一株高效石油降解菌的筛选及其降解条件优化
摘要：从中原油田石油污染土壤中分离到一株新的石油降解菌HNAU-1，经16S rDNA 测序鉴定为假单胞菌属（Pseudomonas sp. ）。该菌可以以石油为惟一碳源进行生长，10 d 的降解率可达50.7%。单因素试验表明添加其他碳源（葡萄糖、淀粉和蔗糖）均可抑制该菌对石油的降解；以尿素为氮源，35 ℃（25～35 ℃范围内），pH 7.5，盐度为0.5%，十二烷基硫酸钠为表面活性剂均有利于菌株对石油的降解。
关键词：微生物；降解；石油；优化；筛选
中图分类号：X172 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）16-4141-04
DOI ：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.017 石油是原油和石油制品的总称，是一种由多种烃类（正烷烃、支链烷烃、环烷烃、芳香烃、多环芳烃）及少量非烃化合物和有机金属组成的复杂混合物。据统计，中国每年约有60万t 的石油及其制品通过各种途径进入环境，污染土壤、地下水、河流、海洋[1]。石油烃在环境中的持久性很强，危害性也较大，不仅具有强烈的致癌、致畸和致突变毒性[2-5]，还能通过食物链在动植物体内逐级富集和放大，进而对人体健康造成严重的威胁
[6-8]。石油污染也因此引起人们的高度关注。
对于环境中的石油污染，目前有物理、化学和生物方法将其去除[9]。物理和化学方法虽然见效快，但是成本较高，而且容易造成二次污染，因此限制了其在环境修复中的应用。生物方法最常见的是采用微生物对石油进行降解，该方法成本较低，而且不会造成二次污染，有望成为具有广阔应用前景的修复方法
[10]。但是在中国生物方法并未得到广泛的应用，其原因是降解菌活性不高。本研究从中原油田土壤中筛选得到1株高效石油降解菌，并采用单因素试验对其降解石油的条件进行了优化，有望用于未来石油污染修复中。
1 材料与方法
1.1 试验材料
石油污染土壤采自中原油田，用于分离石油降解菌。 液体培养基成分为：（NH4）2SO4 0.5 g、NaNO3 0.5 g、MgS04·7H2O 0.2 g 、KH2PO4 1.0 g 、NaH2PO4·H2O 1.0 g 、CaCl2 H2O 0.02 g，用去离子水配制成1 L液体培养基，调节pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。
固体培养基在液体培养基基础上添加18 g/L琼脂粉，121 ℃灭菌20 min即可。
无机盐培养基：葡萄糖5 g、NH4NO3 2 g、K2HPO4 0.5 g、KH2PO4 1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、无水CaCl2 0.02 g、NaCl 5 g 、FeCl3·6H2O 0.02 g，用去离子水配制成l L液体培养基，105 ℃灭菌20 min。
1.2 菌株筛选
取1 g石油污染土壤分别添加到100 mL液体培养基中，避光培养（28 ℃，180 r/min）7 d后，转接于新的液体培养基中继续培养，如此反复5次。取0.1 mL培养液均匀涂布在含固体培养基的平板上，30 ℃避光培养，每天观察菌落生长情况。待菌落长出，挑选形态不同的菌落转接到新的含固体培养基的平板上，如此反复数次，直到形成形态单一的菌落，即为纯化的菌株，4 ℃保存，备用[11]。
1.3 菌株鉴定
将纯化后的菌株接种至无机盐培养基培养7 d （28 ℃），观察形态特征，采用DNA 提取试剂盒（TIANGEN 公司）提取菌株总DNA ；采用引物27F 及1492R 进行石油降解菌的16S rDNA 片段的PCR 扩增。PCR 反应条件为：94 ℃预变性8 min ；94 ℃变性1 min ，52 ℃退火1 min ，72 ℃延伸1 min ，34个循环；72 ℃延伸8 min ，4 ℃保存。PCR 产物由北京美亿美生物技术有限公司进行测序，测序结果导入CenBank 数据库中，通过Blast 进行同源性比较。
