课题一 果酒和果醋的制作
1、发酵：通过微生物技术的培养来生产大量代谢产物的过程。 2、有氧发酵：醋酸发酵 谷氨酸发酵 ·无氧发酵：酒精发酵 乳酸发酵
3、酵母菌是兼性厌氧菌型微生物真菌 ·酵母菌的生殖方式：出芽生殖(主要) 分裂生殖 孢子生殖
4、在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖。 C6H 12O 6＋6O 2→6CO 2＋6H 2O +能量 5、在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。 C 6H 12O 6→2C 2H 5OH ＋6CO 2+能量 6、20℃左右最适宜酵母菌繁殖 酒精发酵时一般将温度控制在18℃-25℃
7、在葡萄酒自然发酵的过程中, 起主要作用的是附着在葡萄皮表面的野生型酵母菌. 在发酵过程中, 随着酒精浓度的提高, 红葡萄皮的色素也进入发酵液, 使葡萄酒呈现深红色. 在缺氧 呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到制约。
8、醋酸菌是单细胞细菌(原核生物), 代谢类型是异养需氧型。
9、当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。 C2H 5OH ＋O 2→CH 3COOH ＋H 2O 10、控制发酵条件的作用①醋酸菌对氧气的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使只是短时间中断通入氧气，也会引起醋酸菌死亡。②醋酸菌最适生长温度为30～35℃，控制好发酵温度，使发酵时间缩短，又减少杂菌污染的机会。③有两条途径生成醋酸：直接氧化和以酒精为底物的氧化。
11、实验流程：挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵→果酒（→醋酸发酵→果醋）
12、酒精检验：果汁发酵后是否有酒精产生，可以用重铬酸钾来检验。在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色。先在试管中加入发酵液2ｍL ，再滴入物质的量浓度为3mol/L的H 2SO 43滴，振荡混匀，最后滴加常温下饱和的重铬酸钾溶液3滴，振荡试管，观察颜色
13、充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；排气口是在酒精发酵时用来排出二氧化碳的；出料口是用来取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身相连接，其目的是防止空气中微生物的污染。开口向下的目的是有利于二氧化碳的排出。使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应该充气口连接气泵，输入氧气。
疑难解答
（1）你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗？为什么？
应该先冲洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。
（2）你认为应该从哪些方面防止发酵液被污染？
如：要先冲洗葡萄，再除去枝梗；榨汁机、发酵装置要清洗干净，并进行酒精消毒；每次排气时只需拧松瓶盖，不要完全揭开瓶盖等。
（3）制葡萄酒时，为什么将温度控制在18～25℃？制葡萄醋时，为什么将温度控制在30～35℃？ 温度是酵母菌生长和发酵的重要条件。20℃左右最适合酵母菌的繁殖。因此需要将温度控制在其最适温度范围内。而醋酸菌是嗜温菌，最适生长温度为30～35℃，因此要将温度控制在30～35℃。
（4）制葡萄醋时，为什么要适时通过充气口充气？
醋酸菌是好氧菌，在将酒精变为醋酸时需要氧的参与，因此要适时向发酵液中充气。
课题二 腐乳的制作
1、多种微生物参与了豆腐的发酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。毛霉是一种丝状真菌。代谢类型是异养需氧型。生殖方式是孢子生殖。营腐生生活。 2、原理：毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸。
3、实验流程：让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制 4、酿造腐乳的主要生产工序是将豆腐进行前期发酵和后期发酵。
前期发酵的主要作用：1. 创造条件让毛霉生长。2. 使毛酶形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。 后期发酵主要是酶与微生物协同参与生化反应的过程。通过各种辅料与酶的缓解作用，生成腐乳的香气。
5、将豆腐切成3cm ×3cm ×1cm 的若干块。所用豆腐的含水量为70％左右，水分过多则腐乳不易成形。样品水分含量（%）计算公式如下：
(烘干前容器和样品质量-烘干后容器和样品质量)/烘干前样品质量
毛霉的生长：条件：将豆腐块平放在笼屉内，将笼屉中的控制在15～18℃，并保持一定的温度。 来源：1. 来自空气中的毛霉孢子，2. 直接接种优良毛霉菌种 时间：5天
·加盐腌制：将长满毛霉的豆腐块分层整齐地摆放在瓶中，同时逐层加盐，随着层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些。加盐腌制的时间约为8天左右。
·用盐腌制时，注意控制盐的用量：盐的浓度过低，不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐
腐败变质；盐的浓度过高会影响腐乳的口味
·食盐的作用：1. 抑制微生物的生长，避免腐败变质2. 析出水分，是豆腐变硬，在后期制作过程中不易酥烂3. 调味作用，给腐乳以必要的咸味4. 浸提毛酶菌丝上的蛋白酶。
·配制卤汤：卤汤直接关系到腐乳的色、香、味。卤汤是由酒及各种香辛料配制而成的。卤汤中酒的含量一般控制在12%左右。
·酒的作用：1. 防止杂菌污染以防腐2. 与有机酸结合形成酯，赋予腐乳风味3. 酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系，酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延长；酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块。
·香辛料的作用：1. 调味作用2. 杀菌防腐作用3. 参与并促进发酵过程
·防止杂菌污染：①用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水消毒。②装瓶时，操作要迅速小心。整齐地摆放好豆腐、加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。
疑难解答
（1）利用所学的生物学知识，解释豆腐长白毛是怎么一回事？
豆腐生长的白毛是毛霉的白色菌丝。严格地说是直立菌丝，在豆腐中还有匍匐菌丝。 （2）为什么要撒许多盐，将长毛的豆腐腌起来？ 盐能防止杂菌污染，避免豆腐腐败。
（3）我们平常吃的豆腐，哪种适合用来做腐乳？
含水量为70%左右的豆腐适于作腐乳。用含水量高的豆腐制作腐乳，不易成形。 （4）吃腐乳时，你会发现腐乳外部有一层致密的“皮”。这层“皮”是怎样形成的呢？它对人体有害吗？它的作用是什么？
“皮”是前期发酵时在豆腐表面上生长的菌丝（匍匐菌丝），对人体无害。它能形成腐乳的“体”，使腐乳成形。
课题三 微生物的实验室培养
