中国生物制品学杂志2009年12月第22卷第12期ChinJBiologicalsDecember2009，Vol.22No.12中国图书分类号R373.1+3文献标识码A文章编号1004-5503（2009）12-1193-03
·1193·
【预防制品】
甲型H1N1流感病毒核酸国家参考品的研制
范行良1李长贵1王大燕2方捍华1李凤翔1白东亭1王军志1
【摘要】目的研制甲型H1N1流感病毒核酸国家参考品。方法收集甲型H1N1流感病毒及其他病毒培养物，用实时荧参考品通过协同标定，确定最低检出限范围，7家单位进行适用性检测。反复冻融观察其稳定性。结光PCR方法逐一进行验证。
特异性良好，经基因芯片进一步验证，均为甲型H1N1流感病毒，且无其他病毒核酸果所用的3株病毒经实时荧光PCR验证，
污染，经7家单位检测，符合国家参考品标准要求；反复冻融3次后，稳定性良好。结论建立了第1套甲型H1N1流感病毒核酸国家参考品及相应的质量标准，并已被国家有关部门批准正式使用。【关键词】甲型H1N1流感病毒；核酸；国家参考品
PreparationofNationalReferencePanelofInfluenzaA（H1N1）VirusNucleicAcid
FANXing-liang△,LIChang-gui,WANGDa-yan,etal（△NationalInstitutefortheControlofPharmaceuticalandBiologicalProducts,Beijing100050,China）
【Abstract】Objective
TopreparenationalreferencepanelofinfluenzaA（H1N1）virusnucleicacid.MethodsThecultures
ofinfluenzaA（H1N1）virusandotherinfluenzaviruseswerecollectedandverifiedindividuallybyreal-timefluorescentPCR.Thereferencepanelswerecollaborativelycalibratedtodeterminetheminimumdetectionlimit,thentestedforadaptivityby7laboratories,andobservedforstabilitybyrepeatfreezingandthawing.Results
Threevirusstrainsshowedhighspecificitiesbyreal-timefluores－
centPCRandwasfurtherverifiedasinfluenzaA（H1N1）virusfreefromcontaminationwithotherviralnucleicacidsbygenechiptechnique.Thetestresultsby7laboratoriesprovedthatthereferencemettherequirementsfornationalreferencepanel.Therefer－enceshowedgoodstabilityafter3cyclesoffreezingandthawing.ConclusionThefirstgenerationofnationalreferencepanelofin－fluenzaA（H1N1）virusnucleicacidaswellastherelevantqualitystandardwereestablishedandapprovedbythestatedepartmentsconcerned.
【Keywords】InfluenzaA（H1N1）virus;Nucleicacid;Nationalreferencepanel
自2009年3月墨西哥发现首个感染病例之后，甲型H1N1流感病毒在全球迅速传播。为了准确、迅速地判断患者是否感染甲型H1N1流感病毒，各种诊断方法和试剂不断出现，为临床诊断和针对性治疗提供了重要依据［1］。流感病毒快速检测方法通常包括抗原检测和核酸检测两大类。目前，甲型H1N1流感病毒的确诊主要依据核酸检测，WHO及我国卫生部先后将核酸检测作为重要的检测手段。我国已有多家单位研制成功甲型H1N1流感病毒核酸检测试剂，4家企业的产品已进入注册审批程序。为了对此类产品进行科学有效的质量控制，本文参考有关文献［2～8］，研制了甲型H1N1流感病毒核酸国家参考品，并制订了甲型H1N1流感病毒核酸检测试剂盒质量标准，均已被国家有关部门批准正式使用。
基金项目：科技部甲型H1N1流感联防控应急科研项目
）.（2009BAKYJ002
作者单位：1中国药品生物制品检定所（北京100050）；2中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所（北京100052）.
