基因组学与应用生物学，2009年，第28卷，第5期，第1020－1025页Genomics and Applied Biology, 2009, Vol.28, No.5, 1020－1025
专题介绍Review
酶的分子定向进化及其应用
平丽英柳志强
薛亚平
郑裕国*
浙江工业大学生物工程研究所, 杭州, 310014*通讯作者, [email protected]
酶的分子定向进化是20世纪90年代初兴起的一种蛋白质工程的新策略，是一种在生物体外模拟自
然进化过程的、具有一定目的性的快速改造蛋白质的方法。该方法引起了生物催化技术领域的又一次革命。目
摘
要
农业及制药业等的相关领域。本文详细综述了酶的分子定向进化的前分子定向进化技术已被广泛应用于工业、概念、过程、基本策略及其核心技术，并着重介绍了酶的分子定向进化技术在提高酶的活力、稳定性、底物特异性和对映体选择性等几方面的应用及取得的相关成果。
关键词生物催化剂, 酶的分子定向进化, 蛋白质工程, 应用
Directed Molecular Evolution of Enzyme and its Application
Ping Liying Liu Zhiqiang Xue Yaping Zheng Yuguo *
Institute of Bioengineering, Zhejiang University Technology, Hangzhou, 310014*Corresponding author, [email protected]:10.3969/gab.028.001020
Abstract Directed molecular evolution of enzyme, originated in the beginning of the nineties of the last century, was a new strategy of protein engineering, which could rapidly modify proteins for specific purpose through imitat-ing externally natural evolutions, as well as it has arisen a revolution in biocatalyst field. Nowadays, this technology has been widely applied in various fields including chemical engineering, agriculture and pharmaceutical industry. This paper elaborates on the concept of directed molecular evolution, procedure, basic strategies, and its core tech-nology, then presents emphatically its application and achievements in improving enzyme activities, stability, sub-strate specificity, and antipode selectivity and so on.
Keywords Biocatalyst, Directed molecular evolution of enzyme, Protein technology, Application 人类对自然资源的过渡开发和利用，由此所引发的环境问题日益严重，这使得传统的化学工业不断地发生改变以适应新时期的发展需求。生物催化是一种新型的转化技术，在化学合成中的应用日趋重要，尤其适于化工及制药工业中手性化合物的合成，因此，生物催化技术为传统化学工业的可持续发展注入了新的活力(Jameset al., 2006; Straathof et al., 2002; Thayer, 2006) 。在生物催化和生物转化中，生物催化剂的立体选择性强、反应条件温和、操作简便、成本较低、副产物少、对环境友好，且能完成一些化
由于绝大学合成难以进行的反应。特别在制药行业，
部分的药物都是手性物质，药品光学纯度要求高，因
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基金项目：本研究由国家863计划项目(2009AA02Z203)资助
此，具有选择性的生物催化和生物转化过程则成为优
先选择的方法(何冰芳和欧阳平凯, 2006; 欧阳立明和
目前，生物催化许建和, 2008; 陈依君和吴旭日, 2007) 。
和生物转化已涉及羟基化、环氧化、脱氢、氢化、水解、水合、酯化、酯转移、酰化、脱羧、脱水和异构化等各类化学反应(欧阳立明和许建和, 2008; 陈依君和吴旭日, 2007; Bi et al., 2009; Kansal and Banerjee, 2009) 。然而，获得转化反应所需的菌株或酶是限制生物催化和生物转化技术发展的瓶颈，一旦获得了适当的生物催化剂，生物转化将不成问题。
