有机酸工艺学
1. 代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。 2. 原位产物分离技术：是指将生产细胞的代谢产物快速移去的方法。它和发酵有机结合（耦合）则为原位产物分离发酵。
3. 固定化细胞技术：是将具有一定生理功能的生物细胞，例如微生物细胞、植物细胞或动物细胞等，用一定的方法将其固定，作为固体生物催化剂而加以利用的一门技术
4. 促进剂及毒害剂的定义
从生长角度：营养物质一般可以说是促进剂
从产酸角度：能提高产酸率的都可以说是促进剂
注：对生长的毒害剂不一定是产酸的毒害剂。而且许多产酸促进剂正是菌体生长的毒害剂，作用包括抑制过度长菌、调节代谢和改变细胞结构等方面。
5. 生理酸性氮和生理碱性氮定义
植物根系从溶液中选择性的吸收离子后使溶液酸度/碱度增加的盐类。
生理酸性氮：(NH4)2SO4、 (NH4)3PO4、(NH4)2HPO4、 NH4Cl 、 (NH4)2CO3等，调节代谢，控制pH
生理碱性氮:NaNO3、KNO3、LiNO3、Ca(NO3)2、Mg(NO3)2等
6. 生物量定义
广义的生物量是生物在某一特定时刻单位空间的个体数、重量或其含能量 。狭义的生物量仅指以重量表示的，可以是鲜重或干重。
7. 发酵工程分为哪三个部分？
上游工程——获得发酵产品的条件
发酵工程——微生物反应过程
下游工程——后处理/提取纯化过程
8. “双酶法”制取水解糖采用哪两种酶联合作用：淀粉酶、糖化酶
9. 乙醛酸循环与醋酸发酵柠檬酸途径
10. 柠檬酸发酵的产率
（1）无CO2固定反应的产率
合成1分子柠檬酸需要3分子乙酰辅酶A ，也就是需要1.5分子的葡萄糖。理论产率为：192 /( 180×1.5) = 71.1%
（2）通过CO2固定反应提供四碳二羧酸
葡萄糖生成柠檬酸的全过程中，在碳平衡方面没有碳原子的损失，在乙酰CoA 和草酰乙酸缩合时还从水中引进一个氧原子，总反应式为： C6H12O6+1.5O2→C6H8O7+2H20
可见柠檬酸发酵对糖的理论转化率为106.7%，以含一个结晶水的柠檬酸计为116.7%。
11. 黑曲霉柠檬酸高产菌的生理特征有哪些？
（1）能耐高浓度的柠檬酸（15%以上），而不利用和分解柠檬酸。
（2）耐高浓度葡萄糖，能产生和分泌大量的酸性α-淀粉酶和酸性糖化酶
（3）能抗微量金属离子，尤其能抗较高浓度的Mn2+、Zn2+、Cu2+。
（4）在液体深层液体发酵培养时，能形成大量的细小菌球体，球体直径为0.1mm ，菌球量达104个/ml以上
（5）在以葡萄糖为唯一碳源的合成培养基上生长不好，生成小菌落，孢子形成能力弱。
（6）在生长、繁殖期，细胞内具有较高水平的氨基酸、NH4+，即NH4+库水平高
（7）菌丝体中含有低水平的甘油三酯和磷酸酯。
（8）在生长期和产酸期，细胞内蛋白质核酸水平低。
（9）具有很强的侧系呼吸链活性，此侧系呼吸链不产生ATP 。
12. 我国柠檬酸发酵生产常用菌种及特点
常用的是黑曲霉。特点见上。
13. 柠檬酸发酵主要原料类型
（1）淀粉质原料；（2）粗制糖类；（3）制糖工业副产品；（4）含正烷烃较多的石油馏分；
（5）副原料以及各种产酸促进剂。
14. 柠檬酸发酵属好氧发酵，其三种主要发酵方式及概念
三种方式：表面发酵、固体发酵、深层发酵。其中表面发酵、固体发酵利用气相氧，深层发酵利用的是溶解氧。
（1）表面发酵：利用生长在液体培养基表面的微生物的代谢作用，将可发酵性原料转化为柠檬酸的。这种工艺出现最早。
（2）固体发酵：是将发酵原料及菌体被吸附在疏松的固体支持物上，经过微生物的代谢活动，将原料中的可发酵成分转化为柠檬酸
（3）深层发酵：是指在发酵过程中从发酵底部通入无菌空气并搅拌，使空气与发酵液的接触面积极大提高。从而大幅度提高氧气含量。
15. 黑曲霉柠檬酸生物合成途径
黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是：葡萄糖经EMP 、HMP 途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA ，另一方面经CO 2固定化反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰CoA 缩合生成柠檬酸。
(1)生长期与产酸期都存在EMP 与HMP 途径，前者EMP:HMP=2:1，后者EMP:HMP=4：1
(2)黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA
循环与乙醛酸循环，在以糖质原料发酵时，当柠檬酸积
累时，TCA 和乙醛酸循环被阻断或减弱。
(3)由于TCA 和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是由丙酮酸（PYR ）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP ）羧化生成的。即由两个CO 2固定化反应体系，其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化CO 2生成草酰乙酸为主。
16. 柠檬酸生物合成的代谢调节机制
（1）糖酵解及丙酮酸代谢的调节；
