处理量均为108个菌时，两种方法所提取的6株菌的
DNA 浓度高于细菌，这是因为嗜热嗜酸古菌没有复杂的细胞
S. 壁，只有一层细胞膜，所以比细菌更容易裂解完全，同时，thermosulfidooxidan 和F. thermophilum 所得DNA 浓度明显高于其它4株革兰氏阴性菌，说明了此种方法受细胞壁成分和其薄厚的影响不是主要因素，而各种细菌DNA 浓度的差异可能是由于操作损失引起或它们的基因组大小不同导致的。对于4株革兰氏阴性菌，煮沸裂解法所得DNA 浓度是试剂盒法的1-2倍，对于革兰氏阳性菌S. thermosulfidooxidans ，煮沸裂解法所得DNA 浓度是试剂盒法所得DNA 浓度的7倍，对于古菌
F. thermophilum ，这种差别达到16.7倍，这两种提取效果的差异表明了加热破壁比试剂盒破壁效果普遍明显。不同的细胞，细胞壁结构各不相同，前者在破壁时受细胞壁成分的影响较小，高温可使所有的细胞壁成分及包裹在DNA 外的蛋白降解，将DNA 完全释放出来，后者破壁时会受到细胞壁成分、裂解液多少的影响，细胞破壁不充分。前者在提取的过程中操作步骤
S. thermosulfidooxidans 的DNA 质量均不同。用试剂盒法处理，
DNA 浓度低于其它五株菌所得DNA ，说明革兰氏阳性菌细胞壁较厚，裂解液破壁不彻底。用煮沸裂解法处理，古菌所得
现代生物医学进展www.shengwuyixue.com Progress in Modern Biomedicine Vol.14NO.1JAN.2014
·35·
DNA 损失较少，损失的DNA 量也少，后者要经过多次转管，
多。煮沸破壁时没有添加化学试剂，且后期没有经过去蛋白和多糖的步骤，但OD260/OD280仍比试剂盒法接近1.8-2.0（纯DNA 的OD260/OD280阈值在1.8-2.0之间），所得DNA 纯度高于试剂盒法。PCR 产物跑胶均有较亮条带，表明煮沸法在较短的时间内能使蛋白、多糖变性降解，而DNA 抗热变性能力高，仍能较完整的存在，试剂盒法所提DNA 中可能含少量化学试剂，同样不影响后续分子实验。Real-time PCR 检测出，用煮沸裂解法处理102个A. ferrooxidans 时即可得到模板，试剂盒法在处理量为103个时才能得到模板，结果表明，煮沸裂解法较试剂盒法更能从浓度较低的菌液中提取到DNA ，比较灵敏，这对于群落分析时混合菌基因组DNA 的提取有较好的保真性，能较准确的分析出原来混合体系中各种菌的比例。同时，也验证了煮沸裂解法由于在煮沸法中的短暂高温使绝大部分蛋白与多糖发生了热变形而沉淀，而DNA 的抗热变性的能力要强，通过离心收集上清能得到高纯度DNA ，对后续PCR 分析无影响。
目前DNA 提取方法的研究主要是针对土壤微生物，Parachin
[10]
参考文献(References)
[1]Zhou Hong-bo, Zeng Wei-min, Yang Zhi-feng, et al. Bioleaching of
chalcopyrite concentrate by a moderately thermophilic culture in a sti-rred tank reactor [J].Bioresource Technology, 2009, 100(2):515-520[2]C árdenas J P, Vald és J, Quatrini R, et al. Lessons from the genomes of
extremely acidophilic bacteria and archaea with special emphasis on b-ioleaching microorganisms [J].Applied Microbiology and Biotechnol-ogy, 2010, 88(3):605-620
[3]Auernik K S, Kelly R M. Impact of molecular hydrogen on chalcopyr-ite bioleaching by the extremely thermoacidophilic archaeon Metallos-phaera sedula [J].Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(8):2668-2672
[4]Islam M R, Sultana T, Melvin-Joe M, et al. Comparisons of direct
extraction methods of microbial DNA from different paddy soils [J].Saudi Journal of Biological Sciences, 2012, 19:337-342
[5]Zhao Feng, Xu Kuo-dong. Efficiency of DNA extraction methods on
the evaluation of soil microeukaryotic diversity [J].Acta Ecologica Si-nica, 2012, 32(4):209-214
[6]郑维, 权春善, 朴永哲, 等. 一种从活性污泥中提取微生物总DNA
的方法[J].中国生物工程杂志, 2008, 28(7):97-99
Zheng Wei, Quan Chun-shan, Pu Yong-zhe, et al. The extraction meth-od of bacterial DNA from activated sludges [J].China Biotechnology, 2008, 28(7):97-99
[7]张于光, 李迪强, 王慧敏, 等. 用于分子生态学研究的土壤微生物
DNA 提取方法[J].应用生态学报, 2005, 16(5):956-960
Zhang Yu-guang, Li Di-qiang, Wang Hui-min, et al. Extraction method of soil microbial DNA for molecular ecology study [J].Chinese Journal of Appliedecology, 2005, 16(5):956-960
[8]胡晓红, 彭惠民, 刘昕, 等. PCR 及Real-time PCR 评价细菌DNA 提
取方法[J].重庆医科大学学报, 2008, 33(2):155-158
Hu Xiao-hong, Peng Hui-min, Liu Xi, et al. Bacterial DNA extraction method used in PCR and Real-time fluorescent quantitative PCR [J].Acta Academiae Medicinae Militaris Tertiae, 2008, 33(2):155-158[9]Nadkarni M A, Martin F E, Hunter N, et al. Methods for optimizing
DNA extraction before quantifying oral bacterial numbers by real-time PCR [J].FEMS microbiology letters, 2009, 296(1):45-51
[10]Parachin N S, Schelin J, Norling B, et al. Flotation as a tool for
indirect DNA extraction from soil [J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 87(5):1927-1933
[11]Inceo lu 魻, Hoogwout E F, Hill P, et al. Effect of DNA extraction
method on the apparent microbial diversity of soil [J].Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(10):3378-3382
[12]Bloem J, Bolhuis P, Veninga M, et al. Microscopic methods for
counting bacteria and fungi in soil [J].Methods in applied soil microbiology and biochemistry, 1995:162-173
[13]Zhou Hong-bo, Liu Xi, Fu Bo, et al. Isolation and characterization of
Acidithiobacillus caldus from several typical environments in China [J].Journal-Central South University Of Technology (EnglishEditio-n), 2007, 14(2):163-163
[14]Lizama H, Jensen S, Stradling A. Dynamic microbial populations in
heap leaching of zinc sulphide ore[J].Minerals Engineering, 2012, 25(1):54-58
（下转第17页）
和I
[11]
等人比较研究了各种土壤微生物的
DNA 提取方法。这些方法在用于浸矿菌的提取时总是会遇到DNA 抽提试剂盒与Tris-EDTA 法不适合提取产生各种问题，
内生孢子或有厚荚膜的浸矿菌的基因组DNA
[12]
，冷冻研磨
-SDS 抽提法对微量的浸矿菌不够灵敏[13]。针对浸矿菌基因组DNA 提取的研究较少，Lizama [14]和邹平[15]等直接用试剂盒法提取浸矿菌DNA ，与本实验中煮沸法效果一样，但所需费用多。曾乐平
[16]
用沸水浴后再用酚氯仿乙醇混合物抽提浸矿菌