酶作为主要的生物催化剂在化学合成中发挥着重要作用，但自然进化的酶不能在所有非天然环境
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的生物催化和转化反应中发挥成效。现有的生物催
新的活力，它是从基因工程诞生以来，生物技术领域
化剂对大部分非天然底物是不具有活力和选择性取得的最重要的研究成果之一。利用分子定向进化的，因此酶在工业化应用中仍然存在诸多问题。限制技术对生物催化剂进行改造，可以有效地提高生物酶工业应用的因素主要包括：酶的稳定性较低，对非催化剂的性能，使其满足生物催化和转化过程的需天然底物的催化缓慢，对温度、酸碱度的耐受能力低，要。目前分子定向进化技术在提高生物催化剂的活在非水相中的活力和稳定性低，催化反应要求价格昂力、稳定性、对映体选择性等领域开展了深入的研
并取得了一些瞩目的成果。贵的辅助因子等(徐威等, 2004) 。为了使酶更适于生究，采取了不同物催化和转化应用，研究者从不同角度、
的方法改造酶，虽然取得了一定进展，但仍不能从根本上解决酶在实际应用中存在的问题，因此，酶的分子定向进化方法应运而生(姜涌明等, 2000) 。
2酶的分子定向进化的应用
2.1提高稳定性
酶的稳定性对以酶为催化剂的有机合成尤为重要，即使催化反应发生在水相也是如此。而在有机合成过程中，作为生物催化剂的酶所处的真实条件同其进化的自然环境通常差异显著，特别是在高温、极端pH 和非水相体系中进行的催化反应更加要求提高酶的稳定性和活力(何冰芳和欧阳平凯, 2006; 孙志浩, 2005) 。2.1.1热稳定性
在工业生产和科学研究中提高某一特定反应的温度是必要的，因为提高温度可以提高底物的可溶性，进而提高反应速率并可有效降低介质的黏度等，然而较高的反应温度对酶的热稳定性是一个严峻的考验。许多研究者通过分子定向进化的方法，在提高酶的热稳定性方面做了大量的研究，并取得了一些可喜的成果。
易错PCR 是提高生物催化剂热稳定性的有效方法之一，北京市生物加工过程重点实验室通过易错PCR 和DNA 改组的方法使无根根霉菌产生突变，以此来提高其脂肪酶的热稳定性，实验获得了一个含有3个氨基酸置换的突变株，这一突变株的最适温度比野生型菌株提高了10℃，另外该突变株在50℃时的半衰期比野生型提高了12倍(Niuet al., 2006) 。
通过易错PCR 提高催化剂热稳定性的另一个典
Kim 和Lei (2008)利用该方法来提高植酸型的例子：
以此来降低该酶的热失活，实酶AppA2的热稳定性，
而其Tm 值验最终获得突变株的耐热性提高了20%，
也提高了6~7℃。2.1.2pH 稳定性
不同的酶有其不同的最适pH 范围，当反应体系的pH 值达到其最适条件时，酶将发挥其最佳的催化效率，但当反应体系的pH 不适宜时，酶的催化效率就会有所降低，在极端的pH 条件下，甚至会失去活性。
Tao 和Qin (2009)通过DNA 改组的方法来提高
1酶的分子定向进化的概念
酶的分子定向进化(directedevolution) 又称蛋白质分子定向进化，是蛋白质工程的新策略，主要利用分子生物学手段，在分子水平上创造分子的多样性，在事先不了解酶的空间结构和催化机制的情况下，通过模拟自然进化，在体外改造酶的基因，以改进的诱变技术结合灵敏的筛选方法，定向选择有价值的非天然酶(孙志浩, 2005; Williams et al., 2004; 孙志浩和柳志强, 2005) 。该方法是一种在生物体体外模拟达尔文进化的、具有一定目的性和快速改造蛋白质的方法，相对于传统的蛋白质的“理性设计(rationaldesign) ”方法，酶的分子定向进化被称为蛋白质的“非理性设计(irra-方法(张红缨等, 1999, 科学通报, 44(11):tional design) ”
1121-1127; Williams et al., 2004; 孙志浩, 2005) 。
酶的分子定向进化为生物催化剂的改造提供了又一有力的技术支持，它能改进生物催化剂或在短时间内发掘出生物催化剂的新特性，加速人类改造酶原有功能和开发酶新功能的步伐，为提高生物催化剂的工业化操作性能提供了新的思路和方法，并为天然来酶的分子定源的生物催化剂的广泛应用奠定了基础。
向进化研究的主要方向是提高热稳定性，提高有机溶剂中酶的活性和稳定性，扩大底物的选择性，改变光学异构体的选择性，其核心技术为突变库构建技术及高通量筛选方法(王黎等, 2009) 。酶的分子定向进化的基本策略：随机突变以构建突变基因文库，通过重组方法如DNA 改组、交换和组建突变基因片段筛选出最佳的生物催化剂(张红缨等, 1999, 科学通报, 44(11):1121-1127; Kolkman and Stemmer, 2001) 。随着酶的分子定向进化技术的不断应用，其必将扩大整个催化剂家族的生物多样性。
酶的分子定向进化为蛋白质工程的发展注入了