·培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微生物培养的物质基础。
·培养基按照物理性质可分为液体培养基 半固体培养基和固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂琼脂（是从红藻中提取的一种多糖，在配制培养基中用作凝固剂）后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。液体培养基应用于工业或生活生产，固体培养基应用于微生物的分离和鉴定，半固体
培养基则常用于观察微生物的运动及菌种保藏等。
·按照成分培养基可分为人工合成培养基和天然培养基。合成培养基是用成分已知的化学物质配制而成，其中成分的种类比例明确，常用于微生物的分离鉴定。天然培养基是用化学成分不明的天然物质配制而成，常用于实际工业生产。
·按照培养基的用途，可将培养基分为选择培养基和鉴定培养基。选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。鉴别培养基是根据微生物的特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。
·培养基的化学成分包括 水 、 无机盐 、 碳源 、 氮源 、生长因子等。
·碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO 2、NaHCO 3等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。
·氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N -+
2、NH 3、NO 3、NH 4（无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用N 2。
·培养基还要满足微生物生长对PH 、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的pH 调至酸性，培养细菌是需要将pH 调至中性或微碱性，培养厌氧型微生物是则需要提供无氧的条件
·无菌技术·获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面：
①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。 ②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。 ③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。
④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？ 答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。 ·消毒与灭菌的区别
消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、紫外线消毒。
灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。
灭菌方法：
①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；
②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱 ；
③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅 。
④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯 。
统计菌落数目
（1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。 （2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。
采用此方法的注意事项：1. 一般选取菌落数在30~300之间的平板进行计数2. 为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入TTC3. 本法仅限于形成菌落的微生物 设置对照
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。
制作牛肉膏蛋白胨固体培养基
（1）方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。 （2）倒平板操作的步骤：
①将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。 ②右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰。
③用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10～20mL ）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。
④等待平板冷却凝固，大约需5～10min 。然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上。
·倒平板操作的讨论
1. 培养基灭菌后，需冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
2. 为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 3. 平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 4. 在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
纯化大肠杆菌
（1）微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。
（2）平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。
（3）稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。
（4）用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。 （5）平板划线法操作步骤：
①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。②在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。 ③将试管口通过火焰。④将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。
⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞。⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿。⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第 一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最 后一区的划线与第一区相连。⑧将平板倒置放入培养箱中培养。 ·平板划线操作的讨论
