实验四 黑曲霉原生质体的制备及再生
一、实验目的
1、掌握黑曲霉培养的方法；
2、熟悉黑曲霉原生质体的制备方法；
3、懂得原生质体的再生原理。
二、实验原理
获得有活力、去壁较为完全的原生质体对于随后的原生质体融合和原生质体再生是非常 重要的。制备原生质体的脱壁酶只能采用滤菌器去菌，对于细菌和放线菌，主要采用溶菌酶； 对于酵母菌和霉菌，则一般采用蜗牛酶和纤维素酶。影响原生质体制备的因素有许多，主要 有以下几个方面。
⑴ 菌体的预处理 在使用脱壁酶处理菌体以前，先用某些化合物对菌体进行预处理，有利于原生质体制备。例如用EDTA(乙二胺四乙酸) 、甘氨酸、青霉素或D-环丝氨酸等处理细菌，可使菌体的细胞壁对酶的敏感性增加。EDTA 能与多种金属离子形成络合物，避免金属离子对酶的抑制作用而提高酶的脱壁效果。甘氨酸可以代替丙氨酸参与细胞壁肽聚糖的合成，其结果干扰了细胞壁肽聚糖的相互交联，便于原生质体化。
⑵ 菌体的培养时间 为了使菌体细胞易于原生质体化，一般选择对数生长期后期的菌体进行酶处理。这时的细胞正在生长、代谢旺盛，细胞壁对酶解作用最为敏感。采用这个时期的菌体制备原生质体，原生质体形成率高，再生率亦很高。
⑶ 酶浓度 一般地说，酶浓度增加，原生质体的形成率亦增大，超过一定范围，则原生质体形成率提高不明显。酶浓度过低，则不利于原生质体的形成；酶浓度过高，则导致原生质体再生率的降低。为了兼顾原生质体形成率和再生率，有人建议以使原生质体形成率和再生率之乘积达到最大时的酶浓度为最适酶浓度。
⑷ 酶解温度 温度对酶解作用有双重影响，一方面随着温度升高，酶解反应速度加快；另一方面，随着温度升高，酶蛋白变性而使酶失活。一般酶解温度控制在20～40℃。 ⑸ 酶解时间 充足的酶解时间是原生质体化的必要条件。但是如果酶解时间过长，则再生率随酶解的时间延长而显著降低。其原因是当酶解达到一定的时间后，绝大多数的菌体细胞均已形成原生质体，因此，再进行酶解作用，酶便会进一步对原生质体发生作用而使细胞质膜受到损伤，造成原生质体失活。
⑹ 渗透压稳定剂 原生质体对溶液和培养基的渗透压很敏感，必须在高渗透压或等渗透压的溶液或培养基中才能维持其生存，在低渗透压溶液中，原生质体将会破裂而死亡。对于不同的菌种，采用的渗透压稳定剂不同。对于细菌或放线菌，一般采用蔗糖、丁二酸钠等为渗透压稳定剂；对于酵母菌则采用山梨醇、甘露醇等；对于霉菌则采用KCl 和NaCl 等。稳定剂的使用浓度一般为0.3～0.8 mol ／L 。一定浓度的Ca 2+、Mg 2+等二价阳离子可增加原
生质膜的稳定性，所以是高渗透压培养基中不可缺少的成分。
三、实验试剂
马铃薯，葡萄糖，琼脂，NaNO 3，K 2HPO 4，MgSO 4•7H 2O ，KCl ，FeSO 4•7H 2O ，蔗糖， NaCl ，蜗牛酶、纤维素酶，无菌蒸馏水。
四、实验仪器
摇床，离心机，倒置显微镜，普通显微镜，超净工作台，培养皿，离心管，载玻片，刀片，镊子，过滤漏斗，0.45um 滤膜，吸管，灭菌锅，镊子。
五、实验方法步骤
1、斜面活化
PDA 培养基：马铃薯60g ，葡萄糖2 g，琼脂2g （100 mL）
配置方法：取新鲜马铃薯60g ，去皮切成细丝状，加入适量蒸馏水，置于蒸煮锅内煮沸并不断用玻璃棒搅拌至快成糊状，用八层纱布过滤取滤液，依次加入用天平称取的葡萄糖2 g 、琼脂2g ，搅匀，最后用蒸馏水定容至100 mL ，加热溶解。分装于试管中，约至试管的三分之一，然后加塞包扎灭菌，灭菌温度为121℃，压强为0.1 Mpa，灭菌20 min。灭菌结束后摆斜面冷却待用。
在无菌操作台中，将实验室保藏的黑曲霉菌种接入已灭菌的斜面培养基中。置于30℃恒温培养箱中培养三天。
2、孢子悬浮液的制备