DNA ，与本实验中煮沸裂解法达到同样的目的，但步骤多，费时费力。张翠等[17]用直接裂解法快速制备出CMV DNA 扩增模板，扩大了此种方法的应用范围，也验证了煮沸裂解法的简单、可靠，与本实验结果一致。胡晓红等[8]比较了煮沸裂解法和其它几种方法，同样证明了这种方法得到的DNA 可用于后续的分子实验，缺点是高温可能使模板损伤和丢失，但本实验缩短了煮沸的时间，减少了模板损失。
综合以上分析，煮沸裂解法步骤少，简单，快速，成本低；提取过程在一个管内完成，避免污染，减少操作上导致的失误；灵敏，保真，所需菌量少，在群落分析中，能确保低丰度的微生物被检测到；避免了残留化学试剂对后续实验的影响；此方法适用范围广：包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和古菌。煮沸裂解法提取的基因组DNA 浓度、纯度、回收率均高于试剂盒法所提取DNA ，更能满足极端环境中低菌体密度的浸矿菌PCR 及后续分子水平的生态群落分析。因而，用此方法可以解决在浸矿中DNA 提取回收率和纯度低的问题，能够较好的还原菌群中各种菌的比例和数量，尤其对于群落结构分析中低丰度菌的DNA 提取有很重要的应用价值。
致谢：
在论文的完成中，艾郴彬博士对论文审阅提供了重要修改意见，中南大学生物冶金重点实验室为实验提供了实验材料和仪器设备，国家自然科学基金（20803094）、中国博士后特别资助（2012T50710）、湖南省科技计划项目为实验提供了基金资助，在此表示感谢。
现代生物医学进展www.shengwuyixue.com Progress in Modern Biomedicine Vol.14NO.1JAN.2014
·17·
并且还能参与肝癌的VEGF 促进了血管的形成从而增加血供，
VEGF 的蛋白表达侵袭转移过程。我们结果发现OPN 下降后，
及活力也下降了，提示OPN 参与肝癌侵袭的部分机制可能是通过调控VEGF 来实现的。但是OPN 是如何调控MMP-2和VEGF 尚待进一步实验来研究。
OPN 作为一种十分重要的肿瘤相关蛋白，综上所述，目前受到人们的重视。既往研究和我们的实验结果发现在肝癌中OPN 表达增加，并且抑制OPN 的表达能够有效降低肝癌细胞的侵袭能力，就其机制可能是通过调控MMP-2和VEGF 来实现的，所以针对OPN 的研究可能最为肝癌转移治疗的靶点，但OPN 具体参与肝癌侵袭的机制尚待进一步研究。
参考文献(References)
[1]Hanazaki K, Kajikawa s, Shimozawa N, et a1. Survival and recurrence
after hepatic resection of 386consecutive patients with hepatocellular carcinoma[J].J Am Coil Surg, 2000, 191(4):381-388
[2]Masuzaki R, Karp SJ, Omata M. New serum markers of hepatocellular
carcinoma[J].Seminars in oncology, 2012,39(4):434-439
[3]Wai PY, Kuo PC. The role of osteopotin in tumor metastasis[J].J Surg
Res, 2004, 121(2):228-241
[4]Sun J, Xu HM, Zhou HJ, et a1. The prognostic significance of preoper-ative plasma levels of osteopontin in patients with TNM stage-I of hepatocellular carcinoma[J].J Cancer Res Clin Oncol, 2010, 136:1-7[5]Zhou L, Wang DS, Li QJ, et a1. Downregulation of the Notch signaling
pathway inhibits hepatocellular carcinoma cell invasion by inactivation of matrix metalloproteinase-2and -9and vascular endothelial growth factor[J].Oncol Rep, 2012, 28(3):874-882
[6]Senger DR, Wirth DF, Hynes RO. Transformed mammalian cells secr-et specific proteins and phosphoproteins[J].Cell, 1979, 16(4):885-893[7]Ahmed M, Kundu GC. Osteopontin selectively regulates p70S6K/mT-OR phosphorylation leading to NF-kappaB dependent AP-1-mediated ICAM-1expression in breast cancer cells [J].Molecular cancer, 2010, 9:101
[8]Beausoleil MS, Schulze EB, Goodale D, et al. Deletion of the thromb-in cleavage domain of osteopontin mediates breast cancer cell adhesi-
on, proteolytic activity, tumorgenicity, and metastasis[J].BMCcancer, 2011, 11:25
[9]Anborgh PH, Mutrie JC, Tuck AB, et al. Role of the metastasis-prom-oting protein osteopontin in the tumour microenvironment [J].Journal of cellular and molecular medicine, 2010, 14(8):2037-2044
[10]Coppola D, Szabo M, Boulware D, et a1. Correlation of osteopotin
protein expression and pathological stage across a wide variety of tumor histologies[J].Clin CancerRes,2004, 10(1):184-l90
[11]Gotoh M, Sakamoto M, Kenetaka K, et a1. Overpression of osteopot-in inhepatocellular carcinoma[J].PatholInt, 2002, 52(1):19-24[12]Pan Hw, Ou YH, Peng SY, et a1. Overpression of osteopotin is asso-ciated with intrahepatic memsmsis early recurrence and poorer prog-nosis ofsurgically resected[J].Cancer, 2003, 98(1):l19-127[13]Anborgh PH, Mutrie JC, Tuck AB, et al. Pre-and post-translational
regulation of osteopontin in cancer[J].Journal of cell communication and signaling, 2011, 5(2):111-122
[14]Abu El Makarem MA, Abdel-Aleem A, Ali A, et al. Diagnostic
significance of plasma osteopontin in hepatitis C virus-related hepat-ocellular carcinoma[J].Annals of hepatology, 2011, 10(3):296-305[15]Bandiera E, Zanotti L, Fabricio AS, et al. Cancer antigen 125, human
epididymis 4, kallikrein 6, osteopontin and soluble mesothelin-related peptide immunocomplexed with immunoglobulin M in epithelial ov-arian cancer diagnosis[J].Clinical chemistry and laboratory medicine :CCLM /FESCC, 2013, 51(9):1815-1824
[16]GiannelliG, Bergamini C, Marinosci FE. et a1. Clinical role of MMP-2/TIMP-2imbalance in hepatocellular carcinoma [J].Int J Cancer, 2002, 97(4):425-431
[17]Barak V, Kaiserman I, Frenkel S, et al. The dynamics of serum tumor
markers in predicting metastatic uveal melanoma (part1) [J].Antica-ncer research, 2011, 31(1):345-349
[18]Holash J, Wiegand SJ, Yancopoulos GD. New model of tumor angio-genesis:dynamic balance between vessel regression and growth med-iated by angiopoietins and VEGF[J].Oncogene, 1999, 18(38):5356-5362
（上接第35页）
[15]邹平, 张文彬, 林连兵, 等. 以黄铜矿为主的低品位硫化铜矿生物
浸出体系中的细菌优势菌群[J].过程工程学报, 2008, 8(4):761-767