1. 为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
2. 在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ 答：以免接种环温度太高，杀死菌种。
3. 在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 （6）涂布平板操作的步骤：
①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。②取少量菌液，滴加到培养基表面。 ③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10s 。 ④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。 涂布平板操作的讨论
涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？
提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。
菌种的保存
（1）对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。
①临时保藏方法
将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3～6个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。
②缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。
（2）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。
在3mL 的甘油瓶中，装入1mL 甘油后灭菌。将1mL 培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－20℃的冷冻箱中保存。
疑难解答
课题四 探讨加酶洗衣粉的洗剂效果
实验原理
1．加酶洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉，目前常用的酶制剂有四类：蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶，其中，应用最广泛、效果最明显的是碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。
2．碱性蛋白酶能将血渍、奶渍等含有的大分子蛋白质水解成可溶性的氨基酸或小分子的肽，使污迹从衣物上脱落。脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶也能分别将大分子的脂肪、淀粉和纤维素水解为小分子物质，使洗衣粉具有更好的去污能力。
3．在本课题中，我们主要探究有关加酶洗衣粉的三个问题：一是普通洗衣粉和加酶洗衣粉对衣物污渍的洗涤效果有什么不同；二是在什么温度下使用加酶洗衣粉效果最好，三是添加不同种类的酶的的洗衣粉，其洗剂效果有哪些区别。 实验步骤
1探究用加酶洗衣粉与普通洗衣粉洗涤的效果的不同 ①在2个编号的烧杯里，分别注入500mL 清水。
②取2块大小相等的白棉布，用滴管在每块白布上分别滴上等量的墨水，分别放入烧杯里，用玻璃棒搅拌。
③将2个烧杯分别放入同等温度的温水中，保温5分钟。
④称取5克加酶洗衣粉和5克普通洗衣粉2份，分别放入2个烧杯中，用玻璃棒均匀搅拌。保温10分钟。
⑤观察并记录2个烧杯中的洗涤效果 2探究用加酶洗衣粉洗涤的最佳温度条件
①在3个编号的烧杯里，分别注入500mL 清水。
②取3块大小相等的白棉布，用滴管在每块白布上分别滴上一滴食用油、鸡血、牛奶，分别放入烧杯里，用玻璃棒搅拌。
③将3个烧杯分别放入50摄氏度的热水、沸水和冰块中，保温5分钟。
④称取5克加酶洗衣粉3份，分别放入3个烧杯中，用玻璃棒均匀搅拌。保温10分钟。 ⑤观察并记录3个烧杯中的洗涤效果。 3探究不同种类的加酶洗衣粉洗涤的效果
观察并记录四种洗衣粉分别洗涤三种污染的洗涤效果。 注意事项
1．变量的分析和控制
影响加酶洗衣粉洗涤效果的因素有水温、水量、水质、洗衣粉的用量，衣物的质料、大小及浸泡时间和洗涤的时间等。在这些因素中，水温是我们要研究的对象，而其他因素应在实验中保持不变。选择什么样的水温进行实验需要实验者根据当地一年中的实际气温变化来确定水温，通常情况下，冬季、春季、秋季和夏季可分别选取5 ℃、15 ℃、25 ℃和35 ℃的水温，因为这4个水温是比较符合实际情况的，对现实也有指导意义。 2．洗涤方式和材料的选择。
在洗涤方式中有机洗和手洗两种方式，应考虑其中哪一种比较科学？哪一种更有利于控制变量？再有，洗衣机又可以分为半自动和全自动两种，相比之下，采用全自动洗衣机比较好，并且应该尽量使用同一型号小容量的洗衣机，其机械搅拌作用相同。关于洗涤材料的选择也有一些讲究。用衣物作实验材料并不理想，这是因为作为实验材料的衣物，其大小、颜色、洁净程度等应该完全一致，而这并不容易做到；此外，人为地在衣物上增加污物，如血渍、油渍等，也令人难以接受。因此，选用布料作为实验材料比较可行。在作对照实验时，可以控制布料的大小、颜色以及污物的量，使其相同；同时，也便于洗涤效果的比较。 3．水量、水质和洗衣粉用量的问题。
水的用量和布料的大小是成正比的。做实验用的布料不易过大，水量不易过多，但应该让布料充分浸泡在水中。水量和洗衣粉的用量可以参考下表。实验时可根据表中的数据换算出实际用量。如果在实验中使用手洗的方法，如课本中图4-4所示，使用1 000 mL的烧杯作为容器，可以用500 mL的水，洗衣粉的用量可以用1 g或1.5 g。
其他相关问题简述如下。实验中可以用滴管控制污物的量，待污物干燥后再进行实验；布料应放在洗衣粉溶液中浸泡相同的时间；采用玻璃棒或筷子搅拌的方式模拟洗衣过程；模拟搅拌的时间、次数和力量应基本相同。
课题五 酵母细胞的固定化
实验步骤 1。细胞的活化
称取lg 干酵母，放入50 mL的小烧杯中，加人蒸馏水10 mL，用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀，成糊状，放置1h 左右，使其活化。
【注】活化：让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态 2。配制物质的量浓度为0.05mo1/L的CaCl 2溶液
称取无水CaCl 2 0.83g 。放人200mL 的烧杯中，加入150mL 的蒸馏水，使其充分溶解，待用。3。配制海藻酸钠溶液
称取0.7g 海藻酸钠，放入50mL 小烧杯中。加人10mL 水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全溶化，用蒸馏水定容至10 mL。注意，加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止。 4。海藻酸钠溶液与酵母细胞混合
将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加人已活化的醉母细胞，进行充分搅拌，使其混合均匀，再转移至注射器中。
【注】冷却至室温的目的：防止杀死酵母菌 5。固定化酵母细胞
以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl 2溶液中，观察液滴在CaCl 2溶液中形成凝胶珠的情形。将这些凝胶珠在CaCl 2溶液中浸泡30 min左右。
