实验三 蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝法）
实验时间：2012年9月17日 星期一
一 实验目的
植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。
掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理和方法。进一步掌握紫外和可见光分光光度计的原理和使用方法。
二 实验原理
考马斯亮蓝G-250（Coomassit brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在一定蛋白质浓度范围内（5～100μg/ml），蛋白质－色素复合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。
该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量(范围为5～100μg蛋白质）,，所以是一种比较好的蛋白质定量法。
三、材料、试剂与仪器设备：
植物材料：各种植物叶片及其他器官或离体细胞培养物
实验器具：分光光度计；离心机；研钵； 离心管；移液管，试管等；
试 剂 1．考马斯亮蓝试剂： 2．蛋白质标准溶液：3．90%乙醇；4.磷酸（85%，W/V）。
四 实验步骤
样品含量测定：
（1）称取鲜样0.5g，剪碎放入研钵中加少量pH7.0缓冲液3ml研磨提取,再分别加2ml,1ml清洗研钵和研棒两次,倒入离心管中，7000rpm/min离心15分钟,把上清液倒入一刻度试管中,记录体积。
（2）用移液管（或移液器）取上清液0.1ml(若样品中的蛋白质含量低可取0.5ml加5ml考马斯亮蓝，按照0～100μg/mL的标准曲线求算蛋白质含量)，加入到10ml刻度试管中，再加入5ml考马斯亮蓝试剂，充分摇匀，5分钟后，在分光光度计595nm 处比色。
五、结果计算
样品蛋白质含量（µg /g鲜重）= (C×V/a )/W 式中： C－查标准曲线所得每管蛋白质含量（µg /mL）；V－提取液总体积（mL）；a－测定所取提取液体积（mL）；W－取样量（g）。
六、注意事项
1.在配制考马斯亮蓝时很容易看到絮状物出现，应用滤纸加以过滤，以免影响测定结果
2.不同的植物可溶性蛋白含量相差很大，测定时注意进行预试验，以确定所用的试液浓度在标准曲线范围之内。
实验三 蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝法）
实验时间：2012年9月17日 星期一
一 实验目的
植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。
掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理和方法。进一步掌握紫外和可见光分光光度计的原理和使用方法。
二 实验原理
考马斯亮蓝G-250（Coomassit brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在一定蛋白质浓度范围内（5～100μg/ml），蛋白质－色素复合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。
该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量(范围为5～100μg蛋白质）,，所以是一种比较好的蛋白质定量法。
三、材料、试剂与仪器设备：
植物材料：各种植物叶片及其他器官或离体细胞培养物
实验器具：分光光度计；离心机；研钵； 离心管；移液管，试管等；
试 剂 1．考马斯亮蓝试剂： 2．蛋白质标准溶液：3．90%乙醇；4.磷酸（85%，W/V）。
四 实验步骤
样品含量测定：
（1）称取鲜样0.5g，剪碎放入研钵中加少量pH7.0缓冲液3ml研磨提取,再分别加2ml,1ml清洗研钵和研棒两次,倒入离心管中，7000rpm/min离心15分钟,把上清液倒入一刻度试管中,记录体积。
（2）用移液管（或移液器）取上清液0.1ml(若样品中的蛋白质含量低可取0.5ml加5ml考马斯亮蓝，按照0～100μg/mL的标准曲线求算蛋白质含量)，加入到10ml刻度试管中，再加入5ml考马斯亮蓝试剂，充分摇匀，5分钟后，在分光光度计595nm 处比色。
五、结果计算
样品蛋白质含量（µg /g鲜重）= (C×V/a )/W 式中： C－查标准曲线所得每管蛋白质含量（µg /mL）；V－提取液总体积（mL）；a－测定所取提取液体积（mL）；W－取样量（g）。
六、注意事项
1.在配制考马斯亮蓝时很容易看到絮状物出现，应用滤纸加以过滤，以免影响测定结果
2.不同的植物可溶性蛋白含量相差很大，测定时注意进行预试验，以确定所用的试液浓度在标准曲线范围之内。