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链霉菌木聚糖酶B 的热和碱性pH 稳定性。他们在碱性缓冲液中筛选得到具有热稳定性的阳性克隆
最终获得的最佳突子，经过3轮的DNA 改组实验，
变株3S1×B6表现出显著的热稳定性，在70℃可稳定存在360min ，而野生型仅3min 就会损失50%的活性。另外，3S1×B6在pH 9.0的碱性缓冲液中的稳定性也有所提高。
日本研究者利用易错PCR 结合有效地筛选方法，对木霉属β－1,4－葡聚糖内切酶Ⅲ进行改造，并研究了酶活的提高与稳定性提高之间的关系。实验
株的半衰期提高了4倍，而其在有机溶剂中的稳定性与野生菌相比也有明显提高(Songand Rhee, 2001) 。
以细胞色素P450的四重突变体QM 为出发菌株，利用改进的随机诱变技术结合高通量的筛选方法，以此来提高QM 的温度稳定性及其在有机相中的稳定性。在筛选了3000个克隆子后获得了突变体QM/L295H和QM/K2361/D257N。QM/L295H在35~55℃温度范围内比QM 表现出较高的活力，在45℃保存6h 后，QM/L295H的活力是QM 的1.4倍而在2.5%~15%的DMSO 溶液中，QM/L295H和
获的最佳突变株2R4的酶活力是野生型的130倍。QM/K2361/D257N均比出发菌株QM 表现出更高的
而且它还具有广泛的pH 稳定性，在pH 4.4~8.8之间
稳定性和酶活力(Kumaret al., 2006) 。
均能稳定存在，而野生型的稳定pH 范围是4.4~5.2。定向进化提高了突变株耐碱能力，在pH 稳定性提高2.2提高酶活力的同时，该菌株的耐热性也有所提高，在55℃可稳定突变株2R4对羟甲基纤维素的催化速率存在30min 。
常数K cat 是野生型的1.4倍，而其米氏常数K m 值是野生型的2倍(Nakazawaet al., 2009) 。
Mchunu 等(2009)采用易错PCR 来提高真菌木聚糖酶的碱耐受性，最佳突变株NC38在pH 10、温度60℃的极端条件下存在90min 后，仍能保持84%的活性，而野生型菌株在60min 时只能保持22%的活性。2.1.3非水相的稳定性
在过去的20年中，有机化学合成中酶的开发与应用越来越引起人们的重视，酶在非水相中的催化反应在各领域得到了广泛应用，已成为酶学研究的主要内容之一。酶的分子定向进化技术对有机合成用酶性能的改造，不仅提高了非水相反应体系中酶的稳定性，也发展和完善了酶的分子定向进化的技术水平，并进一步拓展了其应用范围(Guptaand Roy, 2004) 。
Chen 和Arnold (1991;1993)通过易错PCR 对枯草
以此来提高该酶在有机芽孢杆菌蛋白酶E 进行改造，
溶剂中水解短肽suc-Ala-Ala-Pro-Pro-p －硝基苯胺的能力。实验获得的最优突变体(PC3)在含有60%DMF 中水解短肽suc-Ala-Ala-Pro-Pro-p －硝基苯胺的能力是野生型的256倍，而在80%DMF 中为野生型的131倍。在含有70%的DMF 溶液中，比较了野生型和突变型菌株催化L －甲硫氨酸甲基酯合成聚L －甲硫氨酸的能力，实验发现：野生型酶不能合成聚L －甲硫氨酸，而PC3可以催化合成大量产物。
磷脂酶A1在有机溶剂中的稳定性和活力较低，在易错PCR 、DNA 改组与筛选方法相结合来提高其稳定性实验中，二次突变库用50%的DMSO 处理36h 后，获得了3个突变株(SA8,SA17, SA20) 。这3个突变
酶活的高低反映一个生物催化与转化过程反应
速率的快慢，酶活越高，反应速率越快，反之则反应
实现较高的酶活是各生产企业一直速率越慢。因此，
追求的目标。
Arnold 小组对酶活提高与稳定性提高之间的关系进行了研究，结果表明酶活提高与稳定性提高并不是相互孤立的(Arnold,2001; Arnold and Volkov, 1999) 。2006年，澳大利亚研究者通过定向进化的方法同时提高了酯酶EstB 的酶活力和热稳定，实验采用随机诱变PCR 来产生氨基酸置换，每个基因可产生的氨
通过pH 变化基酸置换高达5个。在随机诱变之后，
为基础的新型筛选方法对产生的106个突变株进行筛选，经鉴定有显著稳定性的突变株再结合合理的重组步骤，然后再进行下一轮的随机诱变。在筛选了额外的105个克隆之后，分离得到了EstB 的变异株，该变异株在35%DMF 存在的反应中，其EstB 的活性提高了100倍。另外，这一突变株也表现出较好
而在45℃时的的热稳定性，最适温度提高了13℃，
半衰期延长了50倍(Valingeret al., 2007) 。
Liu 等(2006)利用易错PCR 、DNA 改组并结合高通量的筛选方法提高了D －泛解酸内酯水解酶的活力和稳定性，经过三轮筛选，最终获得了一最佳突变株H －1287，其酶活力是野生型酶的10.5倍。另外，该酶在较低的pH 环境中仍能保持85%的活力，具有较好的pH 稳定性和工业应用潜力。
Fujii 等(2009)对自养型假诺卡菌中VD3羟化酶的研究发现：通过随机突变引入的氨基酸置换可以增加底物结合部位或催化剂的其他相关区域的适应