通讯作者：王军志，E-mail：[email protected].材料与方法
1.1样品
3株甲型H1N1流感病毒A／California／07／2009（H1N1）、A／Beijing／SWL5／2009（H1N1）和A／Sichuan／SWL1／2009（H1N1）［A／California／07／2009（H1N1）为国际标准株，A／Beijing／SWL5／2009（H1N1）和A/Sichuan／SWL1／2009（H1N1）为中国
、季节性H1N1流感病毒、季节性H3N2流分离株］
感病毒、季节性乙型流感病毒及人禽流感病毒H5N1培养液均来自于中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所；呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒等其他呼吸道病毒培养液由中国药品生物制品检定所提供。
1.2主要试剂
甲型H1N1流感病毒核酸检测试剂盒（复合探针实时荧光RT-PCR法）和甲型H1N1流感病毒核酸检测与快速鉴别试剂盒（基因芯片法）均由中国军事医学科学院放射与辐射医学研究所研制；甲型H1N1流感病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）
·1194·
中国生物制品学杂志2009年12月第22卷第12期ChinJBiologicalsDecember2009，Vol.22No.12
由中山大学达安基因股份有限公司研制；甲型H1N1流感病毒RNA检测试剂盒（PCR荧光法）由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所研制；甲型H1N1
流感病毒Real-timePCR检测试剂由中国检验检疫科学研究院卫生检疫研究所研制；甲型H1N1流感病毒核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法)由上海科华生物工程股份有限公司研制；流感病毒检测试剂盒（荧光定量PCR法）由中科院北京基因组研究所研制；新型甲型（H1N1）流感病毒核酸检测试剂盒（Real-timeRT-PCR法）由上海之江生物科技有限公司研制。1.3样品的验证
根据甲型H1N1流感病毒与季节性流感病毒的不同，在N基因片段设计特异性引物探针。用WHO及我国“甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案”推荐的HA基因实时荧光PCR引物探针、季节性流感病毒H1N1亚型检测引物及通用甲型流感病毒基因实时荧光PCR引物探针分别对甲型H1N1流感病毒和季节性甲型流感病毒培养液进行甲型H1N1流感病毒的检测，基因芯片法对甲型H1N1流感病毒进一步确证，人禽流感病毒H5N1培养液用甲型流感病毒通用型引物探针进行验证，其他呼吸道病毒均经荧光PCR方法进行验证。1.4协同标定及参考品标准的制定
由中国药品生物制品检定所、中山大学达安基因股份有限公司及中国军事医学科学院放射与辐射医学研究所，分别使用中山大学达安基因股份有限公司研制的甲型H1N1流感病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）对参考品进行独立检测，确定最低检出限范围，结果用于参考品标准的制定。1.5参考品适用性检测
将甲型H1N1流感病毒国家参考品分别发放给上述7家甲型H1N1流感病毒实时荧光PCR检测试剂研发单位，分别进行自检，对参考品及质量标准的可行性进行分析。1.6试剂的稳定性检测
将-20℃保存的4套留样参考品，反复冻融0～3次，用中山大学达安基因股份有限公司研制的甲型H1N1流感病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）检测冻融过程对参考品的影响。2.结果
2.1样品的验证
验证结果表明，所使用的各病毒株均具有良好的特异性，见表1。基因芯片法对甲型H1N1流感病毒进行进一步确证的结果表明，此3株病毒均为甲
且样品中无季节性H1N1、季节型H1N1流感病毒，
性H3N2、禽流感H5N1及猪H1N1流感病毒核酸污染，见图1。其他阴性参考品以上检测均为阴性。
表1甲型流感病毒荧光PCR验证结果
Tab1.ValidationresultofinfluenzaAvirusbyreal-timefluorescentPCR
流感病毒株A／Beijing／SWL5／）2009（H1N1A／California／07／2009（H1N1）A／Sichuan／SWL1／）2009（H1N1A／Guangdongbaoan／51／2008（H1N1）A／Guangdongluohu／（H1N1）219／2006
A／Anhuibaohe／137／2008（H3N2）
A／Jiangxidonghu／312／（H3N2）2006A／Anhui／1／2005（H5N1）
---+
---+
---+
--+
+
--+
+
+
+
-+
+
+
-+