（2）三羧酸循环的调节；
（3）氧对柠檬酸积累的调节；
17. 柠檬酸发酵过程的控制要点
（1） 控制Mn 、NH 4浓度，解除柠檬酸对PFK 的抑制，使EMP 畅通无阻。
（2） 控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。
2+（3） 控制培养基中的Fe 的浓度，使顺乌头酸水合酶失活。 2++
18. 柠檬酸发酵过程中Mn 2+缺乏为何会使NH 4+浓度升高呢？
当培养基中Mn 缺乏时，微生物体内积累几种氨基酸（GA 、GLu 、Arg 等），这些氨基酸的积累，意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受到影响，这样++NH 4的消耗下降，NH 4浓度就会升高。 2+
19. 柠檬酸发酵液提取之前进行预处理方法及作用
方法：热处理，75～90℃，时间宜短不宜长。
作用：
（1）杀灭柠檬酸产生菌和杂菌，终止发酵，防止柠檬酸被代谢分解
（2）使蛋白质变性而絮凝，破坏胶体，降低料液黏度，利于过滤；
（3）可使菌体中柠檬酸部分释放出来。
20. 柠檬酸提取中草酸的影响：在热的中和液中，草酸钙可以在pH3以下沉淀析出，从
而可以先分离出来。草酸钙的颗粒很细，易堵塞过滤介质孔道，从而影响滤速和洗糖。
21. 柠檬酸提取中除草酸的方法
有机杂酸主要是草酸和葡萄糖酸，都能形成钙盐。前者溶解度很低，故可在中和前除去，后者溶解度很高，中和之后绝大部分在废水中排除。利用草酸钙溶解度低于硫酸钙溶解度，在一次滤液中加硫酸钙，使其生成草酸钙，在一次滤液复滤时，一并除去。
（加热发酵液至70~75℃，不断搅拌下添加石灰乳（深度为120g/L），调至pH2.7~2.9，但不得超过3.0，否则柠檬酸钙也可能析出。这里，草酸以钙盐形式沉淀下来，经15~20min后过滤，滤液以11% CaCl2水溶液定性检验草酸是否沉淀完全，如不完全则应再加石灰乳，按前法操作）
22. 柠檬酸提取工艺中，萃取法提取柠檬酸时可选用萃取剂的类型：
单一组分的萃取剂：乙醇、丁醇、N-烷基酰胺等
混合萃取剂：有机胺与烃、乙醇的混合物
23. 萃取法提取柠檬酸时对萃取剂的要求
（1）对柠檬酸有较强的溶解能力，选择性强，不溶解还原糖、蛋白质等发酵液中的杂志
（2）在水中溶解度低，对柠檬酸来说具有较高的分配系数
（3）物理化学性质稳定，不与发酵液中有关物质反应，操作中无乳化作用
（4）易于柠檬酸分离，不残留在柠檬酸晶体内，在操作过程中损耗小，易于回收；
（5）价格低廉，来源方便，对人体无毒害。
24. 柠檬酸钙盐在水中的溶解度性质
柠檬酸钙盐在水中的溶解度较小，并且随温度升高进一步降低。 如果温度升高至95~100℃，Ca （C 6H 5O 7）.4H 2O 的溶解度可进一步降低为0.578g/L水。钙盐提取法就是利用这种性质。 将溶液加热至沸，使柠檬酸钙盐比较完全沉淀析出，而其它有机酸钙（葡萄糖酸钙、草酸钙）等物质溶解。在溶液中含有PO 43-和过量Ca 2+时，可促进钙盐沉淀。
柠檬酸钙的溶解度也与酸度有关，pH 值降低时溶解度增大。
25. 柠檬酸钙盐法提取工艺流程
我国柠檬酸提取采用钙盐法：发酵液经加热处理后，滤去菌体残渣，在中和桶中加入CaCO 3或石灰乳，使柠檬酸以钙盐形式沉淀下来，废糖水和可溶性杂质则过滤除去，柠檬酸钙在酸解槽中加入H 2SO 4酸解，使柠檬酸游离出来，形成硫酸钙被滤除，作为副产物使用。 这时得到的粗柠檬酸溶液通过脱色和离交净化，除色素、胶体、无机离子等杂质，然后浓缩、结晶、干燥即可包装出厂。
26. 柠檬酸提取中，酸解操作终点测定的方法(双管清法)
取酸解清滤液2ml, 加18ml95%乙醇，摇匀后过滤。取2支小试管，每支中加入滤液5ml ，一支中加入5滴20g/dL氯化钙液，另一支加20%的硫酸，并在90℃以上的热水浴中加热。如两管都清，则表明已到终点。若加硫酸的管混浊，说明仍需往酸解桶中加硫酸；同样若加氯化钙的管混浊，则需往酸解桶中加钙盐。其原理是利用酸解液中过量的Ca2+或SO42-与试剂中的SO42-或Ca2+生成CaSO4沉淀的特性。加95%的酒精是为了去除酸解液中的水溶性蛋白，另外，硫酸钙在酒精中的溶解度比水中更小，更易析出。加热是利用硫酸钙的溶解度随温度上升而下降的特性，使沉淀现象更明显。
27. 柠檬酸钙酸解时的净化操作步骤的方法
（1）脱色 ：活性炭脱色（2）除SO 42-：钡盐沉淀除法 （3）除Fe 3+、Ni 3+：亚铁氰化钙沉淀法（生成普鲁士蓝沉淀）（4）除Pb 2+、As 3+：硫化物沉淀法
28. 柠檬酸表面发酵过程中，影响发酵产酸的因素有哪些？
培养液层厚度，糖浓度，温度，pH ，通气，不正常的发酵处理。
29. 表面发酵的主要设备
发酵盘、发酵室、通风系统、发酵室灭菌
30. 柠檬酸深层液体发酵终点控制条件
当通风搅拌培养50～72h ，柠檬酸产酸达100～150g/L，柠檬酸产量不再上升，残糖降至2g/L以下，可升温终止发酵，泵送至储罐中，及时进行提取。
31. 浓缩的定义及柠檬酸溶液浓缩时的温度操作
柠檬酸水溶液在沸腾状态下使其水分迅速蒸发，以提高溶液中酸的浓度，这一物理过程称为浓缩。
温度操作要求：开始温度不超过70℃，当溶液浓缩至35%以上，，酸度增高时，温度不超过60℃.