【注】CaCl 2溶液的作用：使胶体聚沉 6 使用固定化酵母细胞发酵
a) 将固定好的酵母细胞(凝胶珠) 用蒸馏水冲洗2-3次。
b) 将150mL 质量分数为10%的葡萄糖溶液转移到200mL 的锥形瓶中，再加入固定好的 酵母细胞，置于25℃下发酵24h 。 注意事项
1. 配制海藻酸钠溶液：小火、间断加热、定容，如果加热太快，海藻酸钠会发生焦糊。 2. 海藻酸钠溶液与酶母细胞混合：冷却后再混合，注意混合均匀，不要进入气泡 3. 制备固定化酵母细胞：高度适宜，并匀速滴入
4．刚形成的凝胶珠应在CaCL 2溶液中浸泡一段时间，以便Ca 2+与Na +充分交换，形成的凝胶珠稳定。检验凝胶珠是否形成，可用下列方法：用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果不容易破裂，没有液体流出就表明成功地制成了凝胶珠，还可以用手将凝胶珠在实验桌上用力摔打，如果凝胶珠很容易弹起，也表明制备的凝胶珠是成功的。 5．凝胶珠的颜色和形状
如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。
课题六 DNA的粗提取
·提取DNA 的溶解性原理包括哪些方面？
DNA 在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同；DNA 不溶于酒精。
·DNA 在不同浓度NaCl 溶液中溶解度有何特点？要使DNA 溶解，需要使用什么浓度？要使DNA 析出，又需要使用什么浓度？
在0.14mol/L时溶解度最小；较高浓度可使DNA 溶解；0.14mol/L可使DNA 析出。
·在溶解细胞中的DNA 时，人们通常选用2mol/LNaCl溶液；将DNA 分子析出的方法是向溶有DNA 的NaCl 溶液中缓慢注入蒸馏水，以稀释NaCl 溶液。酒精是一种常用有机溶剂，但DNA 却不能溶于酒精（特别是95％冷却酒精），但细胞中蛋白质可溶于酒精。
从理论上分析，预冷的乙醇溶液具有以下优点。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA 降解；二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA 分子柔韧性，减少断裂。 ·采用DNA 不溶于酒精的原理，可以达到什么目的？
将DNA 和蛋白质进一步分离。
·提取DNA 还可以利用DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性原理。利用该原理时，应选用怎样的酶和怎样的温度值？
蛋白酶，因为酶具有专一性，蛋白酶只水解蛋白质而不会对DNA 产生影响。温度值为60～80℃，因为该温度值蛋白质变性沉淀，而DN A 不会变性。
补充：DNA 的变性是指DNA 分子在高温下解螺旋，其温度在80℃以上，如在PCR 技术中DNA 变性温度在95℃。
·洗涤剂在提取DNA 中有何作用？
洗涤剂将细胞膜上的蛋白质，从而瓦解细胞膜。
·当鉴定提取出的物质是否是DNA 时，需要使用什么指示剂进行鉴定？
在沸水浴条件下，DNA 遇二苯胺呈现蓝色。
原理总结：通过利用不同浓度NaCl 溶液溶解或析出DNA ，可以从细胞中提取和提纯DNA ；再利用酒精进一步将DNA 与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是DNA 。 实验材料的选取
不同生物的组织中DNA 含量不同。在选取材料时，应本着DNA 含量高、材料易得、便于提取的原则。
本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的DNA 含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备
要求较高，操作繁琐，历时较长。
鸡血细胞破碎以后释放出的DNA ，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA 的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。 破碎细胞，获取含DNA 的滤液
·若选用鸡血和洋葱作实验材料，则怎样获取含DNA 的滤液？
在鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并用玻棒搅拌，过滤后收集滤液；切碎洋葱，加入一定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，过滤后收集滤液。 ·为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？
答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂) ，从而释放出DNA 。 ·在以上实验中，加入蒸馏水、洗涤剂和食盐的作用分别是什么？过滤时应当选用（滤纸、尼龙布）。血细胞在蒸馏水中大量吸水而张裂；洗涤剂瓦解细胞膜；食盐溶解DNA 物质；选用尼龙布进行过滤。
·在处理植物组织时需要进行研磨，其目的是什么？研磨不充分产生什么结果？
破碎细胞壁，使核物质容易溶解在NaCl 溶液中；研磨不充分会使DNA 的提取量减少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。
。具体做法。10mL 鸡血＋20mL 蒸馏水→同方向搅拌→3层尼龙布过滤→滤液
去除滤液中的杂质
为什么反复地溶解与析出DNA ，能够去除杂质？
用高盐浓度的溶液溶解DNA ，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA 析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA ，就能够除去与DNA 溶解度不同的多种杂质。
最初获得的DNA 滤液含有蛋白质、脂质等杂质，需要进一步提纯DNA 。
方案一的原理是DNA 在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA ；方案三的原理是蛋白质和DNA 的变性温度不同。
方案二与方案三的原理有什么不同？
答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA 与蛋白质分开；方案三利用的是DNA 和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA 分离。 析出与鉴定
·在滤液中仍然含有一些杂质，怎样除去这些杂质呢？得到的DNA 呈何颜色？
滤液与等体积的冷却酒精混合均匀，静置2～3分钟，析出的白色丝状物就是DNA 。DNA 呈白色。
·怎样鉴定析出的白色丝状物就是DNA 呢？
具体做法。试管2支，编号甲乙→各加等量5mLNaCl 溶液→甲中放入少量白色丝状物，使之溶解→各加4mL 二苯胺，混合均匀→沸水浴5min →观察颜色变化 实验操作
制备鸡血细胞液„„„„加柠檬酸钠，静置或离心 ↓
破碎细胞，释放DNA „ 加蒸馏水，同一方向快速通方向搅拌 ↓→过滤，除去细胞壁、细胞膜等。
溶解核内DNA „„„„ 加入NaCl 至2mol/L，同一方向缓慢搅拌 ↓
DNA 析出„„„„„„ 加蒸馏水至0.14mol/L，过滤，在溶解到2mol/L溶液中 ↓→除去细胞质中的大部分物质。
DNA 初步纯化„„„„ 与等体积95％冷却酒精混合，析出白色丝状物 ↓→除去核蛋白、RNA 、多糖等。
DNA 鉴定„„„„„„ 二苯胺，沸水浴，呈现蓝色