季节性流感
病毒H1N1亚型HA基因NA基因甲型H1N1+
+
-甲型通
用M基
因引物
+
ABC
A：A／Beijing／SWL5／2009（H1N1）；B：A／California／07／2009（H1N1）；C：A／Sichuan／SWL1／2009（H1N1）
图1甲型H1N1流感病毒基因芯片检测
Fig1.DetectionresultofinfluenzaA（H1N1）virusbygenechiptechnique
注：图中白色框线内区域为甲型H1N1流感病毒检测区
2.2最低检出限参考品的标定
将灭活的A／Beijing／SWL5／2009（H1N1）病毒培养液倍比稀释，制备梯度系列参考品S1～S5。协同标定结果表明，在S1～S3范围，CT值与稀释倍数符合线性比例关系，S3～S4进入平台期，CT值与稀释倍数已不符合线性比例关系，即相近的CT值对应的稀释倍数差异较大。因此，本研究将S3设定为最低检出限。
中国生物制品学杂志2009年12月第22卷第12期ChinJBiologicalsDecember2009，Vol.22No.12
·1195·
2.3参考品的组成
本套参考品共由20份样品（12份阴性参考品，2份阳性参考品，5份最低检出限参考品和1份精密性参考品）组成，合格标准见表2。
表2甲型H1N1流感病毒核酸国家参考品合格标准Tab2.RequirementfornationalreferencepanelofinfluenzaA（H1N1）virusnucleicacid
参考品阴性阳性最低检出限精密性
份数12251
符合率2／2≥3／5
变异系数（CV）≤10.0%（n＝10）
合格标准
符合率12／12
本研究在选择甲型H1N1流感病毒阳性样品时，既选择了国外的标准株A／California／07／2009（H1N1），也选择了国内分离株A／Beijing／SWL5／
2009（H1N1）和A／Sichuan／SWL1／2009（H1N1）。在选择国内病毒株时还兼顾了我国南北方病毒株可能存在的区域性差异。阴性参考品既包括与甲型流感病毒结构类似的病毒，如季节性甲型流感病毒；还包括临床症状类似的病毒，如呼吸道合胞病毒等，以期对试剂盒的特异性进行充分的考查，防止假阳性结果。在组建参考品前，用实时荧光PCR的方法对所有原料进行了验证和确认。本研究通过系列稀释的方法建立了最低检出量系列参考品，通过协同标定制定了最低检出限标准。
考虑到在保存、使用及运输过程中可能出现的冻融情况，本文对参考品的稳定性进行了研究，结果
检测结果仍可达到国家参考品表明反复冻融3次，
合格标准，参考品较为稳定。
通过统一评估中选出的7种诊断试剂对此套参考品进行检测，结果均符合参考品要求，没有假阳性和假阴性结果，CT值的CV值也均在5％以下，说明这7种诊断试剂具有较好的特异性和灵敏度，检测结果的重现性较好，具有一定的抗干扰能力。
综上所述，本套参考品能够对甲型H1N1流感病毒核酸检测试剂进行有效的质量控制，从而促进甲型H1N1流感防控工作更加科学有效地进行。
（致谢：本研究得到中国军事医学科学院放射与辐射医
冻融次数
2.4参考品的适用性
7家单位分别对参考品进行检测，结果均符合
国家参考品标准要求。
2.5试剂的稳定性
检测结果表明，反复冻融3次后，阳性参考品符合率、阴性参考品符合率及精密性与冻融前无显著差异。最低检出限样品S3在冻融前（CT值34.51）已接近灰区（CT值35～37），反复冻融2次及3次后结果进入灰区，但仍可满足标准要求，见表3。
表3参考品反复冻融后的稳定性
Tab3.Stabilityofnationalreferencepanelafterrepeatfreezingandthawing
参考品P1～P2N1～N12S1～S5CV（％）
0＋-4／52.1
1＋-4／51.3
2＋-3／52.2
3＋-3／52.7
学研究所王升启教授；北京万泰生物药业股份有限公司邱子欣、李益民；中山大学达安基因股份有限公司高旭年、陈华云及其他相关企业的大力支持，特此感谢。）参考文献
［1］WhileyDM,BialasiewiczS,BletchlyC,etal.Detectionofnovel
influenzaA（H1N1）virusbyreal-timeRT-PCR.JClinVirol,2009,45（3）:203-204.［2］许四宏，宋爱京，聂建辉，等.HIV-1核酸血筛试剂国家参考品的
研制.中国生物制品学杂志，2009，22（2）：68-70.［3］谷金莲，祁自柏，杨振，等.第5套丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国
2006，19（1）：68-70.家参考品的研制.中国生物制品学杂志，
［4］祁自柏，周诚，杨振，等.第3代丙肝试剂国家参考品的研制及初
步应用.中国生物制品学杂志，1999，12（2）：103-105.［5］张春涛，宋爱京，李秀华，等.人类免疫缺陷病毒1型RNA定量
参考品的研制.中华实验和临床病毒学杂志，2004,18（4）：321-324.