将已活化的黑曲霉孢子从试管中刮到装有生理盐水的三角瓶中，置于30℃摇床上，150 r•min -1，10 min。取出用4层擦镜纸过滤，将滤液用3000 r•min -1离心，弃上清液，用生理盐水洗涤1-2次，然后对悬浮液进行镜检和计数，调整孢子浓度约为5×108个/mL。
3、菌丝体的培养
（1）制备PDA 平板培养基，于大烧杯中按照培养基配方配置300mL ，平均分装于三个容量为250mL 的锥形瓶中，加塞包扎，与包扎好的平皿、涂布棒、枪头、试管、玻璃纸、蒸馏水、镊子、离心管、小烧杯等所实验需仪器一起灭菌。在无菌操作台上，将锥形瓶中的培养基分倒入平板中，每100mL 约能倒六个平板，冷却待用。
（2）在无菌操作条件下，取8个平板培养基，用镊子将玻璃纸平铺到培养基上，用移液枪将已制备好的孢子悬液滴到培养基上，每皿0.1 mL ，用涂布棒涂布均匀。置于28℃培养箱中培养24小时，可见薄层菌丝，供制备原生质体用。
（3）取原菌悬液0.1 mL用无菌水稀释到10、10，分别将这两个梯度的菌悬液滴到未加玻璃纸的PDA 培养基平板上，每皿0.1 mL，涂布均匀，每个梯度做三个平行。置于30℃培养箱中培养至可见白色单菌落，计数，算出原菌数A 。
4、酶解、原生质体的形成
（1）采用高渗溶液即0.8mol/LNaCl溶液配制0.5％蜗牛酶和1％纤维素酶的混合酶液20 -6-7
mL ，用无菌微孔滤膜过滤除菌，取10mL 置于已灭菌的空培养皿中。挑选一皿长得最好的菌丝体（菌丝体白嫩，菌丝完全伸展铺张在玻璃纸上），用无菌镊子将玻璃纸揭下置于酶液中，然后将平皿置于30℃培养箱中酶解2h 。酶解过程中间歇摇动使酶解充分。
高渗溶液配制方法：称取4.68 g NaCl，在超净工作台上，用无菌水定容至100mL 。 混合酶液配置方法:称取1 g蜗牛酶、2 g纤维素酶，在超净工作台上，用已制备好的 高渗溶液定容至20mL 。
（2）将酶解好的的酶液离心（1000 r•min ，10min ），弃去上清。沉淀用高渗溶液洗涤两次，再用10mL 高渗溶液悬浮，吹打均匀，离心（500 r•min -1，5-10min ），取上清则得到原生质体悬液。
（3）吸取0.1mL 已制备好的原生质体悬液于已灭菌的离心管中，再加入0.9mL 的无菌水，盖上摇匀，此管编号为10-1，依次类推稀释到10-4、10-5，吸取0.1mL 滴加到PDA 培养基平板上，涂布均匀，每个梯度做三个平行。培养计数为未形成原生质体的原菌数B 。并按下式计算原生质体的形成率。
原生质体的形成率= (A - B) /A ×100%
5、原生质体再生
将上述纯化的原生质体悬浮液1mL ，用高渗溶液稀释至10-4，10-5，10-6，10-7 个/mL，每个梯度取0.1 mL滴于再生培养基上，用涂布玻璃轻推使之均匀，然后将培养皿置于28℃的培养箱中培养2-3天后观察菌落数。
再生培养基（RM ）：琼脂20 g，NaNO 3 3 g，K 2HPO 4 1 g，MgSO 4•7H 2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO 4•7H 2O 0.01 g，蔗糖30 g，高渗溶液定容至1000mL ，pH 自然。 -1
六、实验记录
1、原生质体的形成率，再生率
A /个
B /个 C/ 个 原生质体形成率/% 原生质体再生率/%
A ——酶处理前的菌悬液经无菌水系列稀释，于完全培养基平板上培养出的菌落数
B ——酶处理后得到的原生质体用无菌水适当稀释，在完全培养基平板上培养出的菌落数 C ——酶处理后得到的原生质体用高渗液适当稀释，在再生培养基平板上培养出的菌落数
2、按镜下观察绘制黑曲霉的原生质体
七、实验报告
1、简述黑曲霉原生质体制备的方法步骤；