Zou Pin, Zhang Wen-bin, Lin lian-bing, et al. Dominant bacteria in bioleaching system of low-grade copper sulphide ore consisting mainly of chalcopyritethe chinese journal of process engineering [J].The Chinese Journal of Process Engineering, 2008, 8(4):761-767(InChinese)
[16]曾乐平, 张燕飞, 黄菊芳. 一种有效的抽提浸矿细菌DNA 的方法
[OL].(2011-01-19)[2013-03-31].http://www.paper.edu.cn/release-paper/content/201101-956
Zeng Le-Ping, Zhang Yan-fei, Huang Ju-fang. An effective method of DNA extraction for bioleaching bacteria [OL].(2011-01-19)[2013-03-31].http://www.paper.edu.cn/releasepaper/content/201101-956)[17]张翠, 韩金祥, 赵健, 等. 一种简单快速制备CMV DNA 扩增模板
的方法[J].国外医学(临床生物化学与检验学分册, 2002, 23(6):371-371
Zhang Zui, Han Jin-xiang, Zhao Jian, et al. A simple and rapid meth-od for preparation of CMV DNA amplification template [J].Clinical Biochemistry and Laboratory Medicine, Foreign Medical Sciences, 2002, 23(6):371-371
现代生物医学进展www.shengwuyixue.com Progress in Modern Biomedicine Vol.14NO.1JAN.2014
·31·
DOI:10.13241/j.cnki.pmb.2014.01.007
煮沸裂解法和试剂盒法提取浸矿菌基因组DNA 的比较*
夏乐先1孙文娟1沈
振1梁昱婷1柳建设1陈建华2邱冠周1
(1中南大学资源加工与生物工程学院湖南长沙410083；2中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院湖南长沙410083)
摘要目的：在生物浸出中，微生物群落结构分析有着重要意义，而群落分析的基础是提取纯度高、损失少的基因组DNA 。为了解决这一问题，本实验通过比较两种较常用的DNA 提取方法，煮沸裂解法和试剂盒法，寻找一种灵敏、快速、经济实用的制备浸矿细菌基因组DNA 的方法。方法：分别用煮沸裂解法和试剂盒法提取6种浸矿菌的基因组DNA ，从所提取的基因组DNA 浓度、纯度、回收率和对PCR 扩增反应的影响方面比较了两种方法的提取效果；用两种方法来处理不同浓度梯度的一种菌，通过实时定量PCR 来比较两种方法的灵敏性。结果：相同处理量（108个）的革兰氏阳性菌（1株）、革兰氏阴性菌（4株）、古菌（1株）经两种方法提取的基因组DNA 差异较大，煮沸裂解法所得的6组基因组DNA 更纯，其OD260/OD280的值更接近1.8-2.0（纯DNA 的OD260/OD280在1.8-2.0之间），前者所提DNA 回收率最大可达后者的16.7倍；煮沸裂解法只需较少菌（102个）便能让实时定量PCR 检测到所提DNA 模板浓度，比试剂盒法灵敏。结论：两种方法提取的基因组DNA 均可用于后续的PCR 扩增，此外，前者提取的DNA 浓度随细菌浓度增加而呈线性增大，而后者随菌浓度增大，所提DNA 量增加有限，因此，在生物浸出中微生物基因组DNA 的提取可直接采用简单快速的煮沸提取法，为实验节约成本和时间。关键词：煮沸裂解法；试剂盒法；浸矿细菌；聚合酶链反应；实时荧光定量PCR Q93-3文献标识码：A 文章编号：1673-627301-31-05中图分类号：（2014）
Comparison of Genomic DNA Extraction from Bioleaching Acidophiles
by Two Methods:Boiling and Kit Methods*
XIA Le-xian 1, SUN Wen-juan 1, SHEN Zhen 1, LIANG Yu-ting 1, LIU Jian-she 1, CHEN Jian-hua 2, QIU Guan-zhou 1(1School of Minerals Processing and Bioengineering, Central South University, Changsha, Hunan, 410083, China; 2The Affiliated Tumor Hospital of Xiangya Medical School of Central South University, Changsha, Hunan, 410083, China) ABSTRACT Objective:In bioleaching process, the microbial community structure analysis, based on high purity, less loss of geno-mic DNA extraction, plays an important role. To solve this problem and find out a more sensitive, rapid, economical and practical way to extract genomic DNA from bioleaching acidophiles, two commonly used DNA extraction methods, boiling and Kit, were compared in the study. Methods:Boiling and Kit methods were used to extract genomic DNA from six different leaching bacteria. The extracting effects of the two methods were compared in terms of the concentration, purity and recovery of the extracted genomic DNA and the influ-ence of extracted genomic DNA on PCR (PolymeraseChain Reaction). The sensitivity of the two methods were compared through Real-time PCR where the same mesophilic acidophile was treated with different decimal amounts of cells. Results:The results showed that the genomic DNA extracted from the equal amount of bacteria (108cells) of gram positive bacteria (1strain), gram negative bacteria (4strains), archaea(1strain)bythetwomethodsareverydifferent.ThesixkindsofgenomicDNAextractedwiththeboilingmethodaremuchpurerthanthose extracted with Kit method, and the values of OD260/OD280of the former are closer to the value of 1.8to 2.0(the OD260/OD280value of pure DNA falls between 1.8to 2.0). Recovery of genomic DNA with the former method can be up to 16.7times that of the latter. While compared to the kit method, the concentration of extracted DNA template could be detected through Real-time PCR with lower concentration of cells (102cells) could be detected through Real-time PCR when DNA was extracted by boiling method. Thus, boiling method is higher sensitivity than kit method. Conclusion:The DNA extracted by the two methods could be used for subsequent PCR analysis. Additionally, the DNA concentrations with boiling method increase linearly with the increase of cell concentration, while, the increase of DNA concentration with kit method is limited when cell concentrations increase and arrive a high level. Therefore, the microbial genomic DNA extraction can directly use the boiling method to save cost and time in the bioleaching process.