1.4 石油降解率试验
取1 mL 菌液（OD600 nm=0.8）接种至100 mL 液体培养基中，建立降解体系并进行培养（30 ℃、180 r/min），10 d后分析降解体系中石油含量，以不接菌的处理作为对照。
为研究不同反应条件对菌株降解石油的影响，进行以下5组单因素试验：
1）不同石油浓度：0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%。
2）不同温度：25、30和35 ℃。
3）不同pH ：pH 6.5、7.5和8.5。
4）不同盐度：0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%。
5）不同表面活性剂：0.5%曲拉通X-100（TX-100）、0.5%十二烷基硫酸钠（SDS ）和0.5%吐温-80。
1.5 石油含量分析
采用重量法分析石油含量[12]。具体方法：在石油降解体系中加入20 mL 石油醚，萃取培养基中的石油，重复操作3次；合并上层液，转至分液漏斗，剧烈振荡5 min ，静置，待分层后进行分离。用石油醚洗涤三角瓶2～3次，再合并上层液。将其在58 ℃条件下蒸发，待石油醚完全蒸发，残留石油组分置于干燥器中冷却至恒重，称量。计算石油的降解率公式为： 降解率=（m1-m2）/m×100%
式中，m 为培养体系中初始石油质量；m1为对照组的残油质量；m2为样品的残油质量。
1.6 数据统计
采用SPSS 13.0软件进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 菌株的鉴定
对分离到的石油降解菌HNAU-1进行形态观察，发现菌株边缘整齐，表面湿润，红棕色，半透明，细胞大小为（0.8～1.0）
μm ×（1.5～2.5） μm ，有鞭毛，呈杆状。提取该菌DNA ，经PCR 扩增、16S rDNA测序，然后通过Blast 检索并与GenBank 中序列进行比对，发现该菌基因序列与Pseudomonas sp. 相似度达97%（图1），表明该菌属于假单胞菌属。 2.2 菌株的生长及对石油的降解特性
以石油为惟一碳源研究菌株HNAU-1的生长曲线和石油降解特性（图2），结果发现OD600 nm在培养期内呈逐步上升趋势，在第10天达到最大值（1.23）。石油的降解率在培养期内也呈逐步上升趋势，在第10天达到最大值（50.7%），较芽孢杆菌属H1对石油的降解率高（35%）[13]，由此可见，该菌株能以石油为惟一碳源进行生长，并具有较高的石油降解能力。
2.3 不同碳源对菌株降解石油的影响
通过比较不同碳源对菌株降解石油的影响（图3）发现，不加外源碳源菌株对石油的降解率为48.7%，而在培养基中添加葡萄糖、蔗糖和淀粉时，均不同程度抑制了菌株对石油的降解。其中，葡萄糖的抑制作用最大，降解率仅为9.7%；其次为蔗糖和淀粉，降解率为24.7%和36.5%，这可能与不同碳源的生物可利用性有关，石油属疏水性物质，不易被微生物利用，而3种外源碳源均较石油容易被微生物利用，当这些碳源耗尽时，石油才可被进一步利用，从而被降解。3种外加碳源之中，葡萄糖最容易被利用，因此对石油的降解抑制作用最大。目前碳源对石油降解影响的资料较为少见，该现象提示当采用微生物降解石油时，应
避免存在其他容易利用的碳源，否则会降低菌株对石油的降解率。
2.4 不同氮源对菌株降解石油的影响
通过比较不同氮源对菌株降解石油的影响（图4），发现尿素作为氮源时，菌株对石油的降解率最高，达到54.9%，其次为硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵和蛋白胨，降解率分别为31.4%、30.7%、24.7%和18.0%。王鑫等[14]曾研究了不同氮源对微生物降解石油能力的影响，发现菌株R4和D3的最优氮源为NaNO3，T4的最优氮源为NH4NO3，可见对于不同菌株，最佳的氮源是不同的。陈梅梅等[15]发现芽孢杆菌的最佳氮源为尿素，与本研究结果相似。