32. 柠檬酸浓缩操作的主要设备：蒸发器，冷凝器，真空发生系统。
33. 结晶：是固体物质以晶体状态从蒸汽、溶液或熔融物中析出的过程。
34. 柠檬酸结晶时，温度低于36℃形成一水柠檬酸，超过36℃形成无水柠檬酸
35. 结晶操作中起晶方式有哪三种及各自的定义
(1)
自然起晶：降温或浓缩使溶液的过饱和度增大到不稳定区时，溶液中即可以自发产
生晶核，称为“自然起晶”。
(2)刺激起晶：将溶液用蒸发浓缩的方法排除部分溶剂，使溶液浓度进入过饱和不稳定区，然后将溶液放出，使溶液受到突然冷却，进入不稳定区，而自然自行结晶生成晶核。添加晶种起晶：溶液在介稳状态时，认为加入一定数量和粒度的晶体粉末，称为“添加晶种起晶”。
(3)添加晶种起晶:将溶液浓缩到介稳定区的饱和浓度后，加入一定大小和数量的晶种，同时均匀搅拌，使晶体长大。
36. 影响结晶速度的因素
（1）过饱和度（2）晶粒表面积（3）温度（4）境界膜厚度（5）粘度
37. 初级晶核和次级晶核的定义
初级晶核：首批形成的晶核或加入的晶种都称为“初级晶核” 次级晶核：后面不论何时形成的晶核都称为“次级晶核”。
38. 一次母液和二次母液定义
母液：第一次分离柠檬酸结晶后的母液称为一次母液，由一次母液继续浓缩结晶，分离出结晶后的母液称为二次母液。
39. 饱和溶液和过饱和溶液的定义
饱和溶液，指的是在一定温度下，一定剂量的溶剂里面，不能继续溶解溶质，即浓度不变的溶液
过饱和溶液：一定温度、压力下，当溶液中溶质的浓度已超过该温度、压力下溶质的溶解度，而溶质仍不析出的现象叫过饱和现象，此时的溶液称为过饱和溶液。
40. 介稳区还可以分为哪两个区域：刺激起晶区和育晶区
41. 境界膜的定义
结晶时，紧靠晶粒区域a=1，即浓度=饱和浓度C1，如维持母液的浓度为C(C＞C1), 则在晶粒周围形成了一层具有一定浓度梯度的液膜，称为境界膜。
42. 干燥过程两个阶段及干燥速度的有关因素
(1) 使水分蒸发；(2)除去气化后的水分
影响因素：
（1）温度：温度越高，干燥越快。一水柠檬酸干燥时不超过36℃，无水柠檬酸一般40℃以上
（2）空气流的湿含量：湿度越低，干燥越快
（3）干燥介质与物料的混合程度：混合程度越高，干燥速度越快
（4）干燥介质流速：气流速度增加，干燥速度加快。
43. 影响柠檬酸中和操作的主要原因有哪些？
（1）滤液的质量；（2）pH 的控制；（3）中和温度；（4）其它阳离子的影响；（5）中和剂质量的影响；（6）搅拌器的作用
44. 柠檬酸工业副产物主要有哪些？
黑曲霉菌体、中和滤液（废糖液）、石膏渣、钙盐洗水、离交柱洗水等。
45. 柠檬酸发酵过程中常见染菌类型:细菌、酵母菌、霉菌
46. 有机酸发酵工业中，发酵过程杂菌污染的危害有哪些？
（1）杂菌分泌的代谢物抑制生产菌的生长代谢和产物合成 ，这称为生产菌的拮抗菌
（2）杂菌消耗了大量糖及其他营养物，大量繁殖菌体和生成非预期产物，降低产率
（3）杂菌的分泌物使柠檬酸提取和精制困难
（4）杂菌寄生于生产菌的菌体内致死寄主
47. 杂菌污染防治措施
（1）始终严格贯彻无菌操作制度
（2）加强环境卫生管理，发酵车间和菌种室内外环境，要保持整洁，定期清扫和消毒
（3）重视设备，保持高的设备完好率，发酵工业由于设备系统引起染菌的概率较高，要定期检查管、阀、法兰、轴封等
（4）保证无菌空气质量，定期检查空气过滤器的过滤效果，要注意突然停电时的保压工作
（5）严格保证菌种质量，各级菌种必须严格无菌检查和摇瓶验证后才能供生产使用
48. 自然选育与诱变选育概念和主要步骤
自然选育：在生产过程中，不经人工处理，利用菌种自身的突变或直接从自然界中分离筛选的过程。
诱变选育：通过诱变剂处理来提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出具有优良性状的突变株。
主要步骤：
49. 种子定义及质量要求
将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养, 最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。
质量要求：
（1）镜检：菌丝粗壮，结成菊花状小球体，无异味，无杂菌；
（2）pH ：2.0-2.5;
（3）酸度：0.5-2.0%；
（4）柠檬酸含量：0.5g/dl
50. 种子扩培的定义及两个阶段
种子扩培：指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养, 最终获得一定数量和质量的纯种过程
实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此将其称为实验室阶段的种子培养。孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月