实验最终获得突变性，进而提高其VD3羟化酶活性，
株的比酶活比野生型菌株提高了6倍。
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2.3提高底物特异性
不同的酶具有不同的底物特异性，底物特异性的高低直接影响到底物与酶的结合效率，并进一步影响整个催化过程的反应速率。
大肠杆菌酮糖转移酶对非磷酸化底物特异性的研究中，以酶的天然底物或底物结构类似物为基础
针对羟基丙酮酸(HPA)和羟乙醛(GA)选择突变残基。
转化成L －赤鲜酮糖来构建基因库，并且将突变体的残基与天然序列进行比较。基因库中的许多突变株对底物的特异性是野生型的3倍，在这些突变株中都发现与野生型不同的替换残基。与磷酸基相互作用的保守残基在自然替换的突变株中对非磷酸化残基的底物特异性提高了5倍，这说明：变异残基的种类对调节天然底物和结构类似物活性起着至关重要的作用，并且，通过饱和诱变与底物无相互作用的保守残基可以有效提高酶活(Hibbertet al., 2007) 。
2007年，Ang 等报道了突变株V205A 中氨基苯双加氧酶对2－异丙苯胺的底物特异性，而野生型对其不具有活力。2008年，他们在突变株V205A 的基础上再进行饱和诱变和随机诱变，最终获得的突变株3－R21对苯胺、2,4－二甲基苯胺、2－异丙苯胺的活力比出发菌株V205A 分别提高了8.9倍、98倍和2倍。2,4－二甲基苯胺是一种强致癌污染物，突变株3－R21
反的对映体产物。尽管L －型酶活力不显著，但提供了
进一步改造的空间(王婕等, 2005; Cheon et al., 2003) 。除此之外，酶的分子定向进化在提高生物催化剂对映体选择性方面应用的实例很多，例如：德国生物化学学会的Kirschner 和Bornscheuer (2008)曾经通过易错PCR 和定点诱变来提高单加氧酶的对映体选择性；伦敦大学的Smith 等(2008)通过定点突变提高大肠杆菌酮糖转移酶的对映体选择性等。
3结语
作为绿色化学合成———生物催化与转化过程中的“灵魂”和“发动机”，生物催化剂的应用及其改造已受到广泛关注，诸多学者已在提高生物催化剂的性能和寻找现有生物催化剂新活力及应用方面做了大量研究，并取得了一定成效。酶的分子定向进化是一种有效的、更接近自然进化的蛋白质工程新策略，它不仅能使酶进化出非天然特性，还能定向进化某一代谢途径；不仅能进化出具有单一优良特性的酶，还能使酶的两个或多个优良特性叠加，产生具有多项优化功能的酶，甚至改变酶原有的底物特异性，进而发展和丰富酶类资源。
酶的分子定向进化技术与理性设计互补，使得设计和改造酶(或蛋白质) 分子更加得心应手，更为酶
对其的催化活力是野生型的3.5倍(Anget al., 2009) 。从实验室研究走向工业应用提供了强有力的技术支
制药等方面对蛋撑。酶的分子定向进化不但在工业、
2.4提高对映体选择性
白质的改造具有重要意义，而且也非常适于基础理
生物催化是合成手性分子的绿色工艺之一，为论的研究。通过酶的分子定向进化来研究蛋白质的了实现生物催化的绿色合成特点，将酶的转换策略与结构和功能的关系，可为蛋白质的理性设计提供理化学转换在合成水平上相结合是绿色化学合成的基论依据。酶的分子定向进化在改造生物催化剂的活本要求(Taoand Xu, 2009) 。对映体选择催化剂分子定性、热稳定和耐操作条件等方面取得的卓越成就标向进化的概念是在2001－2002年间提出的，而首次应志着酶的分子定向进化将在认识蛋白质功能和创造用于实验室研究是在2006年(Reetzand Wang, 2007) 。新的生物催化剂的基础研究中发挥更大的作用利用酶的分子定向进化提高生物催化剂的对映体(Vasserotet al., 2003) 。尽管如此，酶的分子定向进化选择性是解决手性物质光学纯度低的一个潜有力技术在许多方面仍需不断地完善和改进，如建立突的方法。变基因文库的方法还需不断优化，对突变控制的能
乙内酰脲酶的特异性随着底物上的5’端取代物力要进一步提高，在筛选目的突变酶方面还需建立而变化，因此该酶对映体特异性不强，这是导致其不一些高通量的筛选方法。
作为分子进化的一个重要分支，酶的分子定向当能大规模生产对映纯L －氨基酸的一个主要原因。
筛选不到较好的乙内酰脲酶时，利用酶的分子定向进化融合并借鉴了各学科包括生物化学、分子生物
生物信息学、计算数学、统计学、合成生物学及计进化改造并提高乙内酰脲酶的对映体选择性成为首学、
并对它们进行了合理、有效的组选的方法。当仅有两个有效氨基酸残基发生取代时，算机科学等的方法，
在蛋白质生物化学领域形成了一个独特而又具有该酶表现出显著的选择性差异：一个突变体在对映合，
为生物催化和转化提供了更为体过量率为90%时产生D －型对映体，而另一个L －发展潜力的分支学科，
同时随着酶的分子定向进化领域型突变体在对映体过量率为40%时，则产生20%的相有效的生物催化剂，
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专题介绍Review