实验四 黑曲霉原生质体的制备及再生
一、实验目的
1、掌握黑曲霉培养的方法；
2、熟悉黑曲霉原生质体的制备方法；
3、懂得原生质体的再生原理。
二、实验原理
获得有活力、去壁较为完全的原生质体对于随后的原生质体融合和原生质体再生是非常 重要的。制备原生质体的脱壁酶只能采用滤菌器去菌，对于细菌和放线菌，主要采用溶菌酶； 对于酵母菌和霉菌，则一般采用蜗牛酶和纤维素酶。影响原生质体制备的因素有许多，主要 有以下几个方面。
⑴ 菌体的预处理 在使用脱壁酶处理菌体以前，先用某些化合物对菌体进行预处理，有利于原生质体制备。例如用EDTA(乙二胺四乙酸) 、甘氨酸、青霉素或D-环丝氨酸等处理细菌，可使菌体的细胞壁对酶的敏感性增加。EDTA 能与多种金属离子形成络合物，避免金属离子对酶的抑制作用而提高酶的脱壁效果。甘氨酸可以代替丙氨酸参与细胞壁肽聚糖的合成，其结果干扰了细胞壁肽聚糖的相互交联，便于原生质体化。
⑵ 菌体的培养时间 为了使菌体细胞易于原生质体化，一般选择对数生长期后期的菌体进行酶处理。这时的细胞正在生长、代谢旺盛，细胞壁对酶解作用最为敏感。采用这个时期的菌体制备原生质体，原生质体形成率高，再生率亦很高。
⑶ 酶浓度 一般地说，酶浓度增加，原生质体的形成率亦增大，超过一定范围，则原生质体形成率提高不明显。酶浓度过低，则不利于原生质体的形成；酶浓度过高，则导致原生质体再生率的降低。为了兼顾原生质体形成率和再生率，有人建议以使原生质体形成率和再生率之乘积达到最大时的酶浓度为最适酶浓度。
⑷ 酶解温度 温度对酶解作用有双重影响，一方面随着温度升高，酶解反应速度加快；另一方面，随着温度升高，酶蛋白变性而使酶失活。一般酶解温度控制在20～40℃。 ⑸ 酶解时间 充足的酶解时间是原生质体化的必要条件。但是如果酶解时间过长，则再生率随酶解的时间延长而显著降低。其原因是当酶解达到一定的时间后，绝大多数的菌体细胞均已形成原生质体，因此，再进行酶解作用，酶便会进一步对原生质体发生作用而使细胞质膜受到损伤，造成原生质体失活。
⑹ 渗透压稳定剂 原生质体对溶液和培养基的渗透压很敏感，必须在高渗透压或等渗透压的溶液或培养基中才能维持其生存，在低渗透压溶液中，原生质体将会破裂而死亡。对于不同的菌种，采用的渗透压稳定剂不同。对于细菌或放线菌，一般采用蔗糖、丁二酸钠等为渗透压稳定剂；对于酵母菌则采用山梨醇、甘露醇等；对于霉菌则采用KCl 和NaCl 等。稳定剂的使用浓度一般为0.3～0.8 mol ／L 。一定浓度的Ca 2+、Mg 2+等二价阳离子可增加原
生质膜的稳定性，所以是高渗透压培养基中不可缺少的成分。
三、实验试剂
马铃薯，葡萄糖，琼脂，NaNO 3，K 2HPO 4，MgSO 4•7H 2O ，KCl ，FeSO 4•7H 2O ，蔗糖， NaCl ，蜗牛酶、纤维素酶，无菌蒸馏水。
四、实验仪器
摇床，离心机，倒置显微镜，普通显微镜，超净工作台，培养皿，离心管，载玻片，刀片，镊子，过滤漏斗，0.45um 滤膜，吸管，灭菌锅，镊子。
五、实验方法步骤
1、斜面活化
PDA 培养基：马铃薯60g ，葡萄糖2 g，琼脂2g （100 mL）
配置方法：取新鲜马铃薯60g ，去皮切成细丝状，加入适量蒸馏水，置于蒸煮锅内煮沸并不断用玻璃棒搅拌至快成糊状，用八层纱布过滤取滤液，依次加入用天平称取的葡萄糖2 g 、琼脂2g ，搅匀，最后用蒸馏水定容至100 mL ，加热溶解。分装于试管中，约至试管的三分之一，然后加塞包扎灭菌，灭菌温度为121℃，压强为0.1 Mpa，灭菌20 min。灭菌结束后摆斜面冷却待用。
在无菌操作台中，将实验室保藏的黑曲霉菌种接入已灭菌的斜面培养基中。置于30℃恒温培养箱中培养三天。
2、孢子悬浮液的制备