Key words:Boiling methods; Kit method; Leaching bacteria; PCR; Real-time PCR Chinese Library Classification(CLC):Q93-3Document code:A Article ID:1673-627301-31-05（2014）
*基金项目：国家自然科学基金项目（20803094）；中国博士后特别资助（2012T50710）；湖南省科技计划项目（2011RS4068）作者简介：夏乐先（1973-），男，博士，副教授，从事生物冶金、选矿、微生物分子生态学等研究，0731-88836943，E-mail ：[email protected]电话：
2013-07-09接受日期：2013-07-29（收稿日期：）
·32·
现代生物医学进展www.shengwuyixue.com Progress in Modern Biomedicine Vol.14NO.1JAN.2014
前言
微生物冶金中涉及到的大多数浸矿微生物都是一些极端环境下生长的化能自养菌，包括细菌和古生菌[1-3]，相对于其他环境下的微生物具有生长速度慢，菌体浓度普遍较低的特点。在研究这些低丰度的微生物分子生物学特征时，需收集大量样品以满足DNA 提取的需要，且在提取的过程中易受到浸出体系中的pH 、离子浓度、矿渣等干扰，使DNA 提取也变得困难。尽管DNA 提取方法有很多，但是没有哪一种方法是被定为科学界的标准，每种方法都有它的优缺点[4]。目前，环境样品的DNA 提取可分为直接提取法、间接提取法及他们的改进，直接提取法可得到高回收率的DNA ，但其纯度较低，会影响到后续的PCR 扩增和使群落分析失真；间接提取法可得到较高纯度的DNA 和保真DNA 的多样性，但这种方法只适用于细菌[5]。SDS 裂解实验室常采用的细菌DNA 提取方法有碱裂解法、Chelex-100法、CTAB 法、法、液氮研磨法等，但这些常规提取细菌DNA 的方法往往只能针对革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌中的一类，缺乏通用性[6]，或者操作复杂、耗时长，易造成样品间的交叉污染且微生物基因组DNA 的回收率和质量不太稳定。选取方法不当导致提取效率低，使一些特低丰度的微生物往往不能被检测到，从而导致所分析的群落结构与实际情况存在很大的偏差。因而，选取能从样品中尽量毫无偏差地提取出高质量的、具有代表性的微生物群落总基因组DNA 的方法显
得尤为重要[7]。在此，本文作者就煮沸裂解法与常用的试剂盒法对浸矿微生物的DNA 提取进行研究，比较分析了两种方法提取冶金微生物基因组DNA 的浓度、纯度、回收率及灵敏度，便于寻找一种更为快速、灵敏和经济实用的方法。
1材料与方法
1.1菌株来源
本实验选取包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和古菌的6种不同常用浸矿菌作为代表：嗜酸氧化亚铁硫杆菌
Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC23270(G-) ，嗜酸氧化硫硫杆嗜铁钩端螺旋菌Leptos-菌Acithiobacillus thiooxidans A01(G-) ，
pirillum ferriphilum YSK(G-) ，喜温硫杆菌Acidithiobacillus cald-us S1(G-) ，嗜热硫氧化硫化杆菌Sulfobacillus thermosulfidooxid-a ns St(G+) ，（古嗜热嗜酸铁质菌Ferroplasma thermophilum L1菌），均来自中南大学生物冶金重点实验室菌种保藏室。1.2菌体的培养与收集
9K 培养基：(NH4) 2SO 43g/L，KCl 0.1g/L，K 2HPO 40.5g/L，Ca(NO3) 20.01g/L，MgSO 47H 2O 0.5g/L，不同菌株培养时另外·添加FeSO ·元素硫（S 0或酵母液（YE ）到9K 中。各菌的）47H 2O 、培养条件见表1。
待各菌长到对数期时，收集菌液，于12000r/m离心3min ，收集菌体，用pH 2.0的无菌水洗涤两次，再用pH 7.0左右的无菌水洗涤两次，然后用无菌水悬浮各菌液，以血球计数板计数，
表1各种菌的培养条件
Table 1Cultured conditions of all kinds of bacteria
Strains ATCC23270
A01YSK Strains S1St L1
Culture
9K+FeSO ·47H 2O(44.71g/L)
9K+S0(10g/L)7H 2O(44.71g/L)9K+FeSO 4·
Culture 9K+S0(10g/L)
9K+FeSO·47H 2O(20g/L)+YE(0.2g/L)9K+FeSO·47H 2O(20g/L)+YE(0.1g/L)
pH 2.02.01.6pH 2.01.51.0
T(℃) 303040T(℃) 404040
最后每种菌液各取两份，每一份含菌量为108个。1.3方法
1.3.1细菌DNA 提取（一）试剂盒提DNA ：所用试剂盒为上海申能博彩3S Spin Genomic DNA Minipreps Kit 。提取步骤：
112000）取含108个菌的菌悬液到1.5mL 的离心管中，r/min，离心3min ，然后吸净上清，加入150μL TE 将细胞悬浮2起来，加入10μL 溶菌酶，混匀室温放置10min ；）加入50055℃μL Digestion Buffer 混匀后，加入3μL Protease K ，混匀，3保温20min ；）高速室温12000r/min离心5min ，将上清转移4到1.5mL 无菌离心管中，加入300μL Solution B, 混匀；）将样品全部转移到3S 柱，柱子放入2.0mL Collection Tube ，转移12,000r/min，时用1mL Tip 头取样品；用台式离心机，室温离5心1min ；）取下3S 柱，弃去离心管中的废液；将柱子放回同一根离心管中，加入500μL Wash Solution, 12,000r/min，室温
6离心1min ；重复该步骤一次；）取下3S 柱，弃去离心管中的10000r/min，全部废液。将柱子放回同一根离心管中，室温离心2min ，7以除去残留的Wash Solution ；）在柱子中央加入60μL TE, 将柱子放入新的干净1.5mL 或2.0mL 离心管中，室温或37-55℃放置2min ；12000r/min，室温离心1min ；收集管中的-20液体即为基因组DNA ，将DNA 转移到200μL EP 管中，℃保藏备用。
（二）煮沸法提DNA ：分别取上述6株菌液各两份，每份含108个菌体，12000r/min，离心3min ，加到1.5mL 的离心管中，100℃水浴2然后吸净上清，加入60μL TE 将细胞悬浮起来，
min ，13000×g 高速离心1min ，-20℃保上清作为DNA 模板，存备用。
1.3.2DNA 纯度、浓度和回收率的检测取上述提取的DNA 样品，以TE 为空白对照，在NanoDrop 微量分光光度计上测定
现代生物医学进展www.shengwuyixue.com Progress in Modern Biomedicine Vol.14NO.1JAN.2014
·33·
DNA 浓度，OD260/OD280，每个样品测三次求平均值。计算回收率，见公式（1-1）：
=浓度（ng/μL ×60μL 回收率（ng/108个））
（1-1）