课题一 果酒和果醋的制作
1、发酵：通过微生物技术的培养来生产大量代谢产物的过程。 2、有氧发酵：醋酸发酵 谷氨酸发酵 ·无氧发酵：酒精发酵 乳酸发酵
3、酵母菌是兼性厌氧菌型微生物真菌 ·酵母菌的生殖方式：出芽生殖(主要) 分裂生殖 孢子生殖
4、在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖。 C6H 12O 6＋6O 2→6CO 2＋6H 2O +能量 5、在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。 C 6H 12O 6→2C 2H 5OH ＋6CO 2+能量 6、20℃左右最适宜酵母菌繁殖 酒精发酵时一般将温度控制在18℃-25℃
7、在葡萄酒自然发酵的过程中, 起主要作用的是附着在葡萄皮表面的野生型酵母菌. 在发酵过程中, 随着酒精浓度的提高, 红葡萄皮的色素也进入发酵液, 使葡萄酒呈现深红色. 在缺氧 呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到制约。
8、醋酸菌是单细胞细菌(原核生物), 代谢类型是异养需氧型。
9、当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。 C2H 5OH ＋O 2→CH 3COOH ＋H 2O 10、控制发酵条件的作用①醋酸菌对氧气的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使只是短时间中断通入氧气，也会引起醋酸菌死亡。②醋酸菌最适生长温度为30～35℃，控制好发酵温度，使发酵时间缩短，又减少杂菌污染的机会。③有两条途径生成醋酸：直接氧化和以酒精为底物的氧化。
11、实验流程：挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵→果酒（→醋酸发酵→果醋）
12、酒精检验：果汁发酵后是否有酒精产生，可以用重铬酸钾来检验。在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色。先在试管中加入发酵液2ｍL ，再滴入物质的量浓度为3mol/L的H 2SO 43滴，振荡混匀，最后滴加常温下饱和的重铬酸钾溶液3滴，振荡试管，观察颜色
13、充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；排气口是在酒精发酵时用来排出二氧化碳的；出料口是用来取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身相连接，其目的是防止空气中微生物的污染。开口向下的目的是有利于二氧化碳的排出。使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应该充气口连接气泵，输入氧气。
疑难解答
（1）你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗？为什么？
应该先冲洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。
（2）你认为应该从哪些方面防止发酵液被污染？
如：要先冲洗葡萄，再除去枝梗；榨汁机、发酵装置要清洗干净，并进行酒精消毒；每次排气时只需拧松瓶盖，不要完全揭开瓶盖等。
（3）制葡萄酒时，为什么将温度控制在18～25℃？制葡萄醋时，为什么将温度控制在30～35℃？ 温度是酵母菌生长和发酵的重要条件。20℃左右最适合酵母菌的繁殖。因此需要将温度控制在其最适温度范围内。而醋酸菌是嗜温菌，最适生长温度为30～35℃，因此要将温度控制在30～35℃。
（4）制葡萄醋时，为什么要适时通过充气口充气？
醋酸菌是好氧菌，在将酒精变为醋酸时需要氧的参与，因此要适时向发酵液中充气。
课题二 腐乳的制作
1、多种微生物参与了豆腐的发酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。毛霉是一种丝状真菌。代谢类型是异养需氧型。生殖方式是孢子生殖。营腐生生活。 2、原理：毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸。
3、实验流程：让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制 4、酿造腐乳的主要生产工序是将豆腐进行前期发酵和后期发酵。
前期发酵的主要作用：1. 创造条件让毛霉生长。2. 使毛酶形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。 后期发酵主要是酶与微生物协同参与生化反应的过程。通过各种辅料与酶的缓解作用，生成腐乳的香气。
5、将豆腐切成3cm ×3cm ×1cm 的若干块。所用豆腐的含水量为70％左右，水分过多则腐乳不易成形。样品水分含量（%）计算公式如下：
(烘干前容器和样品质量-烘干后容器和样品质量)/烘干前样品质量
毛霉的生长：条件：将豆腐块平放在笼屉内，将笼屉中的控制在15～18℃，并保持一定的温度。 来源：1. 来自空气中的毛霉孢子，2. 直接接种优良毛霉菌种 时间：5天
·加盐腌制：将长满毛霉的豆腐块分层整齐地摆放在瓶中，同时逐层加盐，随着层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些。加盐腌制的时间约为8天左右。
·用盐腌制时，注意控制盐的用量：盐的浓度过低，不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐
腐败变质；盐的浓度过高会影响腐乳的口味
·食盐的作用：1. 抑制微生物的生长，避免腐败变质2. 析出水分，是豆腐变硬，在后期制作过程中不易酥烂3. 调味作用，给腐乳以必要的咸味4. 浸提毛酶菌丝上的蛋白酶。
·配制卤汤：卤汤直接关系到腐乳的色、香、味。卤汤是由酒及各种香辛料配制而成的。卤汤中酒的含量一般控制在12%左右。
·酒的作用：1. 防止杂菌污染以防腐2. 与有机酸结合形成酯，赋予腐乳风味3. 酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系，酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延长；酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块。
·香辛料的作用：1. 调味作用2. 杀菌防腐作用3. 参与并促进发酵过程
·防止杂菌污染：①用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水消毒。②装瓶时，操作要迅速小心。整齐地摆放好豆腐、加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。
疑难解答
（1）利用所学的生物学知识，解释豆腐长白毛是怎么一回事？
豆腐生长的白毛是毛霉的白色菌丝。严格地说是直立菌丝，在豆腐中还有匍匐菌丝。 （2）为什么要撒许多盐，将长毛的豆腐腌起来？ 盐能防止杂菌污染，避免豆腐腐败。
（3）我们平常吃的豆腐，哪种适合用来做腐乳？
含水量为70%左右的豆腐适于作腐乳。用含水量高的豆腐制作腐乳，不易成形。 （4）吃腐乳时，你会发现腐乳外部有一层致密的“皮”。这层“皮”是怎样形成的呢？它对人体有害吗？它的作用是什么？
“皮”是前期发酵时在豆腐表面上生长的菌丝（匍匐菌丝），对人体无害。它能形成腐乳的“体”，使腐乳成形。
课题三 微生物的实验室培养