生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工厂归发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。
51. 菌种纯化主要方法有哪三种？
平板划线分离、平板稀释分离和小滴分离纯化培养
52. 菌种保藏的目的：使菌种保持活力，同时还要保持其优良的生产状态。
53. 菌种保藏的方法：斜面低温保藏法、载体吸附保藏法、真空冷冻干燥保藏法液氮超低温（-196℃）保藏法
54. 菌种衰退定义及原因
菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。
原因：（1）环境条件：如培养基成分不适，温度过高； （2）移植菌株间歇时间过长，分离复壮时间间歇过长； （3）分离复壮效果差或杂菌污染； （4）连续传代次数过多或菌种有关基因发生自然突变或者恢复突变。
55. 乳酸发酵根据生成产物的不同主要分为哪两种类型及各自转化率：
（1） 同型乳酸发酵：1mol 葡萄糖生成2mol 乳酸，理论转化率为100%。一般认为转化率
在80%以上即视为同型乳酸发酵。
（2） 异型乳酸发酵：1mol 己糖生成1mol 乙酸、1mol 二氧化碳和1mol 乳酸. 乳酸对糖的
转化率为50%
（3） 双岐发酵途径：50%
56. 乳酸发酵微生物及各自发酵特点
（1）细菌：
德氏乳杆菌：发酵产生D-乳酸，少数菌株产生DL-乳酸。不加中和剂时，最高生成乳酸浓度可达16g/L。最适生长温度为45℃，最高耐受温度为55℃
赖氏乳杆菌：不加中和剂时，在发酵液中可产生13g/L的D-乳酸。最适生长温度为36℃ 植物乳杆菌：在己糖发酵中产DL-乳酸及少量乙醇和CO 2。发酵戊糖产醋酸和乳酸，不中和时产酸量达12 g/L.最适生长温度30℃，最高40℃。
（2）米根霉：可利用无机氮源，发酵产L-乳酸，最适温度为30℃。
57. 乳酸钙晶体的形状: 乳酸钙为白色或近似白色结晶颗粒或粉状，无味或基本上无味，微有风化性易固化成珊瑚状。
58. 乳酸发酵结束，乳酸提取工艺中的乳酸钙前结晶工艺流程及操作要点 工艺流程：
操作要点：
① 乳酸钙浓缩液浓度，即乳酸钙结晶起始浓度，应控制在26%~28%范围内，必须趁热放出。 ② 乳酸钙分子在水溶液中呈水合状态，其溶解度随溶液中含的杂质增加而增加。所以浓缩
前必须脱色。
③ 乳酸钙起晶温度以30℃为好。最终结晶温度应不高于10℃。
④ 酸解中要严格控制乳酸的浓度。为了获得大颗粒石膏结晶，便于过滤操作，必须严格控
制如下工艺条件： A. 溶液中石膏的过饱和系数为1.3~1.4； B. 乳酸浓度不超过22%； C. 温度控制在80℃左右；D. 硫酸过量0.5%以下； E. 石膏晶体成熟时间为1h 。
59. 国内乳酸钙的精制工艺：（吸附、重结晶、离子交换、萃取、蒸馏、过滤、离心等）
前结晶工艺、直接酸解工艺、锌结晶工艺、溶剂萃取法、离子交换法
60. 葡糖糖酸发酵主要菌种：黑曲霉、醋酸菌
61. 葡萄糖酸盐的制备方法：生物发酵法、均相化学氧化法、电解氧化法、多相催化氧
化法
62. 果醋、白醋、陈醋的定义
果醋：是以水果或果品加工下脚料为主要原料，利用现代生物技术酿制而成的一种营养丰富、风味优良的酸味调味品。
白醋：以蒸馏过的酒发酵制成，或直接用食品级别的醋酸兑制。可用作烹调的酸味辅料 陈醋：酿成后存放较久的醋，先加入多量酒曲，采用低温酒精进行发酵，然后再拌入谷糠麸皮经醋酸发酵
63. 山西老陈醋酿造中，夏日晒和冬捞冰的概念：是指冬天捞出醋中的冰, 夏日暴晒
蒸发醋中的水分, 以提高醋的品质
64. 我国目前的几种食醋发酵工艺：固态发酵，液态发酵，固液发酵
65. 食醋发酵工艺原料（按工艺要求分）主料、辅料、填充料、添加剂。
固态发酵：
原料：粮食 辅料：麸皮 填充料：谷糠，稻壳 糖化剂：麸曲，大曲，小曲
液态发酵：淀粉
66. 食醋发酵工艺分哪三阶段组成，其中我国的双边发酵工艺特点
淀粉糖化过程、酒精发酵、醋酸发酵
固态双边发酵特点是采用比较低的温度，让糖化和酒精同时进行，即采用边糖化边发酵工艺。
67. 醋酸菌按其氧化能力差别可分为哪四大群？
过氧化菌，氧化菌，中氧化菌，弱氧化菌
68. 我国食醋酿造中应用最广的糖化剂：麸曲
69. 酒精发酵过程中，酒母制备的四个主要质量指标
（1）酵母细胞数：繁殖能力指标，一亿/ml；
（2）出芽率：繁殖旺盛指标，15-30%；
（3）酵母死亡率：
（4） 酸度：污染指标，
70. 醋酸提取工艺中，采用高沸点溶剂萃取的萃取剂一般是：磷酸三丁酯、三辛基
氧磷
71. 醋酸的常用提取工艺：分馏、恒沸蒸馏、溶剂萃取、联合提取