1.3.3PCR 扩增这六对引物分别是针对六株菌的gyrB 、arsB 或16S rRNA 而设计的特异性PCR 引物，扩增体系和条件相PCR 体系：2×PCR Master Mix 12.5同。上下游引物各0.5μL ，
于微量离心管中在μL ，模板1μL ，用无菌dd H 2O 补至25μL ，PCR 仪上按下列参数扩增。PCR 条件：95℃预处理3min ，95%30s ，56℃30s ，72℃30s （32个循环），经72℃延伸10min ，取10μL 扩增产物2%琼脂糖凝胶电泳，以250bp-ⅠDNA ladder EB 染色，作为分子量标准，空白对照为阴性对照，凝胶成像系统下观察。
表2两种方法提取的6株菌基因组DNA 浓度、纯度和回收率
Table 2Concentration, purity and recovery of genomic DNA from six bacteria extracted by two methods
Kit
Strains
Concentration （ng/μL ）
ATCC23270
A01YSK S1St L1
6.975.074.1763.65.83
OD260/OD2801.611.671.551.71.131.41
Recovery （ng/108
cells ）407.4304.2250.2360216349.8
Concentration （ng/μL ）
8.611.65.46.9324.597.47
Boiling OD260/OD2801.961.922.051.671.461.56
Recovery （ng/108
cells ）[1**********]5.81470
5848.2
1.3.4灵敏度测定两种方法的灵敏度测定选取浸矿过程中常用到的嗜酸氧化亚铁硫杆菌，将该菌液以1:10倍比稀释后，取6组菌液作为样本，102、103、104、105、106个。菌量分别为1、用上然后进行Re-述两种方法分别提取这6组样本的基因组DNA ，
al-time PCR 扩增，扩增条件与上步PCR 扩增条件相同。以嗜酸氧化亚铁硫杆菌纯菌的全基因组DNA 为模板进行PCR 扩增，将产物按1:10倍稀释（拷贝数为10-109copy/mL）后作为Real-time PCR 标准品，以此作标准曲线。反应条件：95℃预变性3min ；72℃延伸然后95℃变性30s ，特异性退火温度退火30s ，30s ，95℃1min ，实时荧光检测，共40个循环；熔解曲线分析：55℃10s ，每个循环后温度上升0.5℃，时间10s ，产物特异性分析，共80个循环。
2结果
2.1两种方法提取的DNA 浓度和纯度
同一株菌经两种不同的方法提取得到的DNA 纯度、浓度及回收率各不相同，且同一株方法针对不同的菌提取的效果也
图1不同方法提取的基因组DNA 做模板的PCR 产物凝胶电泳分析
（A. 煮沸法; B. 试剂盒法）
1，7所对应的菌株为氧化亚铁硫杆菌2，8所对注：（产物长度160bp ）；3，9所对应的菌株为嗜铁应的菌株为氧化硫硫杆菌（产物长度175bp) ；4，10所对应的菌株为喜温硫杆菌钩端螺旋菌（产物长度168bp ）；（产5，11所对应的菌株为嗜热硫氧化硫化杆菌物长度150bp) ；（产物长度261bp 6，12所对应的菌株为嗜热嗜酸铁质菌）；（产物长度为248bp ）Fig.1Gel electrophoresis of PCR products generated from genomic DNA as templates by two extraction methods （A. kit method; B. boiling method ）Note:1, 7for the A. ferrooxidans (productlength 160bp); 2, 8for A. thiooxidans (productlength 175bp); 3, 9for L. ferriphilum (productlength
168bp) ；4, 10for A. caldus (productlength 150bp) ；5, 11for S. thermosulfidooxidans (productlength 261bp) ；6, 12for F. thermophilum
(productlength 248bp)
不尽相同，如表2所示。在起始菌量相同的情况下，试剂盒法提取革兰氏阳性菌得到的DNA 浓度要低于革兰氏阴性菌和古菌。煮沸裂解法提取后，古菌所得DNA 浓度高于细菌。整体上，煮沸裂解法提取的基因组DNA 浓度和回收率要明显高于试剂盒提取的，这种差异在革兰氏阳性菌S. thermosulfidooxidans 的提取上表现出的差别达7倍，在古菌F. thermophilum 的提取上差别达16.7倍，由于革兰氏阴性菌细胞壁结构简单，提取革兰氏阴性菌时这种差异稍小些。煮沸法并没有经过去蛋白和多糖的步骤，但OD260/OD280仍比试剂盒法接近1.8-2.0（纯DNA 的OD260/OD280阈值在1.8-2.0之间），前者所得DNA 纯度高于后者。
2.2PCR 产物电泳结果
为了验证上述两种方法提取的基因组DNA 中杂质是否影
·34·
现代生物医学进展www.shengwuyixue.com Progress in Modern Biomedicine Vol.14NO.1
JAN.2014
图2Real-time PCR 标准曲线Fig.2Standard curve of Real-time PCR
响后续实验，以6对特异引物进行PCR 扩增，电泳结果见图1。两种方法提取的6种基因组DNA 均能作为模板扩增出各自的目的片段（150bp-250bp ），没有出现杂带和拖带的现象。尽管操作上存在误差，煮沸法提取的6组基因组DNA 扩增后的产物条带还是比试剂盒法的条带亮，与DNA 的浓度测定结果相吻合。两组PCR 产物电泳结果说明，煮沸法在既定煮沸破壁的时间内，导致的蛋白，多糖变性沉淀效果好，而DNA 抗热变性PCR 扩增实能力较高，经高速离心能较好的分离出高纯度的，
验表明，即使DNA 中存在少量蛋白质或多糖等杂质，也对PCR 扩增影响不大，与实验室常用的试剂盒法相比能达到相同的效果。2.3灵敏度检验
用两种方法分别提取6种浓度（106-10个）的嗜酸氧化亚
铁硫杆菌，以提取的基因组DNA 为模板，经过Real-time PCR [8]扩增效率为扩增后，标准曲线如图2所示。相关系数为99.6%，96.8%的情况下，两种方法提取得到的基因组DNA 拷贝数如表3所示。从表3可以看出，煮沸裂解法能从较少（102个的菌）体中提取得到DNA ，且不同浓度的提取拷贝数与原始菌量以大致相同的倍数（10倍）增加，变化较一致。试剂盒法要从含103个菌体的样品中才能提取到DNA ，但是提取的基因组DNA 随着着菌体的10倍增加而呈2倍递增的趋势，DNA 拷DNA 贝数与初始菌量偏差较大，且在提取过程中，菌量越多，损失越严重，这是由于提取的过程中细胞裂解不完全，要经过多次转管，导致DNA 提取不出来或丢失。在处理相同菌量时，煮沸裂解法处理的效果是试剂盒的若干倍，验证了前面的煮沸法比试剂盒法提取的DNA 浓度高。
表3两种方法在不同浓度梯度的比较
Table 3Comparison of recovery of DNA by two kinds of methods
Initial cells
Methods Kit Boiling
1065.37×1023.09×105
1052.75×1023.96×104
1041.46×1021.61×103
1037.16×106.40×102
10202.8×10
1000
3讨论