·培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微生物培养的物质基础。
·培养基按照物理性质可分为液体培养基 半固体培养基和固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂琼脂（是从红藻中提取的一种多糖，在配制培养基中用作凝固剂）后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。液体培养基应用于工业或生活生产，固体培养基应用于微生物的分离和鉴定，半固体
培养基则常用于观察微生物的运动及菌种保藏等。
·按照成分培养基可分为人工合成培养基和天然培养基。合成培养基是用成分已知的化学物质配制而成，其中成分的种类比例明确，常用于微生物的分离鉴定。天然培养基是用化学成分不明的天然物质配制而成，常用于实际工业生产。
·按照培养基的用途，可将培养基分为选择培养基和鉴定培养基。选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。鉴别培养基是根据微生物的特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。
·培养基的化学成分包括 水 、 无机盐 、 碳源 、 氮源 、生长因子等。
·碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO 2、NaHCO 3等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。
·氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N -+
2、NH 3、NO 3、NH 4（无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用N 2。
·培养基还要满足微生物生长对PH 、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的pH 调至酸性，培养细菌是需要将pH 调至中性或微碱性，培养厌氧型微生物是则需要提供无氧的条件
·无菌技术·获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面：
①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。 ②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。 ③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。
④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？ 答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。 ·消毒与灭菌的区别
消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、紫外线消毒。
灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。
灭菌方法：
①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；
②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱 ；
③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅 。
④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯 。
统计菌落数目
（1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。 （2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。
采用此方法的注意事项：1. 一般选取菌落数在30~300之间的平板进行计数2. 为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入TTC3. 本法仅限于形成菌落的微生物 设置对照
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。
制作牛肉膏蛋白胨固体培养基
（1）方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。 （2）倒平板操作的步骤：
①将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。 ②右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰。
③用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10～20mL ）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。
④等待平板冷却凝固，大约需5～10min 。然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上。
·倒平板操作的讨论
1. 培养基灭菌后，需冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
2. 为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 3. 平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 4. 在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
纯化大肠杆菌
（1）微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。
（2）平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。
（3）稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。
（4）用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。 （5）平板划线法操作步骤：
①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。②在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。 ③将试管口通过火焰。④将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。
⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞。⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿。⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第 一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最 后一区的划线与第一区相连。⑧将平板倒置放入培养箱中培养。 ·平板划线操作的讨论