72. 苹果酸的生产方法：提取法、化学合成法、一步发酵法、两步发酵法、固定化酶或细
胞转化法
73. 苹果酸发酵中，培养基添加CaCO 3的作用：养基中碳酸钙的存在是苹果酸有效积
累的必要条件, 碳酸钙的作用一是作为中和剂中和代谢生成的苹果酸形成苹果酸钙, 维持相对稳定的pH 值, 保证发酵的正常进行, 二是形成的苹果酸与碳酸钙反应放出CO 2, 为CO 2固定支路提供CO 2, 促进苹果酸的积累
74. 衣康酸发酵工艺生产常用微生物：衣康酸曲霉、土曲霉
75. 衣康酸发酵菌种的选育通常传统的菌种筛选步骤：
（1）形态筛选法
（2）高酸、高渗透压平板筛选法
（3）摇瓶初筛
（4）摇瓶复筛
76. 衣康酸发酵菌种诱变时的四种筛选方法
（1）形态筛选法；（2）指示剂显色法；（3）“浓缩”过滤筛选法；（4）标记筛选法。
77. 影响衣康酸发酵的几个重要因素
（1） 蔗糖为原料：发酵条件（温度、pH 、接种量、通气与搅拌、菌体生长量），发酵培
养基组成（蔗糖浓度、氮源、镁盐、磷酸盐，其他盐类、消泡剂）
（2） 淀粉为原料：发酵原料、温度、pH 、溶解氧
有机酸工艺学
1. 代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。 2. 原位产物分离技术：是指将生产细胞的代谢产物快速移去的方法。它和发酵有机结合（耦合）则为原位产物分离发酵。
3. 固定化细胞技术：是将具有一定生理功能的生物细胞，例如微生物细胞、植物细胞或动物细胞等，用一定的方法将其固定，作为固体生物催化剂而加以利用的一门技术
4. 促进剂及毒害剂的定义
从生长角度：营养物质一般可以说是促进剂
从产酸角度：能提高产酸率的都可以说是促进剂
注：对生长的毒害剂不一定是产酸的毒害剂。而且许多产酸促进剂正是菌体生长的毒害剂，作用包括抑制过度长菌、调节代谢和改变细胞结构等方面。
5. 生理酸性氮和生理碱性氮定义
植物根系从溶液中选择性的吸收离子后使溶液酸度/碱度增加的盐类。
生理酸性氮：(NH4)2SO4、 (NH4)3PO4、(NH4)2HPO4、 NH4Cl 、 (NH4)2CO3等，调节代谢，控制pH
生理碱性氮:NaNO3、KNO3、LiNO3、Ca(NO3)2、Mg(NO3)2等
6. 生物量定义
广义的生物量是生物在某一特定时刻单位空间的个体数、重量或其含能量 。狭义的生物量仅指以重量表示的，可以是鲜重或干重。
7. 发酵工程分为哪三个部分？
上游工程——获得发酵产品的条件
发酵工程——微生物反应过程
下游工程——后处理/提取纯化过程
8. “双酶法”制取水解糖采用哪两种酶联合作用：淀粉酶、糖化酶
9. 乙醛酸循环与醋酸发酵柠檬酸途径
10. 柠檬酸发酵的产率
（1）无CO2固定反应的产率
合成1分子柠檬酸需要3分子乙酰辅酶A ，也就是需要1.5分子的葡萄糖。理论产率为：192 /( 180×1.5) = 71.1%
（2）通过CO2固定反应提供四碳二羧酸
葡萄糖生成柠檬酸的全过程中，在碳平衡方面没有碳原子的损失，在乙酰CoA 和草酰乙酸缩合时还从水中引进一个氧原子，总反应式为： C6H12O6+1.5O2→C6H8O7+2H20
可见柠檬酸发酵对糖的理论转化率为106.7%，以含一个结晶水的柠檬酸计为116.7%。
11. 黑曲霉柠檬酸高产菌的生理特征有哪些？
（1）能耐高浓度的柠檬酸（15%以上），而不利用和分解柠檬酸。
（2）耐高浓度葡萄糖，能产生和分泌大量的酸性α-淀粉酶和酸性糖化酶
（3）能抗微量金属离子，尤其能抗较高浓度的Mn2+、Zn2+、Cu2+。
（4）在液体深层液体发酵培养时，能形成大量的细小菌球体，球体直径为0.1mm ，菌球量达104个/ml以上
（5）在以葡萄糖为唯一碳源的合成培养基上生长不好，生成小菌落，孢子形成能力弱。
（6）在生长、繁殖期，细胞内具有较高水平的氨基酸、NH4+，即NH4+库水平高
（7）菌丝体中含有低水平的甘油三酯和磷酸酯。
（8）在生长期和产酸期，细胞内蛋白质核酸水平低。
（9）具有很强的侧系呼吸链活性，此侧系呼吸链不产生ATP 。
12. 我国柠檬酸发酵生产常用菌种及特点
常用的是黑曲霉。特点见上。
13. 柠檬酸发酵主要原料类型
（1）淀粉质原料；（2）粗制糖类；（3）制糖工业副产品；（4）含正烷烃较多的石油馏分；
（5）副原料以及各种产酸促进剂。
14. 柠檬酸发酵属好氧发酵，其三种主要发酵方式及概念
三种方式：表面发酵、固体发酵、深层发酵。其中表面发酵、固体发酵利用气相氧，深层发酵利用的是溶解氧。
（1）表面发酵：利用生长在液体培养基表面的微生物的代谢作用，将可发酵性原料转化为柠檬酸的。这种工艺出现最早。
（2）固体发酵：是将发酵原料及菌体被吸附在疏松的固体支持物上，经过微生物的代谢活动，将原料中的可发酵成分转化为柠檬酸