2.5 不同盐度对菌株降解石油的影响
通过比较不同盐度对菌株降解石油的影响（图5），发现随着培养基中盐度的增加，菌株对石油的降解率呈现先增加后降低的趋势，当培养基盐度为0时，菌株对石油的降解率最低，仅为35.5%，当盐度增加到0.5%时，菌株对石油的降解率达到最大值（77.4%），其后随着盐度的增加，菌株对石油的降解率稍有降低，维持在62.5%～67.2%之间。表明适当的盐度有利于菌株对石油的降解，以0.5%为宜。这可能与微生物的长期生存环境有关，该菌株从中原油田附近土壤分离得到，该地区不仅受到石油污染，同时土壤中还有较高的盐分，微生物可能已经适应了高盐的生存环境。多数石油降解菌都具有耐盐能力，例如假单胞菌属
DH-5、克雷伯氏菌属DH-9和芽孢杆菌属X-1均在2%的盐度条件下对石油的降解率最高[16，17]；在石油污染土壤修复过程中，含盐量也极大地影响着微生物修复效率，土壤中含盐量为0.01%比含盐量0.22%的石油的降解率增加了1.22倍[18]。菌株HNAU-1在0.5%～2.0%的含盐范围内石油降解率均可达60%以上，因此尤其适合高盐石油污染土壤的修复。
2.6 不同温度对菌株降解石油的影响
通过比较不同温度对菌株降解石油的影响（图6），发现随着温度的升高（25～35 ℃），菌株对石油的降解率呈逐渐增加的趋势，其中，以温度达到35 ℃时降解率最高，为55.2%，而温度为25 ℃时石油降解率最低，只有17.0%，表明该菌株最适温度为35 ℃，而当温度过低，降解率会急剧降低，因此该菌株不适合低温环境下对石油的修复。这与辛蕴甜等[12]的研究结果相似。
2.7 不同pH 对菌株降解石油的影响
通过比较不同pH 对菌株降解石油的影响（图7），发现在一定范围内（pH 6.5～8.5，为北方土壤常见的pH ），随着pH 的升高，降解率呈现先上升后降低的趋势。当pH 6.5时，降解率只有10.8%，当pH 7.5时，降解率最大，达到50.3%，之后当pH 继续升高，降解率开始下降，当pH 8.5时，降解率仅为37.6%。表明该菌株对pH 较为敏感，过高或过低的pH 均会抑制其对石油的降解，最适pH 为7.5。而辛蕴甜等[12]分离到的芽孢杆菌降
解石油最适pH 为7.0，表明不同菌株最适的pH 不同，应与菌株所处的环境有关。
2.8 不同表面活性剂对菌株降解石油的影响
通过比较发现不同表面活性剂对菌株降解石油的影响不同（图8）。不添加表面活性剂菌株对石油的降解率为34.6%，添加TX-100（曲拉通X-100）和SDS （十二烷基硫酸钠）均显著提高了菌株对石油的降解率，分别达到63.6%和67.3%，而添加Tween-80显著抑制了菌株对石油的降解，降解率仅为16.8%。添加表面活性剂是改进菌株对疏水性底物利用的重要措施，张丽芳等[19]研究了4种表面活性剂对微生物降解石油的影响，发现较低浓度的表面活性剂促进石油降解，而当浓度过高时抑制石油降解，可能与表面活性剂本身的毒性有关，本研究发现的Tween-80抑制了石油的降解，可能是由于菌株对Tween-80的耐受性低造成的。
3 小结
从中原油田石油污染土壤中分离到一株石油降解菌HNAU-1，经16S rDNA测序鉴定为假单胞菌属，该菌可以以惟一碳源代谢石油，外加葡萄糖、淀粉和蔗糖均能抑制该菌对石油的降解，采用该菌降解石油，其最佳降解条件为：以尿素为氮源，35 ℃（25～35 ℃范围内），pH 7.5，盐度为0.5%，SDS 为表面活性剂，这些结果为进一步采用该菌用于石油土壤修复奠定了基础。
参考文献：
[1] 袁红莉，杨金水，王占生. 降解石油微生物菌种的筛选及降解特性[J].中国环境科学，2003，23（2）：157-161.
[2] 岳战林，蒋平安. 石油类污染物的特性及环境行为[J].石化技术与应用，2006，24（4）：307-308.