基于核酸技术能精确定量混合微生物中各种菌的数量及分析不同时期环境中的群落结构，所以从整个微生物菌群中提取出有代表性和高质量的核酸显得极为重要[9]。DNA 的浓度、纯度、产率及PCR 产物电泳条带是反映所提DNA 质量高低的重要参数，直接影响后续分子学实验操作。Real-time PCR 可精确、灵敏、快速的检测出少量的微生物，而这种细胞计数主要依据的是DNA 提取时获得的模板量，所以DNA 的提取效率决定了检测结果的偏差大小[4]。本文比较了煮沸裂解法和试剂盒法，结果显示两种方法提取的DNA 各种参数都有较明显差异。
在处理量均为108个菌时，两种方法所提取的6株菌的
DNA 浓度高于细菌，这是因为嗜热嗜酸古菌没有复杂的细胞
S. 壁，只有一层细胞膜，所以比细菌更容易裂解完全，同时，thermosulfidooxidan 和F. thermophilum 所得DNA 浓度明显高于其它4株革兰氏阴性菌，说明了此种方法受细胞壁成分和其薄厚的影响不是主要因素，而各种细菌DNA 浓度的差异可能是由于操作损失引起或它们的基因组大小不同导致的。对于4株革兰氏阴性菌，煮沸裂解法所得DNA 浓度是试剂盒法的1-2倍，对于革兰氏阳性菌S. thermosulfidooxidans ，煮沸裂解法所得DNA 浓度是试剂盒法所得DNA 浓度的7倍，对于古菌
F. thermophilum ，这种差别达到16.7倍，这两种提取效果的差异表明了加热破壁比试剂盒破壁效果普遍明显。不同的细胞，细胞壁结构各不相同，前者在破壁时受细胞壁成分的影响较小，高温可使所有的细胞壁成分及包裹在DNA 外的蛋白降解，将DNA 完全释放出来，后者破壁时会受到细胞壁成分、裂解液多少的影响，细胞破壁不充分。前者在提取的过程中操作步骤
S. thermosulfidooxidans 的DNA 质量均不同。用试剂盒法处理，
DNA 浓度低于其它五株菌所得DNA ，说明革兰氏阳性菌细胞壁较厚，裂解液破壁不彻底。用煮沸裂解法处理，古菌所得
现代生物医学进展www.shengwuyixue.com Progress in Modern Biomedicine Vol.14NO.1JAN.2014
·35·
DNA 损失较少，损失的DNA 量也少，后者要经过多次转管，
多。煮沸破壁时没有添加化学试剂，且后期没有经过去蛋白和多糖的步骤，但OD260/OD280仍比试剂盒法接近1.8-2.0（纯DNA 的OD260/OD280阈值在1.8-2.0之间），所得DNA 纯度高于试剂盒法。PCR 产物跑胶均有较亮条带，表明煮沸法在较短的时间内能使蛋白、多糖变性降解，而DNA 抗热变性能力高，仍能较完整的存在，试剂盒法所提DNA 中可能含少量化学试剂，同样不影响后续分子实验。Real-time PCR 检测出，用煮沸裂解法处理102个A. ferrooxidans 时即可得到模板，试剂盒法在处理量为103个时才能得到模板，结果表明，煮沸裂解法较试剂盒法更能从浓度较低的菌液中提取到DNA ，比较灵敏，这对于群落分析时混合菌基因组DNA 的提取有较好的保真性，能较准确的分析出原来混合体系中各种菌的比例。同时，也验证了煮沸裂解法由于在煮沸法中的短暂高温使绝大部分蛋白与多糖发生了热变形而沉淀，而DNA 的抗热变性的能力要强，通过离心收集上清能得到高纯度DNA ，对后续PCR 分析无影响。
目前DNA 提取方法的研究主要是针对土壤微生物，Parachin
[10]
参考文献(References)
[1]Zhou Hong-bo, Zeng Wei-min, Yang Zhi-feng, et al. Bioleaching of
chalcopyrite concentrate by a moderately thermophilic culture in a sti-rred tank reactor [J].Bioresource Technology, 2009, 100(2):515-520[2]C árdenas J P, Vald és J, Quatrini R, et al. Lessons from the genomes of
extremely acidophilic bacteria and archaea with special emphasis on b-ioleaching microorganisms [J].Applied Microbiology and Biotechnol-ogy, 2010, 88(3):605-620
[3]Auernik K S, Kelly R M. Impact of molecular hydrogen on chalcopyr-ite bioleaching by the extremely thermoacidophilic archaeon Metallos-phaera sedula [J].Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(8):2668-2672
[4]Islam M R, Sultana T, Melvin-Joe M, et al. Comparisons of direct
extraction methods of microbial DNA from different paddy soils [J].Saudi Journal of Biological Sciences, 2012, 19:337-342
[5]Zhao Feng, Xu Kuo-dong. Efficiency of DNA extraction methods on
the evaluation of soil microeukaryotic diversity [J].Acta Ecologica Si-nica, 2012, 32(4):209-214
[6]郑维, 权春善, 朴永哲, 等. 一种从活性污泥中提取微生物总DNA
的方法[J].中国生物工程杂志, 2008, 28(7):97-99
Zheng Wei, Quan Chun-shan, Pu Yong-zhe, et al. The extraction meth-od of bacterial DNA from activated sludges [J].China Biotechnology, 2008, 28(7):97-99
[7]张于光, 李迪强, 王慧敏, 等. 用于分子生态学研究的土壤微生物
DNA 提取方法[J].应用生态学报, 2005, 16(5):956-960
Zhang Yu-guang, Li Di-qiang, Wang Hui-min, et al. Extraction method of soil microbial DNA for molecular ecology study [J].Chinese Journal of Appliedecology, 2005, 16(5):956-960
[8]胡晓红, 彭惠民, 刘昕, 等. PCR 及Real-time PCR 评价细菌DNA 提
取方法[J].重庆医科大学学报, 2008, 33(2):155-158
Hu Xiao-hong, Peng Hui-min, Liu Xi, et al. Bacterial DNA extraction method used in PCR and Real-time fluorescent quantitative PCR [J].Acta Academiae Medicinae Militaris Tertiae, 2008, 33(2):155-158[9]Nadkarni M A, Martin F E, Hunter N, et al. Methods for optimizing
DNA extraction before quantifying oral bacterial numbers by real-time PCR [J].FEMS microbiology letters, 2009, 296(1):45-51