（3）深层发酵：是指在发酵过程中从发酵底部通入无菌空气并搅拌，使空气与发酵液的接触面积极大提高。从而大幅度提高氧气含量。
15. 黑曲霉柠檬酸生物合成途径
黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是：葡萄糖经EMP 、HMP 途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA ，另一方面经CO 2固定化反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰CoA 缩合生成柠檬酸。
(1)生长期与产酸期都存在EMP 与HMP 途径，前者EMP:HMP=2:1，后者EMP:HMP=4：1
(2)黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA
循环与乙醛酸循环，在以糖质原料发酵时，当柠檬酸积
累时，TCA 和乙醛酸循环被阻断或减弱。
(3)由于TCA 和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是由丙酮酸（PYR ）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP ）羧化生成的。即由两个CO 2固定化反应体系，其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化CO 2生成草酰乙酸为主。
16. 柠檬酸生物合成的代谢调节机制
（1）糖酵解及丙酮酸代谢的调节；
（2）三羧酸循环的调节；
（3）氧对柠檬酸积累的调节；
17. 柠檬酸发酵过程的控制要点
（1） 控制Mn 、NH 4浓度，解除柠檬酸对PFK 的抑制，使EMP 畅通无阻。
（2） 控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。
2+（3） 控制培养基中的Fe 的浓度，使顺乌头酸水合酶失活。 2++
18. 柠檬酸发酵过程中Mn 2+缺乏为何会使NH 4+浓度升高呢？
当培养基中Mn 缺乏时，微生物体内积累几种氨基酸（GA 、GLu 、Arg 等），这些氨基酸的积累，意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受到影响，这样++NH 4的消耗下降，NH 4浓度就会升高。 2+
19. 柠檬酸发酵液提取之前进行预处理方法及作用
方法：热处理，75～90℃，时间宜短不宜长。
作用：
（1）杀灭柠檬酸产生菌和杂菌，终止发酵，防止柠檬酸被代谢分解
（2）使蛋白质变性而絮凝，破坏胶体，降低料液黏度，利于过滤；
（3）可使菌体中柠檬酸部分释放出来。
20. 柠檬酸提取中草酸的影响：在热的中和液中，草酸钙可以在pH3以下沉淀析出，从
而可以先分离出来。草酸钙的颗粒很细，易堵塞过滤介质孔道，从而影响滤速和洗糖。
21. 柠檬酸提取中除草酸的方法
有机杂酸主要是草酸和葡萄糖酸，都能形成钙盐。前者溶解度很低，故可在中和前除去，后者溶解度很高，中和之后绝大部分在废水中排除。利用草酸钙溶解度低于硫酸钙溶解度，在一次滤液中加硫酸钙，使其生成草酸钙，在一次滤液复滤时，一并除去。
（加热发酵液至70~75℃，不断搅拌下添加石灰乳（深度为120g/L），调至pH2.7~2.9，但不得超过3.0，否则柠檬酸钙也可能析出。这里，草酸以钙盐形式沉淀下来，经15~20min后过滤，滤液以11% CaCl2水溶液定性检验草酸是否沉淀完全，如不完全则应再加石灰乳，按前法操作）
22. 柠檬酸提取工艺中，萃取法提取柠檬酸时可选用萃取剂的类型：
单一组分的萃取剂：乙醇、丁醇、N-烷基酰胺等
混合萃取剂：有机胺与烃、乙醇的混合物
23. 萃取法提取柠檬酸时对萃取剂的要求
（1）对柠檬酸有较强的溶解能力，选择性强，不溶解还原糖、蛋白质等发酵液中的杂志
（2）在水中溶解度低，对柠檬酸来说具有较高的分配系数
（3）物理化学性质稳定，不与发酵液中有关物质反应，操作中无乳化作用
（4）易于柠檬酸分离，不残留在柠檬酸晶体内，在操作过程中损耗小，易于回收；
（5）价格低廉，来源方便，对人体无毒害。
24. 柠檬酸钙盐在水中的溶解度性质
柠檬酸钙盐在水中的溶解度较小，并且随温度升高进一步降低。 如果温度升高至95~100℃，Ca （C 6H 5O 7）.4H 2O 的溶解度可进一步降低为0.578g/L水。钙盐提取法就是利用这种性质。 将溶液加热至沸，使柠檬酸钙盐比较完全沉淀析出，而其它有机酸钙（葡萄糖酸钙、草酸钙）等物质溶解。在溶液中含有PO 43-和过量Ca 2+时，可促进钙盐沉淀。
柠檬酸钙的溶解度也与酸度有关，pH 值降低时溶解度增大。