一株高效石油降解菌的筛选及其降解条件优化
摘要：从中原油田石油污染土壤中分离到一株新的石油降解菌HNAU-1，经16S rDNA 测序鉴定为假单胞菌属（Pseudomonas sp. ）。该菌可以以石油为惟一碳源进行生长，10 d 的降解率可达50.7%。单因素试验表明添加其他碳源（葡萄糖、淀粉和蔗糖）均可抑制该菌对石油的降解；以尿素为氮源，35 ℃（25～35 ℃范围内），pH 7.5，盐度为0.5%，十二烷基硫酸钠为表面活性剂均有利于菌株对石油的降解。
关键词：微生物；降解；石油；优化；筛选
中图分类号：X172 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）16-4141-04
DOI ：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.017 石油是原油和石油制品的总称，是一种由多种烃类（正烷烃、支链烷烃、环烷烃、芳香烃、多环芳烃）及少量非烃化合物和有机金属组成的复杂混合物。据统计，中国每年约有60万t 的石油及其制品通过各种途径进入环境，污染土壤、地下水、河流、海洋[1]。石油烃在环境中的持久性很强，危害性也较大，不仅具有强烈的致癌、致畸和致突变毒性[2-5]，还能通过食物链在动植物体内逐级富集和放大，进而对人体健康造成严重的威胁
[6-8]。石油污染也因此引起人们的高度关注。
对于环境中的石油污染，目前有物理、化学和生物方法将其去除[9]。物理和化学方法虽然见效快，但是成本较高，而且容易造成二次污染，因此限制了其在环境修复中的应用。生物方法最常见的是采用微生物对石油进行降解，该方法成本较低，而且不会造成二次污染，有望成为具有广阔应用前景的修复方法
[10]。但是在中国生物方法并未得到广泛的应用，其原因是降解菌活性不高。本研究从中原油田土壤中筛选得到1株高效石油降解菌，并采用单因素试验对其降解石油的条件进行了优化，有望用于未来石油污染修复中。
1 材料与方法
1.1 试验材料
石油污染土壤采自中原油田，用于分离石油降解菌。 液体培养基成分为：（NH4）2SO4 0.5 g、NaNO3 0.5 g、MgS04·7H2O 0.2 g 、KH2PO4 1.0 g 、NaH2PO4·H2O 1.0 g 、CaCl2 H2O 0.02 g，用去离子水配制成1 L液体培养基，调节pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。
固体培养基在液体培养基基础上添加18 g/L琼脂粉，121 ℃灭菌20 min即可。
无机盐培养基：葡萄糖5 g、NH4NO3 2 g、K2HPO4 0.5 g、KH2PO4 1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、无水CaCl2 0.02 g、NaCl 5 g 、FeCl3·6H2O 0.02 g，用去离子水配制成l L液体培养基，105 ℃灭菌20 min。
1.2 菌株筛选
取1 g石油污染土壤分别添加到100 mL液体培养基中，避光培养（28 ℃，180 r/min）7 d后，转接于新的液体培养基中继续培养，如此反复5次。取0.1 mL培养液均匀涂布在含固体培养基的平板上，30 ℃避光培养，每天观察菌落生长情况。待菌落长出，挑选形态不同的菌落转接到新的含固体培养基的平板上，如此反复数次，直到形成形态单一的菌落，即为纯化的菌株，4 ℃保存，备用[11]。
1.3 菌株鉴定
将纯化后的菌株接种至无机盐培养基培养7 d （28 ℃），观察形态特征，采用DNA 提取试剂盒（TIANGEN 公司）提取菌株总DNA ；采用引物27F 及1492R 进行石油降解菌的16S rDNA 片段的PCR 扩增。PCR 反应条件为：94 ℃预变性8 min ；94 ℃变性1 min ，52 ℃退火1 min ，72 ℃延伸1 min ，34个循环；72 ℃延伸8 min ，4 ℃保存。PCR 产物由北京美亿美生物技术有限公司进行测序，测序结果导入CenBank 数据库中，通过Blast 进行同源性比较。