酶的分子定向进化及其应用
平丽英柳志强
薛亚平
郑裕国*
浙江工业大学生物工程研究所, 杭州, 310014*通讯作者, [email protected]
酶的分子定向进化是20世纪90年代初兴起的一种蛋白质工程的新策略，是一种在生物体外模拟自
然进化过程的、具有一定目的性的快速改造蛋白质的方法。该方法引起了生物催化技术领域的又一次革命。目
摘
要
农业及制药业等的相关领域。本文详细综述了酶的分子定向进化的前分子定向进化技术已被广泛应用于工业、概念、过程、基本策略及其核心技术，并着重介绍了酶的分子定向进化技术在提高酶的活力、稳定性、底物特异性和对映体选择性等几方面的应用及取得的相关成果。
关键词生物催化剂, 酶的分子定向进化, 蛋白质工程, 应用
Directed Molecular Evolution of Enzyme and its Application
Ping Liying Liu Zhiqiang Xue Yaping Zheng Yuguo *
Institute of Bioengineering, Zhejiang University Technology, Hangzhou, 310014*Corresponding author, [email protected]:10.3969/gab.028.001020
Abstract Directed molecular evolution of enzyme, originated in the beginning of the nineties of the last century, was a new strategy of protein engineering, which could rapidly modify proteins for specific purpose through imitat-ing externally natural evolutions, as well as it has arisen a revolution in biocatalyst field. Nowadays, this technology has been widely applied in various fields including chemical engineering, agriculture and pharmaceutical industry. This paper elaborates on the concept of directed molecular evolution, procedure, basic strategies, and its core tech-nology, then presents emphatically its application and achievements in improving enzyme activities, stability, sub-strate specificity, and antipode selectivity and so on.
Keywords Biocatalyst, Directed molecular evolution of enzyme, Protein technology, Application 人类对自然资源的过渡开发和利用，由此所引发的环境问题日益严重，这使得传统的化学工业不断地发生改变以适应新时期的发展需求。生物催化是一种新型的转化技术，在化学合成中的应用日趋重要，尤其适于化工及制药工业中手性化合物的合成，因此，生物催化技术为传统化学工业的可持续发展注入了新的活力(Jameset al., 2006; Straathof et al., 2002; Thayer, 2006) 。在生物催化和生物转化中，生物催化剂的立体选择性强、反应条件温和、操作简便、成本较低、副产物少、对环境友好，且能完成一些化
由于绝大学合成难以进行的反应。特别在制药行业，
部分的药物都是手性物质，药品光学纯度要求高，因
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基金项目：本研究由国家863计划项目(2009AA02Z203)资助
此，具有选择性的生物催化和生物转化过程则成为优
先选择的方法(何冰芳和欧阳平凯, 2006; 欧阳立明和
目前，生物催化许建和, 2008; 陈依君和吴旭日, 2007) 。
和生物转化已涉及羟基化、环氧化、脱氢、氢化、水解、水合、酯化、酯转移、酰化、脱羧、脱水和异构化等各类化学反应(欧阳立明和许建和, 2008; 陈依君和吴旭日, 2007; Bi et al., 2009; Kansal and Banerjee, 2009) 。然而，获得转化反应所需的菌株或酶是限制生物催化和生物转化技术发展的瓶颈，一旦获得了适当的生物催化剂，生物转化将不成问题。
酶作为主要的生物催化剂在化学合成中发挥着重要作用，但自然进化的酶不能在所有非天然环境