25. 柠檬酸钙盐法提取工艺流程
我国柠檬酸提取采用钙盐法：发酵液经加热处理后，滤去菌体残渣，在中和桶中加入CaCO 3或石灰乳，使柠檬酸以钙盐形式沉淀下来，废糖水和可溶性杂质则过滤除去，柠檬酸钙在酸解槽中加入H 2SO 4酸解，使柠檬酸游离出来，形成硫酸钙被滤除，作为副产物使用。 这时得到的粗柠檬酸溶液通过脱色和离交净化，除色素、胶体、无机离子等杂质，然后浓缩、结晶、干燥即可包装出厂。
26. 柠檬酸提取中，酸解操作终点测定的方法(双管清法)
取酸解清滤液2ml, 加18ml95%乙醇，摇匀后过滤。取2支小试管，每支中加入滤液5ml ，一支中加入5滴20g/dL氯化钙液，另一支加20%的硫酸，并在90℃以上的热水浴中加热。如两管都清，则表明已到终点。若加硫酸的管混浊，说明仍需往酸解桶中加硫酸；同样若加氯化钙的管混浊，则需往酸解桶中加钙盐。其原理是利用酸解液中过量的Ca2+或SO42-与试剂中的SO42-或Ca2+生成CaSO4沉淀的特性。加95%的酒精是为了去除酸解液中的水溶性蛋白，另外，硫酸钙在酒精中的溶解度比水中更小，更易析出。加热是利用硫酸钙的溶解度随温度上升而下降的特性，使沉淀现象更明显。
27. 柠檬酸钙酸解时的净化操作步骤的方法
（1）脱色 ：活性炭脱色（2）除SO 42-：钡盐沉淀除法 （3）除Fe 3+、Ni 3+：亚铁氰化钙沉淀法（生成普鲁士蓝沉淀）（4）除Pb 2+、As 3+：硫化物沉淀法
28. 柠檬酸表面发酵过程中，影响发酵产酸的因素有哪些？
培养液层厚度，糖浓度，温度，pH ，通气，不正常的发酵处理。
29. 表面发酵的主要设备
发酵盘、发酵室、通风系统、发酵室灭菌
30. 柠檬酸深层液体发酵终点控制条件
当通风搅拌培养50～72h ，柠檬酸产酸达100～150g/L，柠檬酸产量不再上升，残糖降至2g/L以下，可升温终止发酵，泵送至储罐中，及时进行提取。
31. 浓缩的定义及柠檬酸溶液浓缩时的温度操作
柠檬酸水溶液在沸腾状态下使其水分迅速蒸发，以提高溶液中酸的浓度，这一物理过程称为浓缩。
温度操作要求：开始温度不超过70℃，当溶液浓缩至35%以上，，酸度增高时，温度不超过60℃.
32. 柠檬酸浓缩操作的主要设备：蒸发器，冷凝器，真空发生系统。
33. 结晶：是固体物质以晶体状态从蒸汽、溶液或熔融物中析出的过程。
34. 柠檬酸结晶时，温度低于36℃形成一水柠檬酸，超过36℃形成无水柠檬酸
35. 结晶操作中起晶方式有哪三种及各自的定义
(1)
自然起晶：降温或浓缩使溶液的过饱和度增大到不稳定区时，溶液中即可以自发产
生晶核，称为“自然起晶”。
(2)刺激起晶：将溶液用蒸发浓缩的方法排除部分溶剂，使溶液浓度进入过饱和不稳定区，然后将溶液放出，使溶液受到突然冷却，进入不稳定区，而自然自行结晶生成晶核。添加晶种起晶：溶液在介稳状态时，认为加入一定数量和粒度的晶体粉末，称为“添加晶种起晶”。
(3)添加晶种起晶:将溶液浓缩到介稳定区的饱和浓度后，加入一定大小和数量的晶种，同时均匀搅拌，使晶体长大。
36. 影响结晶速度的因素
（1）过饱和度（2）晶粒表面积（3）温度（4）境界膜厚度（5）粘度
37. 初级晶核和次级晶核的定义
初级晶核：首批形成的晶核或加入的晶种都称为“初级晶核” 次级晶核：后面不论何时形成的晶核都称为“次级晶核”。
38. 一次母液和二次母液定义
母液：第一次分离柠檬酸结晶后的母液称为一次母液，由一次母液继续浓缩结晶，分离出结晶后的母液称为二次母液。
39. 饱和溶液和过饱和溶液的定义
饱和溶液，指的是在一定温度下，一定剂量的溶剂里面，不能继续溶解溶质，即浓度不变的溶液
过饱和溶液：一定温度、压力下，当溶液中溶质的浓度已超过该温度、压力下溶质的溶解度，而溶质仍不析出的现象叫过饱和现象，此时的溶液称为过饱和溶液。
40. 介稳区还可以分为哪两个区域：刺激起晶区和育晶区
41. 境界膜的定义
结晶时，紧靠晶粒区域a=1，即浓度=饱和浓度C1，如维持母液的浓度为C(C＞C1), 则在晶粒周围形成了一层具有一定浓度梯度的液膜，称为境界膜。
42. 干燥过程两个阶段及干燥速度的有关因素
(1) 使水分蒸发；(2)除去气化后的水分
影响因素：
（1）温度：温度越高，干燥越快。一水柠檬酸干燥时不超过36℃，无水柠檬酸一般40℃以上
（2）空气流的湿含量：湿度越低，干燥越快
（3）干燥介质与物料的混合程度：混合程度越高，干燥速度越快
（4）干燥介质流速：气流速度增加，干燥速度加快。
43. 影响柠檬酸中和操作的主要原因有哪些？
（1）滤液的质量；（2）pH 的控制；（3）中和温度；（4）其它阳离子的影响；（5）中和剂质量的影响；（6）搅拌器的作用
44. 柠檬酸工业副产物主要有哪些？
黑曲霉菌体、中和滤液（废糖液）、石膏渣、钙盐洗水、离交柱洗水等。