1. 为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
2. 在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ 答：以免接种环温度太高，杀死菌种。
3. 在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 （6）涂布平板操作的步骤：
①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。②取少量菌液，滴加到培养基表面。 ③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10s 。 ④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。 涂布平板操作的讨论
涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？
提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。
菌种的保存
（1）对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。
①临时保藏方法
将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3～6个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。
②缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。
（2）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。
在3mL 的甘油瓶中，装入1mL 甘油后灭菌。将1mL 培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－20℃的冷冻箱中保存。
疑难解答
课题四 探讨加酶洗衣粉的洗剂效果
实验原理
1．加酶洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉，目前常用的酶制剂有四类：蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶，其中，应用最广泛、效果最明显的是碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。
2．碱性蛋白酶能将血渍、奶渍等含有的大分子蛋白质水解成可溶性的氨基酸或小分子的肽，使污迹从衣物上脱落。脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶也能分别将大分子的脂肪、淀粉和纤维素水解为小分子物质，使洗衣粉具有更好的去污能力。
3．在本课题中，我们主要探究有关加酶洗衣粉的三个问题：一是普通洗衣粉和加酶洗衣粉对衣物污渍的洗涤效果有什么不同；二是在什么温度下使用加酶洗衣粉效果最好，三是添加不同种类的酶的的洗衣粉，其洗剂效果有哪些区别。 实验步骤
1探究用加酶洗衣粉与普通洗衣粉洗涤的效果的不同 ①在2个编号的烧杯里，分别注入500mL 清水。
②取2块大小相等的白棉布，用滴管在每块白布上分别滴上等量的墨水，分别放入烧杯里，用玻璃棒搅拌。
③将2个烧杯分别放入同等温度的温水中，保温5分钟。
④称取5克加酶洗衣粉和5克普通洗衣粉2份，分别放入2个烧杯中，用玻璃棒均匀搅拌。保温10分钟。
⑤观察并记录2个烧杯中的洗涤效果 2探究用加酶洗衣粉洗涤的最佳温度条件
①在3个编号的烧杯里，分别注入500mL 清水。
②取3块大小相等的白棉布，用滴管在每块白布上分别滴上一滴食用油、鸡血、牛奶，分别放入烧杯里，用玻璃棒搅拌。
③将3个烧杯分别放入50摄氏度的热水、沸水和冰块中，保温5分钟。
④称取5克加酶洗衣粉3份，分别放入3个烧杯中，用玻璃棒均匀搅拌。保温10分钟。 ⑤观察并记录3个烧杯中的洗涤效果。 3探究不同种类的加酶洗衣粉洗涤的效果
观察并记录四种洗衣粉分别洗涤三种污染的洗涤效果。 注意事项
1．变量的分析和控制
影响加酶洗衣粉洗涤效果的因素有水温、水量、水质、洗衣粉的用量，衣物的质料、大小及浸泡时间和洗涤的时间等。在这些因素中，水温是我们要研究的对象，而其他因素应在实验中保持不变。选择什么样的水温进行实验需要实验者根据当地一年中的实际气温变化来确定水温，通常情况下，冬季、春季、秋季和夏季可分别选取5 ℃、15 ℃、25 ℃和35 ℃的水温，因为这4个水温是比较符合实际情况的，对现实也有指导意义。 2．洗涤方式和材料的选择。
在洗涤方式中有机洗和手洗两种方式，应考虑其中哪一种比较科学？哪一种更有利于控制变量？再有，洗衣机又可以分为半自动和全自动两种，相比之下，采用全自动洗衣机比较好，并且应该尽量使用同一型号小容量的洗衣机，其机械搅拌作用相同。关于洗涤材料的选择也有一些讲究。用衣物作实验材料并不理想，这是因为作为实验材料的衣物，其大小、颜色、洁净程度等应该完全一致，而这并不容易做到；此外，人为地在衣物上增加污物，如血渍、油渍等，也令人难以接受。因此，选用布料作为实验材料比较可行。在作对照实验时，可以控制布料的大小、颜色以及污物的量，使其相同；同时，也便于洗涤效果的比较。 3．水量、水质和洗衣粉用量的问题。
水的用量和布料的大小是成正比的。做实验用的布料不易过大，水量不易过多，但应该让布料充分浸泡在水中。水量和洗衣粉的用量可以参考下表。实验时可根据表中的数据换算出实际用量。如果在实验中使用手洗的方法，如课本中图4-4所示，使用1 000 mL的烧杯作为容器，可以用500 mL的水，洗衣粉的用量可以用1 g或1.5 g。
其他相关问题简述如下。实验中可以用滴管控制污物的量，待污物干燥后再进行实验；布料应放在洗衣粉溶液中浸泡相同的时间；采用玻璃棒或筷子搅拌的方式模拟洗衣过程；模拟搅拌的时间、次数和力量应基本相同。
课题五 酵母细胞的固定化
实验步骤 1。细胞的活化
称取lg 干酵母，放入50 mL的小烧杯中，加人蒸馏水10 mL，用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀，成糊状，放置1h 左右，使其活化。
【注】活化：让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态 2。配制物质的量浓度为0.05mo1/L的CaCl 2溶液
称取无水CaCl 2 0.83g 。放人200mL 的烧杯中，加入150mL 的蒸馏水，使其充分溶解，待用。3。配制海藻酸钠溶液
称取0.7g 海藻酸钠，放入50mL 小烧杯中。加人10mL 水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全溶化，用蒸馏水定容至10 mL。注意，加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止。 4。海藻酸钠溶液与酵母细胞混合
将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加人已活化的醉母细胞，进行充分搅拌，使其混合均匀，再转移至注射器中。
【注】冷却至室温的目的：防止杀死酵母菌 5。固定化酵母细胞
以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl 2溶液中，观察液滴在CaCl 2溶液中形成凝胶珠的情形。将这些凝胶珠在CaCl 2溶液中浸泡30 min左右。