1.4 石油降解率试验
取1 mL 菌液（OD600 nm=0.8）接种至100 mL 液体培养基中，建立降解体系并进行培养（30 ℃、180 r/min），10 d后分析降解体系中石油含量，以不接菌的处理作为对照。
为研究不同反应条件对菌株降解石油的影响，进行以下5组单因素试验：
1）不同石油浓度：0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%。
2）不同温度：25、30和35 ℃。
3）不同pH ：pH 6.5、7.5和8.5。
4）不同盐度：0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%。
5）不同表面活性剂：0.5%曲拉通X-100（TX-100）、0.5%十二烷基硫酸钠（SDS ）和0.5%吐温-80。
1.5 石油含量分析
采用重量法分析石油含量[12]。具体方法：在石油降解体系中加入20 mL 石油醚，萃取培养基中的石油，重复操作3次；合并上层液，转至分液漏斗，剧烈振荡5 min ，静置，待分层后进行分离。用石油醚洗涤三角瓶2～3次，再合并上层液。将其在58 ℃条件下蒸发，待石油醚完全蒸发，残留石油组分置于干燥器中冷却至恒重，称量。计算石油的降解率公式为： 降解率=（m1-m2）/m×100%
式中，m 为培养体系中初始石油质量；m1为对照组的残油质量；m2为样品的残油质量。
1.6 数据统计
采用SPSS 13.0软件进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 菌株的鉴定
对分离到的石油降解菌HNAU-1进行形态观察，发现菌株边缘整齐，表面湿润，红棕色，半透明，细胞大小为（0.8～1.0）
μm ×（1.5～2.5） μm ，有鞭毛，呈杆状。提取该菌DNA ，经PCR 扩增、16S rDNA测序，然后通过Blast 检索并与GenBank 中序列进行比对，发现该菌基因序列与Pseudomonas sp. 相似度达97%（图1），表明该菌属于假单胞菌属。 2.2 菌株的生长及对石油的降解特性
以石油为惟一碳源研究菌株HNAU-1的生长曲线和石油降解特性（图2），结果发现OD600 nm在培养期内呈逐步上升趋势，在第10天达到最大值（1.23）。石油的降解率在培养期内也呈逐步上升趋势，在第10天达到最大值（50.7%），较芽孢杆菌属H1对石油的降解率高（35%）[13]，由此可见，该菌株能以石油为惟一碳源进行生长，并具有较高的石油降解能力。
2.3 不同碳源对菌株降解石油的影响
通过比较不同碳源对菌株降解石油的影响（图3）发现，不加外源碳源菌株对石油的降解率为48.7%，而在培养基中添加葡萄糖、蔗糖和淀粉时，均不同程度抑制了菌株对石油的降解。其中，葡萄糖的抑制作用最大，降解率仅为9.7%；其次为蔗糖和淀粉，降解率为24.7%和36.5%，这可能与不同碳源的生物可利用性有关，石油属疏水性物质，不易被微生物利用，而3种外源碳源均较石油容易被微生物利用，当这些碳源耗尽时，石油才可被进一步利用，从而被降解。3种外加碳源之中，葡萄糖最容易被利用，因此对石油的降解抑制作用最大。目前碳源对石油降解影响的资料较为少见，该现象提示当采用微生物降解石油时，应
避免存在其他容易利用的碳源，否则会降低菌株对石油的降解率。
2.4 不同氮源对菌株降解石油的影响
通过比较不同氮源对菌株降解石油的影响（图4），发现尿素作为氮源时，菌株对石油的降解率最高，达到54.9%，其次为硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵和蛋白胨，降解率分别为31.4%、30.7%、24.7%和18.0%。王鑫等[14]曾研究了不同氮源对微生物降解石油能力的影响，发现菌株R4和D3的最优氮源为NaNO3，T4的最优氮源为NH4NO3，可见对于不同菌株，最佳的氮源是不同的。陈梅梅等[15]发现芽孢杆菌的最佳氮源为尿素，与本研究结果相似。