酶的分子定向进化及其应用
DirectedMolecularEvolutionofEnzyme anditsApplication
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的生物催化和转化反应中发挥成效。现有的生物催
新的活力，它是从基因工程诞生以来，生物技术领域
化剂对大部分非天然底物是不具有活力和选择性取得的最重要的研究成果之一。利用分子定向进化的，因此酶在工业化应用中仍然存在诸多问题。限制技术对生物催化剂进行改造，可以有效地提高生物酶工业应用的因素主要包括：酶的稳定性较低，对非催化剂的性能，使其满足生物催化和转化过程的需天然底物的催化缓慢，对温度、酸碱度的耐受能力低，要。目前分子定向进化技术在提高生物催化剂的活在非水相中的活力和稳定性低，催化反应要求价格昂力、稳定性、对映体选择性等领域开展了深入的研
并取得了一些瞩目的成果。贵的辅助因子等(徐威等, 2004) 。为了使酶更适于生究，采取了不同物催化和转化应用，研究者从不同角度、
的方法改造酶，虽然取得了一定进展，但仍不能从根本上解决酶在实际应用中存在的问题，因此，酶的分子定向进化方法应运而生(姜涌明等, 2000) 。
2酶的分子定向进化的应用
2.1提高稳定性
酶的稳定性对以酶为催化剂的有机合成尤为重要，即使催化反应发生在水相也是如此。而在有机合成过程中，作为生物催化剂的酶所处的真实条件同其进化的自然环境通常差异显著，特别是在高温、极端pH 和非水相体系中进行的催化反应更加要求提高酶的稳定性和活力(何冰芳和欧阳平凯, 2006; 孙志浩, 2005) 。2.1.1热稳定性
在工业生产和科学研究中提高某一特定反应的温度是必要的，因为提高温度可以提高底物的可溶性，进而提高反应速率并可有效降低介质的黏度等，然而较高的反应温度对酶的热稳定性是一个严峻的考验。许多研究者通过分子定向进化的方法，在提高酶的热稳定性方面做了大量的研究，并取得了一些可喜的成果。
易错PCR 是提高生物催化剂热稳定性的有效方法之一，北京市生物加工过程重点实验室通过易错PCR 和DNA 改组的方法使无根根霉菌产生突变，以此来提高其脂肪酶的热稳定性，实验获得了一个含有3个氨基酸置换的突变株，这一突变株的最适温度比野生型菌株提高了10℃，另外该突变株在50℃时的半衰期比野生型提高了12倍(Niuet al., 2006) 。
通过易错PCR 提高催化剂热稳定性的另一个典
Kim 和Lei (2008)利用该方法来提高植酸型的例子：
以此来降低该酶的热失活，实酶AppA2的热稳定性，
而其Tm 值验最终获得突变株的耐热性提高了20%，
也提高了6~7℃。2.1.2pH 稳定性
不同的酶有其不同的最适pH 范围，当反应体系的pH 值达到其最适条件时，酶将发挥其最佳的催化效率，但当反应体系的pH 不适宜时，酶的催化效率就会有所降低，在极端的pH 条件下，甚至会失去活性。
Tao 和Qin (2009)通过DNA 改组的方法来提高
1酶的分子定向进化的概念
酶的分子定向进化(directedevolution) 又称蛋白质分子定向进化，是蛋白质工程的新策略，主要利用分子生物学手段，在分子水平上创造分子的多样性，在事先不了解酶的空间结构和催化机制的情况下，通过模拟自然进化，在体外改造酶的基因，以改进的诱变技术结合灵敏的筛选方法，定向选择有价值的非天然酶(孙志浩, 2005; Williams et al., 2004; 孙志浩和柳志强, 2005) 。该方法是一种在生物体体外模拟达尔文进化的、具有一定目的性和快速改造蛋白质的方法，相对于传统的蛋白质的“理性设计(rationaldesign) ”方法，酶的分子定向进化被称为蛋白质的“非理性设计(irra-方法(张红缨等, 1999, 科学通报, 44(11):tional design) ”
1121-1127; Williams et al., 2004; 孙志浩, 2005) 。
酶的分子定向进化为生物催化剂的改造提供了又一有力的技术支持，它能改进生物催化剂或在短时间内发掘出生物催化剂的新特性，加速人类改造酶原有功能和开发酶新功能的步伐，为提高生物催化剂的工业化操作性能提供了新的思路和方法，并为天然来酶的分子定源的生物催化剂的广泛应用奠定了基础。
向进化研究的主要方向是提高热稳定性，提高有机溶剂中酶的活性和稳定性，扩大底物的选择性，改变光学异构体的选择性，其核心技术为突变库构建技术及高通量筛选方法(王黎等, 2009) 。酶的分子定向进化的基本策略：随机突变以构建突变基因文库，通过重组方法如DNA 改组、交换和组建突变基因片段筛选出最佳的生物催化剂(张红缨等, 1999, 科学通报, 44(11):1121-1127; Kolkman and Stemmer, 2001) 。随着酶的分子定向进化技术的不断应用，其必将扩大整个催化剂家族的生物多样性。
酶的分子定向进化为蛋白质工程的发展注入了
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链霉菌木聚糖酶B 的热和碱性pH 稳定性。他们在碱性缓冲液中筛选得到具有热稳定性的阳性克隆