[10]Parachin N S, Schelin J, Norling B, et al. Flotation as a tool for
indirect DNA extraction from soil [J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 87(5):1927-1933
[11]Inceo lu 魻, Hoogwout E F, Hill P, et al. Effect of DNA extraction
method on the apparent microbial diversity of soil [J].Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(10):3378-3382
[12]Bloem J, Bolhuis P, Veninga M, et al. Microscopic methods for
counting bacteria and fungi in soil [J].Methods in applied soil microbiology and biochemistry, 1995:162-173
[13]Zhou Hong-bo, Liu Xi, Fu Bo, et al. Isolation and characterization of
Acidithiobacillus caldus from several typical environments in China [J].Journal-Central South University Of Technology (EnglishEditio-n), 2007, 14(2):163-163
[14]Lizama H, Jensen S, Stradling A. Dynamic microbial populations in
heap leaching of zinc sulphide ore[J].Minerals Engineering, 2012, 25(1):54-58
（下转第17页）
和I
[11]
等人比较研究了各种土壤微生物的
DNA 提取方法。这些方法在用于浸矿菌的提取时总是会遇到DNA 抽提试剂盒与Tris-EDTA 法不适合提取产生各种问题，
内生孢子或有厚荚膜的浸矿菌的基因组DNA
[12]
，冷冻研磨
-SDS 抽提法对微量的浸矿菌不够灵敏[13]。针对浸矿菌基因组DNA 提取的研究较少，Lizama [14]和邹平[15]等直接用试剂盒法提取浸矿菌DNA ，与本实验中煮沸法效果一样，但所需费用多。曾乐平
[16]
用沸水浴后再用酚氯仿乙醇混合物抽提浸矿菌
DNA ，与本实验中煮沸裂解法达到同样的目的，但步骤多，费时费力。张翠等[17]用直接裂解法快速制备出CMV DNA 扩增模板，扩大了此种方法的应用范围，也验证了煮沸裂解法的简单、可靠，与本实验结果一致。胡晓红等[8]比较了煮沸裂解法和其它几种方法，同样证明了这种方法得到的DNA 可用于后续的分子实验，缺点是高温可能使模板损伤和丢失，但本实验缩短了煮沸的时间，减少了模板损失。
综合以上分析，煮沸裂解法步骤少，简单，快速，成本低；提取过程在一个管内完成，避免污染，减少操作上导致的失误；灵敏，保真，所需菌量少，在群落分析中，能确保低丰度的微生物被检测到；避免了残留化学试剂对后续实验的影响；此方法适用范围广：包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和古菌。煮沸裂解法提取的基因组DNA 浓度、纯度、回收率均高于试剂盒法所提取DNA ，更能满足极端环境中低菌体密度的浸矿菌PCR 及后续分子水平的生态群落分析。因而，用此方法可以解决在浸矿中DNA 提取回收率和纯度低的问题，能够较好的还原菌群中各种菌的比例和数量，尤其对于群落结构分析中低丰度菌的DNA 提取有很重要的应用价值。
致谢：
在论文的完成中，艾郴彬博士对论文审阅提供了重要修改意见，中南大学生物冶金重点实验室为实验提供了实验材料和仪器设备，国家自然科学基金（20803094）、中国博士后特别资助（2012T50710）、湖南省科技计划项目为实验提供了基金资助，在此表示感谢。
现代生物医学进展www.shengwuyixue.com Progress in Modern Biomedicine Vol.14NO.1JAN.2014
·17·
并且还能参与肝癌的VEGF 促进了血管的形成从而增加血供，
VEGF 的蛋白表达侵袭转移过程。我们结果发现OPN 下降后，
及活力也下降了，提示OPN 参与肝癌侵袭的部分机制可能是通过调控VEGF 来实现的。但是OPN 是如何调控MMP-2和VEGF 尚待进一步实验来研究。
OPN 作为一种十分重要的肿瘤相关蛋白，综上所述，目前受到人们的重视。既往研究和我们的实验结果发现在肝癌中OPN 表达增加，并且抑制OPN 的表达能够有效降低肝癌细胞的侵袭能力，就其机制可能是通过调控MMP-2和VEGF 来实现的，所以针对OPN 的研究可能最为肝癌转移治疗的靶点，但OPN 具体参与肝癌侵袭的机制尚待进一步研究。
参考文献(References)
[1]Hanazaki K, Kajikawa s, Shimozawa N, et a1. Survival and recurrence
after hepatic resection of 386consecutive patients with hepatocellular carcinoma[J].J Am Coil Surg, 2000, 191(4):381-388
[2]Masuzaki R, Karp SJ, Omata M. New serum markers of hepatocellular
carcinoma[J].Seminars in oncology, 2012,39(4):434-439
[3]Wai PY, Kuo PC. The role of osteopotin in tumor metastasis[J].J Surg
Res, 2004, 121(2):228-241
[4]Sun J, Xu HM, Zhou HJ, et a1. The prognostic significance of preoper-ative plasma levels of osteopontin in patients with TNM stage-I of hepatocellular carcinoma[J].J Cancer Res Clin Oncol, 2010, 136:1-7[5]Zhou L, Wang DS, Li QJ, et a1. Downregulation of the Notch signaling
pathway inhibits hepatocellular carcinoma cell invasion by inactivation of matrix metalloproteinase-2and -9and vascular endothelial growth factor[J].Oncol Rep, 2012, 28(3):874-882