将已活化的黑曲霉孢子从试管中刮到装有生理盐水的三角瓶中，置于30℃摇床上，150 r•min -1，10 min。取出用4层擦镜纸过滤，将滤液用3000 r•min -1离心，弃上清液，用生理盐水洗涤1-2次，然后对悬浮液进行镜检和计数，调整孢子浓度约为5×108个/mL。
3、菌丝体的培养
（1）制备PDA 平板培养基，于大烧杯中按照培养基配方配置300mL ，平均分装于三个容量为250mL 的锥形瓶中，加塞包扎，与包扎好的平皿、涂布棒、枪头、试管、玻璃纸、蒸馏水、镊子、离心管、小烧杯等所实验需仪器一起灭菌。在无菌操作台上，将锥形瓶中的培养基分倒入平板中，每100mL 约能倒六个平板，冷却待用。
（2）在无菌操作条件下，取8个平板培养基，用镊子将玻璃纸平铺到培养基上，用移液枪将已制备好的孢子悬液滴到培养基上，每皿0.1 mL ，用涂布棒涂布均匀。置于28℃培养箱中培养24小时，可见薄层菌丝，供制备原生质体用。
（3）取原菌悬液0.1 mL用无菌水稀释到10、10，分别将这两个梯度的菌悬液滴到未加玻璃纸的PDA 培养基平板上，每皿0.1 mL，涂布均匀，每个梯度做三个平行。置于30℃培养箱中培养至可见白色单菌落，计数，算出原菌数A 。
4、酶解、原生质体的形成
（1）采用高渗溶液即0.8mol/LNaCl溶液配制0.5％蜗牛酶和1％纤维素酶的混合酶液20 -6-7
mL ，用无菌微孔滤膜过滤除菌，取10mL 置于已灭菌的空培养皿中。挑选一皿长得最好的菌丝体（菌丝体白嫩，菌丝完全伸展铺张在玻璃纸上），用无菌镊子将玻璃纸揭下置于酶液中，然后将平皿置于30℃培养箱中酶解2h 。酶解过程中间歇摇动使酶解充分。
高渗溶液配制方法：称取4.68 g NaCl，在超净工作台上，用无菌水定容至100mL 。 混合酶液配置方法:称取1 g蜗牛酶、2 g纤维素酶，在超净工作台上，用已制备好的 高渗溶液定容至20mL 。
（2）将酶解好的的酶液离心（1000 r•min ，10min ），弃去上清。沉淀用高渗溶液洗涤两次，再用10mL 高渗溶液悬浮，吹打均匀，离心（500 r•min -1，5-10min ），取上清则得到原生质体悬液。
（3）吸取0.1mL 已制备好的原生质体悬液于已灭菌的离心管中，再加入0.9mL 的无菌水，盖上摇匀，此管编号为10-1，依次类推稀释到10-4、10-5，吸取0.1mL 滴加到PDA 培养基平板上，涂布均匀，每个梯度做三个平行。培养计数为未形成原生质体的原菌数B 。并按下式计算原生质体的形成率。
原生质体的形成率= (A - B) /A ×100%
5、原生质体再生
将上述纯化的原生质体悬浮液1mL ，用高渗溶液稀释至10-4，10-5，10-6，10-7 个/mL，每个梯度取0.1 mL滴于再生培养基上，用涂布玻璃轻推使之均匀，然后将培养皿置于28℃的培养箱中培养2-3天后观察菌落数。
再生培养基（RM ）：琼脂20 g，NaNO 3 3 g，K 2HPO 4 1 g，MgSO 4•7H 2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO 4•7H 2O 0.01 g，蔗糖30 g，高渗溶液定容至1000mL ，pH 自然。 -1
六、实验记录
1、原生质体的形成率，再生率
A /个
B /个 C/ 个 原生质体形成率/% 原生质体再生率/%
A ——酶处理前的菌悬液经无菌水系列稀释，于完全培养基平板上培养出的菌落数
B ——酶处理后得到的原生质体用无菌水适当稀释，在完全培养基平板上培养出的菌落数 C ——酶处理后得到的原生质体用高渗液适当稀释，在再生培养基平板上培养出的菌落数
2、按镜下观察绘制黑曲霉的原生质体
七、实验报告
1、简述黑曲霉原生质体制备的方法步骤；