［6］GartenRJ,DavisCT,RussellCA,etal.Antigenicandgenetic
characteristicsofswine-origin2009A（H1N1）influenzavirusescirculatinginhumans.Science,2009,325（5937）:197-201.
［7］GathererD.The2009H1N1influenzaoutbreakinitshistorical
context.JClinVirol,2009,45（3）:174-178.
［8］CentersforDiseaseControlandPrevention（CDC）.Evaluationof
rapidinfluenzadiagnostictestsfordetectionofnovelinfluenzaA（H1N1）virus-UnitedStates,2009.MMWRMorbMortalWklyRep,2009,58（30）:826-829.
（收稿日期：2009-09-18）
3.讨论
此次流行的甲型H1N1流感病毒为2009年新
出现的病毒株，与以往季节性流感H1N1亚型病毒株存在较大的差异。为满足疾病控制及临床诊断的需要，很多研究单位及企业相继开发出多种核酸检测试剂盒。为了评估这些试剂盒的质量，科技部委托中国药品生物制品检定所牵头对33种核酸检测试剂进行了统一评估，筛选出了特异性及灵敏度较好的7种实时荧光PCR检测试剂。本研究是在此基础上进行的。
甲型H1N1流感病毒自从发现后，很多病毒株均已测序，结果表明，截至目前为止，此株病毒基因序列较为稳定，核酸序列总体上没有发生明显的变异。
中国生物制品学杂志2009年12月第22卷第12期ChinJBiologicalsDecember2009，Vol.22No.12中国图书分类号R373.1+3文献标识码A文章编号1004-5503（2009）12-1193-03
·1193·
【预防制品】
甲型H1N1流感病毒核酸国家参考品的研制
范行良1李长贵1王大燕2方捍华1李凤翔1白东亭1王军志1
【摘要】目的研制甲型H1N1流感病毒核酸国家参考品。方法收集甲型H1N1流感病毒及其他病毒培养物，用实时荧参考品通过协同标定，确定最低检出限范围，7家单位进行适用性检测。反复冻融观察其稳定性。结光PCR方法逐一进行验证。
特异性良好，经基因芯片进一步验证，均为甲型H1N1流感病毒，且无其他病毒核酸果所用的3株病毒经实时荧光PCR验证，
污染，经7家单位检测，符合国家参考品标准要求；反复冻融3次后，稳定性良好。结论建立了第1套甲型H1N1流感病毒核酸国家参考品及相应的质量标准，并已被国家有关部门批准正式使用。【关键词】甲型H1N1流感病毒；核酸；国家参考品
PreparationofNationalReferencePanelofInfluenzaA（H1N1）VirusNucleicAcid
FANXing-liang△,LIChang-gui,WANGDa-yan,etal（△NationalInstitutefortheControlofPharmaceuticalandBiologicalProducts,Beijing100050,China）
【Abstract】Objective
TopreparenationalreferencepanelofinfluenzaA（H1N1）virusnucleicacid.MethodsThecultures
ofinfluenzaA（H1N1）virusandotherinfluenzaviruseswerecollectedandverifiedindividuallybyreal-timefluorescentPCR.Thereferencepanelswerecollaborativelycalibratedtodeterminetheminimumdetectionlimit,thentestedforadaptivityby7laboratories,andobservedforstabilitybyrepeatfreezingandthawing.Results
Threevirusstrainsshowedhighspecificitiesbyreal-timefluores－
centPCRandwasfurtherverifiedasinfluenzaA（H1N1）virusfreefromcontaminationwithotherviralnucleicacidsbygenechiptechnique.Thetestresultsby7laboratoriesprovedthatthereferencemettherequirementsfornationalreferencepanel.Therefer－enceshowedgoodstabilityafter3cyclesoffreezingandthawing.ConclusionThefirstgenerationofnationalreferencepanelofin－fluenzaA（H1N1）virusnucleicacidaswellastherelevantqualitystandardwereestablishedandapprovedbythestatedepartmentsconcerned.