[6]Senger DR, Wirth DF, Hynes RO. Transformed mammalian cells secr-et specific proteins and phosphoproteins[J].Cell, 1979, 16(4):885-893[7]Ahmed M, Kundu GC. Osteopontin selectively regulates p70S6K/mT-OR phosphorylation leading to NF-kappaB dependent AP-1-mediated ICAM-1expression in breast cancer cells [J].Molecular cancer, 2010, 9:101
[8]Beausoleil MS, Schulze EB, Goodale D, et al. Deletion of the thromb-in cleavage domain of osteopontin mediates breast cancer cell adhesi-
on, proteolytic activity, tumorgenicity, and metastasis[J].BMCcancer, 2011, 11:25
[9]Anborgh PH, Mutrie JC, Tuck AB, et al. Role of the metastasis-prom-oting protein osteopontin in the tumour microenvironment [J].Journal of cellular and molecular medicine, 2010, 14(8):2037-2044
[10]Coppola D, Szabo M, Boulware D, et a1. Correlation of osteopotin
protein expression and pathological stage across a wide variety of tumor histologies[J].Clin CancerRes,2004, 10(1):184-l90
[11]Gotoh M, Sakamoto M, Kenetaka K, et a1. Overpression of osteopot-in inhepatocellular carcinoma[J].PatholInt, 2002, 52(1):19-24[12]Pan Hw, Ou YH, Peng SY, et a1. Overpression of osteopotin is asso-ciated with intrahepatic memsmsis early recurrence and poorer prog-nosis ofsurgically resected[J].Cancer, 2003, 98(1):l19-127[13]Anborgh PH, Mutrie JC, Tuck AB, et al. Pre-and post-translational
regulation of osteopontin in cancer[J].Journal of cell communication and signaling, 2011, 5(2):111-122
[14]Abu El Makarem MA, Abdel-Aleem A, Ali A, et al. Diagnostic
significance of plasma osteopontin in hepatitis C virus-related hepat-ocellular carcinoma[J].Annals of hepatology, 2011, 10(3):296-305[15]Bandiera E, Zanotti L, Fabricio AS, et al. Cancer antigen 125, human
epididymis 4, kallikrein 6, osteopontin and soluble mesothelin-related peptide immunocomplexed with immunoglobulin M in epithelial ov-arian cancer diagnosis[J].Clinical chemistry and laboratory medicine :CCLM /FESCC, 2013, 51(9):1815-1824
[16]GiannelliG, Bergamini C, Marinosci FE. et a1. Clinical role of MMP-2/TIMP-2imbalance in hepatocellular carcinoma [J].Int J Cancer, 2002, 97(4):425-431
[17]Barak V, Kaiserman I, Frenkel S, et al. The dynamics of serum tumor
markers in predicting metastatic uveal melanoma (part1) [J].Antica-ncer research, 2011, 31(1):345-349
[18]Holash J, Wiegand SJ, Yancopoulos GD. New model of tumor angio-genesis:dynamic balance between vessel regression and growth med-iated by angiopoietins and VEGF[J].Oncogene, 1999, 18(38):5356-5362
（上接第35页）
[15]邹平, 张文彬, 林连兵, 等. 以黄铜矿为主的低品位硫化铜矿生物
浸出体系中的细菌优势菌群[J].过程工程学报, 2008, 8(4):761-767
Zou Pin, Zhang Wen-bin, Lin lian-bing, et al. Dominant bacteria in bioleaching system of low-grade copper sulphide ore consisting mainly of chalcopyritethe chinese journal of process engineering [J].The Chinese Journal of Process Engineering, 2008, 8(4):761-767(InChinese)
[16]曾乐平, 张燕飞, 黄菊芳. 一种有效的抽提浸矿细菌DNA 的方法
[OL].(2011-01-19)[2013-03-31].http://www.paper.edu.cn/release-paper/content/201101-956
Zeng Le-Ping, Zhang Yan-fei, Huang Ju-fang. An effective method of DNA extraction for bioleaching bacteria [OL].(2011-01-19)[2013-03-31].http://www.paper.edu.cn/releasepaper/content/201101-956)[17]张翠, 韩金祥, 赵健, 等. 一种简单快速制备CMV DNA 扩增模板
的方法[J].国外医学(临床生物化学与检验学分册, 2002, 23(6):371-371
Zhang Zui, Han Jin-xiang, Zhao Jian, et al. A simple and rapid meth-od for preparation of CMV DNA amplification template [J].Clinical Biochemistry and Laboratory Medicine, Foreign Medical Sciences, 2002, 23(6):371-371