最终获得的最佳突子，经过3轮的DNA 改组实验，
变株3S1×B6表现出显著的热稳定性，在70℃可稳定存在360min ，而野生型仅3min 就会损失50%的活性。另外，3S1×B6在pH 9.0的碱性缓冲液中的稳定性也有所提高。
日本研究者利用易错PCR 结合有效地筛选方法，对木霉属β－1,4－葡聚糖内切酶Ⅲ进行改造，并研究了酶活的提高与稳定性提高之间的关系。实验
株的半衰期提高了4倍，而其在有机溶剂中的稳定性与野生菌相比也有明显提高(Songand Rhee, 2001) 。
以细胞色素P450的四重突变体QM 为出发菌株，利用改进的随机诱变技术结合高通量的筛选方法，以此来提高QM 的温度稳定性及其在有机相中的稳定性。在筛选了3000个克隆子后获得了突变体QM/L295H和QM/K2361/D257N。QM/L295H在35~55℃温度范围内比QM 表现出较高的活力，在45℃保存6h 后，QM/L295H的活力是QM 的1.4倍而在2.5%~15%的DMSO 溶液中，QM/L295H和
获的最佳突变株2R4的酶活力是野生型的130倍。QM/K2361/D257N均比出发菌株QM 表现出更高的
而且它还具有广泛的pH 稳定性，在pH 4.4~8.8之间
稳定性和酶活力(Kumaret al., 2006) 。
均能稳定存在，而野生型的稳定pH 范围是4.4~5.2。定向进化提高了突变株耐碱能力，在pH 稳定性提高2.2提高酶活力的同时，该菌株的耐热性也有所提高，在55℃可稳定突变株2R4对羟甲基纤维素的催化速率存在30min 。
常数K cat 是野生型的1.4倍，而其米氏常数K m 值是野生型的2倍(Nakazawaet al., 2009) 。
Mchunu 等(2009)采用易错PCR 来提高真菌木聚糖酶的碱耐受性，最佳突变株NC38在pH 10、温度60℃的极端条件下存在90min 后，仍能保持84%的活性，而野生型菌株在60min 时只能保持22%的活性。2.1.3非水相的稳定性
在过去的20年中，有机化学合成中酶的开发与应用越来越引起人们的重视，酶在非水相中的催化反应在各领域得到了广泛应用，已成为酶学研究的主要内容之一。酶的分子定向进化技术对有机合成用酶性能的改造，不仅提高了非水相反应体系中酶的稳定性，也发展和完善了酶的分子定向进化的技术水平，并进一步拓展了其应用范围(Guptaand Roy, 2004) 。
Chen 和Arnold (1991;1993)通过易错PCR 对枯草
以此来提高该酶在有机芽孢杆菌蛋白酶E 进行改造，
溶剂中水解短肽suc-Ala-Ala-Pro-Pro-p －硝基苯胺的能力。实验获得的最优突变体(PC3)在含有60%DMF 中水解短肽suc-Ala-Ala-Pro-Pro-p －硝基苯胺的能力是野生型的256倍，而在80%DMF 中为野生型的131倍。在含有70%的DMF 溶液中，比较了野生型和突变型菌株催化L －甲硫氨酸甲基酯合成聚L －甲硫氨酸的能力，实验发现：野生型酶不能合成聚L －甲硫氨酸，而PC3可以催化合成大量产物。
磷脂酶A1在有机溶剂中的稳定性和活力较低，在易错PCR 、DNA 改组与筛选方法相结合来提高其稳定性实验中，二次突变库用50%的DMSO 处理36h 后，获得了3个突变株(SA8,SA17, SA20) 。这3个突变
酶活的高低反映一个生物催化与转化过程反应
速率的快慢，酶活越高，反应速率越快，反之则反应
实现较高的酶活是各生产企业一直速率越慢。因此，
追求的目标。
Arnold 小组对酶活提高与稳定性提高之间的关系进行了研究，结果表明酶活提高与稳定性提高并不是相互孤立的(Arnold,2001; Arnold and Volkov, 1999) 。2006年，澳大利亚研究者通过定向进化的方法同时提高了酯酶EstB 的酶活力和热稳定，实验采用随机诱变PCR 来产生氨基酸置换，每个基因可产生的氨
通过pH 变化基酸置换高达5个。在随机诱变之后，
为基础的新型筛选方法对产生的106个突变株进行筛选，经鉴定有显著稳定性的突变株再结合合理的重组步骤，然后再进行下一轮的随机诱变。在筛选了额外的105个克隆之后，分离得到了EstB 的变异株，该变异株在35%DMF 存在的反应中，其EstB 的活性提高了100倍。另外，这一突变株也表现出较好
而在45℃时的的热稳定性，最适温度提高了13℃，
半衰期延长了50倍(Valingeret al., 2007) 。
Liu 等(2006)利用易错PCR 、DNA 改组并结合高通量的筛选方法提高了D －泛解酸内酯水解酶的活力和稳定性，经过三轮筛选，最终获得了一最佳突变株H －1287，其酶活力是野生型酶的10.5倍。另外，该酶在较低的pH 环境中仍能保持85%的活力，具有较好的pH 稳定性和工业应用潜力。
Fujii 等(2009)对自养型假诺卡菌中VD3羟化酶的研究发现：通过随机突变引入的氨基酸置换可以增加底物结合部位或催化剂的其他相关区域的适应