2.5 不同盐度对菌株降解石油的影响
通过比较不同盐度对菌株降解石油的影响（图5），发现随着培养基中盐度的增加，菌株对石油的降解率呈现先增加后降低的趋势，当培养基盐度为0时，菌株对石油的降解率最低，仅为35.5%，当盐度增加到0.5%时，菌株对石油的降解率达到最大值（77.4%），其后随着盐度的增加，菌株对石油的降解率稍有降低，维持在62.5%～67.2%之间。表明适当的盐度有利于菌株对石油的降解，以0.5%为宜。这可能与微生物的长期生存环境有关，该菌株从中原油田附近土壤分离得到，该地区不仅受到石油污染，同时土壤中还有较高的盐分，微生物可能已经适应了高盐的生存环境。多数石油降解菌都具有耐盐能力，例如假单胞菌属
DH-5、克雷伯氏菌属DH-9和芽孢杆菌属X-1均在2%的盐度条件下对石油的降解率最高[16，17]；在石油污染土壤修复过程中，含盐量也极大地影响着微生物修复效率，土壤中含盐量为0.01%比含盐量0.22%的石油的降解率增加了1.22倍[18]。菌株HNAU-1在0.5%～2.0%的含盐范围内石油降解率均可达60%以上，因此尤其适合高盐石油污染土壤的修复。
2.6 不同温度对菌株降解石油的影响
通过比较不同温度对菌株降解石油的影响（图6），发现随着温度的升高（25～35 ℃），菌株对石油的降解率呈逐渐增加的趋势，其中，以温度达到35 ℃时降解率最高，为55.2%，而温度为25 ℃时石油降解率最低，只有17.0%，表明该菌株最适温度为35 ℃，而当温度过低，降解率会急剧降低，因此该菌株不适合低温环境下对石油的修复。这与辛蕴甜等[12]的研究结果相似。
2.7 不同pH 对菌株降解石油的影响
通过比较不同pH 对菌株降解石油的影响（图7），发现在一定范围内（pH 6.5～8.5，为北方土壤常见的pH ），随着pH 的升高，降解率呈现先上升后降低的趋势。当pH 6.5时，降解率只有10.8%，当pH 7.5时，降解率最大，达到50.3%，之后当pH 继续升高，降解率开始下降，当pH 8.5时，降解率仅为37.6%。表明该菌株对pH 较为敏感，过高或过低的pH 均会抑制其对石油的降解，最适pH 为7.5。而辛蕴甜等[12]分离到的芽孢杆菌降
解石油最适pH 为7.0，表明不同菌株最适的pH 不同，应与菌株所处的环境有关。
2.8 不同表面活性剂对菌株降解石油的影响
通过比较发现不同表面活性剂对菌株降解石油的影响不同（图8）。不添加表面活性剂菌株对石油的降解率为34.6%，添加TX-100（曲拉通X-100）和SDS （十二烷基硫酸钠）均显著提高了菌株对石油的降解率，分别达到63.6%和67.3%，而添加Tween-80显著抑制了菌株对石油的降解，降解率仅为16.8%。添加表面活性剂是改进菌株对疏水性底物利用的重要措施，张丽芳等[19]研究了4种表面活性剂对微生物降解石油的影响，发现较低浓度的表面活性剂促进石油降解，而当浓度过高时抑制石油降解，可能与表面活性剂本身的毒性有关，本研究发现的Tween-80抑制了石油的降解，可能是由于菌株对Tween-80的耐受性低造成的。
3 小结
从中原油田石油污染土壤中分离到一株石油降解菌HNAU-1，经16S rDNA测序鉴定为假单胞菌属，该菌可以以惟一碳源代谢石油，外加葡萄糖、淀粉和蔗糖均能抑制该菌对石油的降解，采用该菌降解石油，其最佳降解条件为：以尿素为氮源，35 ℃（25～35 ℃范围内），pH 7.5，盐度为0.5%，SDS 为表面活性剂，这些结果为进一步采用该菌用于石油土壤修复奠定了基础。
参考文献：
[1] 袁红莉，杨金水，王占生. 降解石油微生物菌种的筛选及降解特性[J].中国环境科学，2003，23（2）：157-161.
[2] 岳战林，蒋平安. 石油类污染物的特性及环境行为[J].石化技术与应用，2006，24（4）：307-308.