【注】CaCl 2溶液的作用：使胶体聚沉 6 使用固定化酵母细胞发酵
a) 将固定好的酵母细胞(凝胶珠) 用蒸馏水冲洗2-3次。
b) 将150mL 质量分数为10%的葡萄糖溶液转移到200mL 的锥形瓶中，再加入固定好的 酵母细胞，置于25℃下发酵24h 。 注意事项
1. 配制海藻酸钠溶液：小火、间断加热、定容，如果加热太快，海藻酸钠会发生焦糊。 2. 海藻酸钠溶液与酶母细胞混合：冷却后再混合，注意混合均匀，不要进入气泡 3. 制备固定化酵母细胞：高度适宜，并匀速滴入
4．刚形成的凝胶珠应在CaCL 2溶液中浸泡一段时间，以便Ca 2+与Na +充分交换，形成的凝胶珠稳定。检验凝胶珠是否形成，可用下列方法：用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果不容易破裂，没有液体流出就表明成功地制成了凝胶珠，还可以用手将凝胶珠在实验桌上用力摔打，如果凝胶珠很容易弹起，也表明制备的凝胶珠是成功的。 5．凝胶珠的颜色和形状
如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。
课题六 DNA的粗提取
·提取DNA 的溶解性原理包括哪些方面？
DNA 在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同；DNA 不溶于酒精。
·DNA 在不同浓度NaCl 溶液中溶解度有何特点？要使DNA 溶解，需要使用什么浓度？要使DNA 析出，又需要使用什么浓度？
在0.14mol/L时溶解度最小；较高浓度可使DNA 溶解；0.14mol/L可使DNA 析出。
·在溶解细胞中的DNA 时，人们通常选用2mol/LNaCl溶液；将DNA 分子析出的方法是向溶有DNA 的NaCl 溶液中缓慢注入蒸馏水，以稀释NaCl 溶液。酒精是一种常用有机溶剂，但DNA 却不能溶于酒精（特别是95％冷却酒精），但细胞中蛋白质可溶于酒精。
从理论上分析，预冷的乙醇溶液具有以下优点。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA 降解；二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA 分子柔韧性，减少断裂。 ·采用DNA 不溶于酒精的原理，可以达到什么目的？
将DNA 和蛋白质进一步分离。
·提取DNA 还可以利用DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性原理。利用该原理时，应选用怎样的酶和怎样的温度值？
蛋白酶，因为酶具有专一性，蛋白酶只水解蛋白质而不会对DNA 产生影响。温度值为60～80℃，因为该温度值蛋白质变性沉淀，而DN A 不会变性。
补充：DNA 的变性是指DNA 分子在高温下解螺旋，其温度在80℃以上，如在PCR 技术中DNA 变性温度在95℃。
·洗涤剂在提取DNA 中有何作用？
洗涤剂将细胞膜上的蛋白质，从而瓦解细胞膜。
·当鉴定提取出的物质是否是DNA 时，需要使用什么指示剂进行鉴定？
在沸水浴条件下，DNA 遇二苯胺呈现蓝色。
原理总结：通过利用不同浓度NaCl 溶液溶解或析出DNA ，可以从细胞中提取和提纯DNA ；再利用酒精进一步将DNA 与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是DNA 。 实验材料的选取
不同生物的组织中DNA 含量不同。在选取材料时，应本着DNA 含量高、材料易得、便于提取的原则。
本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的DNA 含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备
要求较高，操作繁琐，历时较长。
鸡血细胞破碎以后释放出的DNA ，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA 的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。 破碎细胞，获取含DNA 的滤液
·若选用鸡血和洋葱作实验材料，则怎样获取含DNA 的滤液？
在鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并用玻棒搅拌，过滤后收集滤液；切碎洋葱，加入一定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，过滤后收集滤液。 ·为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？
答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂) ，从而释放出DNA 。 ·在以上实验中，加入蒸馏水、洗涤剂和食盐的作用分别是什么？过滤时应当选用（滤纸、尼龙布）。血细胞在蒸馏水中大量吸水而张裂；洗涤剂瓦解细胞膜；食盐溶解DNA 物质；选用尼龙布进行过滤。
·在处理植物组织时需要进行研磨，其目的是什么？研磨不充分产生什么结果？
破碎细胞壁，使核物质容易溶解在NaCl 溶液中；研磨不充分会使DNA 的提取量减少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。
。具体做法。10mL 鸡血＋20mL 蒸馏水→同方向搅拌→3层尼龙布过滤→滤液
去除滤液中的杂质
为什么反复地溶解与析出DNA ，能够去除杂质？
用高盐浓度的溶液溶解DNA ，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA 析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA ，就能够除去与DNA 溶解度不同的多种杂质。
最初获得的DNA 滤液含有蛋白质、脂质等杂质，需要进一步提纯DNA 。
方案一的原理是DNA 在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA ；方案三的原理是蛋白质和DNA 的变性温度不同。
方案二与方案三的原理有什么不同？
答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA 与蛋白质分开；方案三利用的是DNA 和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA 分离。 析出与鉴定
·在滤液中仍然含有一些杂质，怎样除去这些杂质呢？得到的DNA 呈何颜色？
滤液与等体积的冷却酒精混合均匀，静置2～3分钟，析出的白色丝状物就是DNA 。DNA 呈白色。
·怎样鉴定析出的白色丝状物就是DNA 呢？
具体做法。试管2支，编号甲乙→各加等量5mLNaCl 溶液→甲中放入少量白色丝状物，使之溶解→各加4mL 二苯胺，混合均匀→沸水浴5min →观察颜色变化 实验操作
制备鸡血细胞液„„„„加柠檬酸钠，静置或离心 ↓
破碎细胞，释放DNA „ 加蒸馏水，同一方向快速通方向搅拌 ↓→过滤，除去细胞壁、细胞膜等。
溶解核内DNA „„„„ 加入NaCl 至2mol/L，同一方向缓慢搅拌 ↓
DNA 析出„„„„„„ 加蒸馏水至0.14mol/L，过滤，在溶解到2mol/L溶液中 ↓→除去细胞质中的大部分物质。
DNA 初步纯化„„„„ 与等体积95％冷却酒精混合，析出白色丝状物 ↓→除去核蛋白、RNA 、多糖等。
DNA 鉴定„„„„„„ 二苯胺，沸水浴，呈现蓝色