实验最终获得突变性，进而提高其VD3羟化酶活性，
株的比酶活比野生型菌株提高了6倍。
酶的分子定向进化及其应用
DirectedMolecularEvolutionofEnzyme anditsApplication
1023
2.3提高底物特异性
不同的酶具有不同的底物特异性，底物特异性的高低直接影响到底物与酶的结合效率，并进一步影响整个催化过程的反应速率。
大肠杆菌酮糖转移酶对非磷酸化底物特异性的研究中，以酶的天然底物或底物结构类似物为基础
针对羟基丙酮酸(HPA)和羟乙醛(GA)选择突变残基。
转化成L －赤鲜酮糖来构建基因库，并且将突变体的残基与天然序列进行比较。基因库中的许多突变株对底物的特异性是野生型的3倍，在这些突变株中都发现与野生型不同的替换残基。与磷酸基相互作用的保守残基在自然替换的突变株中对非磷酸化残基的底物特异性提高了5倍，这说明：变异残基的种类对调节天然底物和结构类似物活性起着至关重要的作用，并且，通过饱和诱变与底物无相互作用的保守残基可以有效提高酶活(Hibbertet al., 2007) 。
2007年，Ang 等报道了突变株V205A 中氨基苯双加氧酶对2－异丙苯胺的底物特异性，而野生型对其不具有活力。2008年，他们在突变株V205A 的基础上再进行饱和诱变和随机诱变，最终获得的突变株3－R21对苯胺、2,4－二甲基苯胺、2－异丙苯胺的活力比出发菌株V205A 分别提高了8.9倍、98倍和2倍。2,4－二甲基苯胺是一种强致癌污染物，突变株3－R21
反的对映体产物。尽管L －型酶活力不显著，但提供了
进一步改造的空间(王婕等, 2005; Cheon et al., 2003) 。除此之外，酶的分子定向进化在提高生物催化剂对映体选择性方面应用的实例很多，例如：德国生物化学学会的Kirschner 和Bornscheuer (2008)曾经通过易错PCR 和定点诱变来提高单加氧酶的对映体选择性；伦敦大学的Smith 等(2008)通过定点突变提高大肠杆菌酮糖转移酶的对映体选择性等。
3结语
作为绿色化学合成———生物催化与转化过程中的“灵魂”和“发动机”，生物催化剂的应用及其改造已受到广泛关注，诸多学者已在提高生物催化剂的性能和寻找现有生物催化剂新活力及应用方面做了大量研究，并取得了一定成效。酶的分子定向进化是一种有效的、更接近自然进化的蛋白质工程新策略，它不仅能使酶进化出非天然特性，还能定向进化某一代谢途径；不仅能进化出具有单一优良特性的酶，还能使酶的两个或多个优良特性叠加，产生具有多项优化功能的酶，甚至改变酶原有的底物特异性，进而发展和丰富酶类资源。
酶的分子定向进化技术与理性设计互补，使得设计和改造酶(或蛋白质) 分子更加得心应手，更为酶
对其的催化活力是野生型的3.5倍(Anget al., 2009) 。从实验室研究走向工业应用提供了强有力的技术支
制药等方面对蛋撑。酶的分子定向进化不但在工业、
2.4提高对映体选择性
白质的改造具有重要意义，而且也非常适于基础理
生物催化是合成手性分子的绿色工艺之一，为论的研究。通过酶的分子定向进化来研究蛋白质的了实现生物催化的绿色合成特点，将酶的转换策略与结构和功能的关系，可为蛋白质的理性设计提供理化学转换在合成水平上相结合是绿色化学合成的基论依据。酶的分子定向进化在改造生物催化剂的活本要求(Taoand Xu, 2009) 。对映体选择催化剂分子定性、热稳定和耐操作条件等方面取得的卓越成就标向进化的概念是在2001－2002年间提出的，而首次应志着酶的分子定向进化将在认识蛋白质功能和创造用于实验室研究是在2006年(Reetzand Wang, 2007) 。新的生物催化剂的基础研究中发挥更大的作用利用酶的分子定向进化提高生物催化剂的对映体(Vasserotet al., 2003) 。尽管如此，酶的分子定向进化选择性是解决手性物质光学纯度低的一个潜有力技术在许多方面仍需不断地完善和改进，如建立突的方法。变基因文库的方法还需不断优化，对突变控制的能
乙内酰脲酶的特异性随着底物上的5’端取代物力要进一步提高，在筛选目的突变酶方面还需建立而变化，因此该酶对映体特异性不强，这是导致其不一些高通量的筛选方法。
作为分子进化的一个重要分支，酶的分子定向当能大规模生产对映纯L －氨基酸的一个主要原因。
筛选不到较好的乙内酰脲酶时，利用酶的分子定向进化融合并借鉴了各学科包括生物化学、分子生物
生物信息学、计算数学、统计学、合成生物学及计进化改造并提高乙内酰脲酶的对映体选择性成为首学、
并对它们进行了合理、有效的组选的方法。当仅有两个有效氨基酸残基发生取代时，算机科学等的方法，
在蛋白质生物化学领域形成了一个独特而又具有该酶表现出显著的选择性差异：一个突变体在对映合，
为生物催化和转化提供了更为体过量率为90%时产生D －型对映体，而另一个L －发展潜力的分支学科，
同时随着酶的分子定向进化领域型突变体在对映体过量率为40%时，则产生20%的相有效的生物催化剂，
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