【Keywords】InfluenzaA（H1N1）virus;Nucleicacid;Nationalreferencepanel
自2009年3月墨西哥发现首个感染病例之后，甲型H1N1流感病毒在全球迅速传播。为了准确、迅速地判断患者是否感染甲型H1N1流感病毒，各种诊断方法和试剂不断出现，为临床诊断和针对性治疗提供了重要依据［1］。流感病毒快速检测方法通常包括抗原检测和核酸检测两大类。目前，甲型H1N1流感病毒的确诊主要依据核酸检测，WHO及我国卫生部先后将核酸检测作为重要的检测手段。我国已有多家单位研制成功甲型H1N1流感病毒核酸检测试剂，4家企业的产品已进入注册审批程序。为了对此类产品进行科学有效的质量控制，本文参考有关文献［2～8］，研制了甲型H1N1流感病毒核酸国家参考品，并制订了甲型H1N1流感病毒核酸检测试剂盒质量标准，均已被国家有关部门批准正式使用。
基金项目：科技部甲型H1N1流感联防控应急科研项目
）.（2009BAKYJ002
作者单位：1中国药品生物制品检定所（北京100050）；2中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所（北京100052）.
通讯作者：王军志，E-mail：[email protected].材料与方法
1.1样品
3株甲型H1N1流感病毒A／California／07／2009（H1N1）、A／Beijing／SWL5／2009（H1N1）和A／Sichuan／SWL1／2009（H1N1）［A／California／07／2009（H1N1）为国际标准株，A／Beijing／SWL5／2009（H1N1）和A/Sichuan／SWL1／2009（H1N1）为中国
、季节性H1N1流感病毒、季节性H3N2流分离株］
感病毒、季节性乙型流感病毒及人禽流感病毒H5N1培养液均来自于中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所；呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒等其他呼吸道病毒培养液由中国药品生物制品检定所提供。
1.2主要试剂
甲型H1N1流感病毒核酸检测试剂盒（复合探针实时荧光RT-PCR法）和甲型H1N1流感病毒核酸检测与快速鉴别试剂盒（基因芯片法）均由中国军事医学科学院放射与辐射医学研究所研制；甲型H1N1流感病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）
·1194·
中国生物制品学杂志2009年12月第22卷第12期ChinJBiologicalsDecember2009，Vol.22No.12
由中山大学达安基因股份有限公司研制；甲型H1N1流感病毒RNA检测试剂盒（PCR荧光法）由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所研制；甲型H1N1
流感病毒Real-timePCR检测试剂由中国检验检疫科学研究院卫生检疫研究所研制；甲型H1N1流感病毒核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法)由上海科华生物工程股份有限公司研制；流感病毒检测试剂盒（荧光定量PCR法）由中科院北京基因组研究所研制；新型甲型（H1N1）流感病毒核酸检测试剂盒（Real-timeRT-PCR法）由上海之江生物科技有限公司研制。1.3样品的验证
根据甲型H1N1流感病毒与季节性流感病毒的不同，在N基因片段设计特异性引物探针。用WHO及我国“甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案”推荐的HA基因实时荧光PCR引物探针、季节性流感病毒H1N1亚型检测引物及通用甲型流感病毒基因实时荧光PCR引物探针分别对甲型H1N1流感病毒和季节性甲型流感病毒培养液进行甲型H1N1流感病毒的检测，基因芯片法对甲型H1N1流感病毒进一步确证，人禽流感病毒H5N1培养液用甲型流感病毒通用型引物探针进行验证，其他呼吸道病毒均经荧光PCR方法进行验证。1.4协同标定及参考品标准的制定
由中国药品生物制品检定所、中山大学达安基因股份有限公司及中国军事医学科学院放射与辐射医学研究所，分别使用中山大学达安基因股份有限公司研制的甲型H1N1流感病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）对参考品进行独立检测，确定最低检出限范围，结果用于参考品标准的制定。1.5参考品适用性检测
将甲型H1N1流感病毒国家参考品分别发放给上述7家甲型H1N1流感病毒实时荧光PCR检测试剂研发单位，分别进行自检，对参考品及质量标准的可行性进行分析。1.6试剂的稳定性检测
将-20℃保存的4套留样参考品，反复冻融0～3次，用中山大学达安基因股份有限公司研制的甲型H1N1流感病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）检测冻融过程对参考品的影响。2.结果
2.1样品的验证
验证结果表明，所使用的各病毒株均具有良好的特异性，见表1。基因芯片法对甲型H1N1流感病毒进行进一步确证的结果表明，此3株病毒均为甲
且样品中无季节性H1N1、季节型H1N1流感病毒，
性H3N2、禽流感H5N1及猪H1N1流感病毒核酸污染，见图1。其他阴性参考品以上检测均为阴性。
表1甲型流感病毒荧光PCR验证结果
Tab1.ValidationresultofinfluenzaAvirusbyreal-timefluorescentPCR
流感病毒株A／Beijing／SWL5／）2009（H1N1A／California／07／2009（H1N1）A／Sichuan／SWL1／）2009（H1N1A／Guangdongbaoan／51／2008（H1N1）A／Guangdongluohu／（H1N1）219／2006
A／Anhuibaohe／137／2008（H3N2）
A／Jiangxidonghu／312／（H3N2）2006A／Anhui／1／2005（H5N1）
---+
---+
---+
--+
+
--+
+
+
+
-+
+
+
-+
季节性流感
病毒H1N1亚型HA基因NA基因甲型H1N1+
+
-甲型通
用M基
因引物
+
ABC
A：A／Beijing／SWL5／2009（H1N1）；B：A／California／07／2009（H1N1）；C：A／Sichuan／SWL1／2009（H1N1）
图1甲型H1N1流感病毒基因芯片检测
Fig1.DetectionresultofinfluenzaA（H1N1）virusbygenechiptechnique
注：图中白色框线内区域为甲型H1N1流感病毒检测区
2.2最低检出限参考品的标定
将灭活的A／Beijing／SWL5／2009（H1N1）病毒培养液倍比稀释，制备梯度系列参考品S1～S5。协同标定结果表明，在S1～S3范围，CT值与稀释倍数符合线性比例关系，S3～S4进入平台期，CT值与稀释倍数已不符合线性比例关系，即相近的CT值对应的稀释倍数差异较大。因此，本研究将S3设定为最低检出限。
中国生物制品学杂志2009年12月第22卷第12期ChinJBiologicalsDecember2009，Vol.22No.12
·1195·
2.3参考品的组成
本套参考品共由20份样品（12份阴性参考品，2份阳性参考品，5份最低检出限参考品和1份精密性参考品）组成，合格标准见表2。
表2甲型H1N1流感病毒核酸国家参考品合格标准Tab2.RequirementfornationalreferencepanelofinfluenzaA（H1N1）virusnucleicacid
参考品阴性阳性最低检出限精密性
份数12251
符合率2／2≥3／5
变异系数（CV）≤10.0%（n＝10）
合格标准
符合率12／12
本研究在选择甲型H1N1流感病毒阳性样品时，既选择了国外的标准株A／California／07／2009（H1N1），也选择了国内分离株A／Beijing／SWL5／
2009（H1N1）和A／Sichuan／SWL1／2009（H1N1）。在选择国内病毒株时还兼顾了我国南北方病毒株可能存在的区域性差异。阴性参考品既包括与甲型流感病毒结构类似的病毒，如季节性甲型流感病毒；还包括临床症状类似的病毒，如呼吸道合胞病毒等，以期对试剂盒的特异性进行充分的考查，防止假阳性结果。在组建参考品前，用实时荧光PCR的方法对所有原料进行了验证和确认。本研究通过系列稀释的方法建立了最低检出量系列参考品，通过协同标定制定了最低检出限标准。
考虑到在保存、使用及运输过程中可能出现的冻融情况，本文对参考品的稳定性进行了研究，结果
检测结果仍可达到国家参考品表明反复冻融3次，
合格标准，参考品较为稳定。
通过统一评估中选出的7种诊断试剂对此套参考品进行检测，结果均符合参考品要求，没有假阳性和假阴性结果，CT值的CV值也均在5％以下，说明这7种诊断试剂具有较好的特异性和灵敏度，检测结果的重现性较好，具有一定的抗干扰能力。
综上所述，本套参考品能够对甲型H1N1流感病毒核酸检测试剂进行有效的质量控制，从而促进甲型H1N1流感防控工作更加科学有效地进行。
（致谢：本研究得到中国军事医学科学院放射与辐射医
冻融次数
2.4参考品的适用性
7家单位分别对参考品进行检测，结果均符合
国家参考品标准要求。
2.5试剂的稳定性
检测结果表明，反复冻融3次后，阳性参考品符合率、阴性参考品符合率及精密性与冻融前无显著差异。最低检出限样品S3在冻融前（CT值34.51）已接近灰区（CT值35～37），反复冻融2次及3次后结果进入灰区，但仍可满足标准要求，见表3。
表3参考品反复冻融后的稳定性
Tab3.Stabilityofnationalreferencepanelafterrepeatfreezingandthawing
参考品P1～P2N1～N12S1～S5CV（％）
0＋-4／52.1
1＋-4／51.3
2＋-3／52.2
3＋-3／52.7
学研究所王升启教授；北京万泰生物药业股份有限公司邱子欣、李益民；中山大学达安基因股份有限公司高旭年、陈华云及其他相关企业的大力支持，特此感谢。）参考文献
［1］WhileyDM,BialasiewiczS,BletchlyC,etal.Detectionofnovel
influenzaA（H1N1）virusbyreal-timeRT-PCR.JClinVirol,2009,45（3）:203-204.［2］许四宏，宋爱京，聂建辉，等.HIV-1核酸血筛试剂国家参考品的
研制.中国生物制品学杂志，2009，22（2）：68-70.［3］谷金莲，祁自柏，杨振，等.第5套丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国
2006，19（1）：68-70.家参考品的研制.中国生物制品学杂志，
［4］祁自柏，周诚，杨振，等.第3代丙肝试剂国家参考品的研制及初
步应用.中国生物制品学杂志，1999，12（2）：103-105.［5］张春涛，宋爱京，李秀华，等.人类免疫缺陷病毒1型RNA定量
参考品的研制.中华实验和临床病毒学杂志，2004,18（4）：321-324.
［6］GartenRJ,DavisCT,RussellCA,etal.Antigenicandgenetic
characteristicsofswine-origin2009A（H1N1）influenzavirusescirculatinginhumans.Science,2009,325（5937）:197-201.
［7］GathererD.The2009H1N1influenzaoutbreakinitshistorical
context.JClinVirol,2009,45（3）:174-178.
［8］CentersforDiseaseControlandPrevention（CDC）.Evaluationof
rapidinfluenzadiagnostictestsfordetectionofnovelinfluenzaA（H1N1）virus-UnitedStates,2009.MMWRMorbMortalWklyRep,2009,58（30）:826-829.
（收稿日期：2009-09-18）
3.讨论
此次流行的甲型H1N1流感病毒为2009年新
出现的病毒株，与以往季节性流感H1N1亚型病毒株存在较大的差异。为满足疾病控制及临床诊断的需要，很多研究单位及企业相继开发出多种核酸检测试剂盒。为了评估这些试剂盒的质量，科技部委托中国药品生物制品检定所牵头对33种核酸检测试剂进行了统一评估，筛选出了特异性及灵敏度较好的7种实时荧光PCR检测试剂。本研究是在此基础上进行的。
甲型H1N1流感病毒自从发现后，很多病毒株均已测序，结果表明，截至目前为止，此株病毒基因序列较为稳定，核酸序列总体上没有发生明显的变异。