45. 柠檬酸发酵过程中常见染菌类型:细菌、酵母菌、霉菌
46. 有机酸发酵工业中，发酵过程杂菌污染的危害有哪些？
（1）杂菌分泌的代谢物抑制生产菌的生长代谢和产物合成 ，这称为生产菌的拮抗菌
（2）杂菌消耗了大量糖及其他营养物，大量繁殖菌体和生成非预期产物，降低产率
（3）杂菌的分泌物使柠檬酸提取和精制困难
（4）杂菌寄生于生产菌的菌体内致死寄主
47. 杂菌污染防治措施
（1）始终严格贯彻无菌操作制度
（2）加强环境卫生管理，发酵车间和菌种室内外环境，要保持整洁，定期清扫和消毒
（3）重视设备，保持高的设备完好率，发酵工业由于设备系统引起染菌的概率较高，要定期检查管、阀、法兰、轴封等
（4）保证无菌空气质量，定期检查空气过滤器的过滤效果，要注意突然停电时的保压工作
（5）严格保证菌种质量，各级菌种必须严格无菌检查和摇瓶验证后才能供生产使用
48. 自然选育与诱变选育概念和主要步骤
自然选育：在生产过程中，不经人工处理，利用菌种自身的突变或直接从自然界中分离筛选的过程。
诱变选育：通过诱变剂处理来提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出具有优良性状的突变株。
主要步骤：
49. 种子定义及质量要求
将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养, 最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。
质量要求：
（1）镜检：菌丝粗壮，结成菊花状小球体，无异味，无杂菌；
（2）pH ：2.0-2.5;
（3）酸度：0.5-2.0%；
（4）柠檬酸含量：0.5g/dl
50. 种子扩培的定义及两个阶段
种子扩培：指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养, 最终获得一定数量和质量的纯种过程
实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此将其称为实验室阶段的种子培养。孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月
生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工厂归发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。
51. 菌种纯化主要方法有哪三种？
平板划线分离、平板稀释分离和小滴分离纯化培养
52. 菌种保藏的目的：使菌种保持活力，同时还要保持其优良的生产状态。
53. 菌种保藏的方法：斜面低温保藏法、载体吸附保藏法、真空冷冻干燥保藏法液氮超低温（-196℃）保藏法
54. 菌种衰退定义及原因
菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。
原因：（1）环境条件：如培养基成分不适，温度过高； （2）移植菌株间歇时间过长，分离复壮时间间歇过长； （3）分离复壮效果差或杂菌污染； （4）连续传代次数过多或菌种有关基因发生自然突变或者恢复突变。
55. 乳酸发酵根据生成产物的不同主要分为哪两种类型及各自转化率：
（1） 同型乳酸发酵：1mol 葡萄糖生成2mol 乳酸，理论转化率为100%。一般认为转化率
在80%以上即视为同型乳酸发酵。
（2） 异型乳酸发酵：1mol 己糖生成1mol 乙酸、1mol 二氧化碳和1mol 乳酸. 乳酸对糖的
转化率为50%
（3） 双岐发酵途径：50%
56. 乳酸发酵微生物及各自发酵特点
（1）细菌：
德氏乳杆菌：发酵产生D-乳酸，少数菌株产生DL-乳酸。不加中和剂时，最高生成乳酸浓度可达16g/L。最适生长温度为45℃，最高耐受温度为55℃
赖氏乳杆菌：不加中和剂时，在发酵液中可产生13g/L的D-乳酸。最适生长温度为36℃ 植物乳杆菌：在己糖发酵中产DL-乳酸及少量乙醇和CO 2。发酵戊糖产醋酸和乳酸，不中和时产酸量达12 g/L.最适生长温度30℃，最高40℃。
（2）米根霉：可利用无机氮源，发酵产L-乳酸，最适温度为30℃。
57. 乳酸钙晶体的形状: 乳酸钙为白色或近似白色结晶颗粒或粉状，无味或基本上无味，微有风化性易固化成珊瑚状。
58. 乳酸发酵结束，乳酸提取工艺中的乳酸钙前结晶工艺流程及操作要点 工艺流程：
操作要点：
① 乳酸钙浓缩液浓度，即乳酸钙结晶起始浓度，应控制在26%~28%范围内，必须趁热放出。 ② 乳酸钙分子在水溶液中呈水合状态，其溶解度随溶液中含的杂质增加而增加。所以浓缩
前必须脱色。
③ 乳酸钙起晶温度以30℃为好。最终结晶温度应不高于10℃。
④ 酸解中要严格控制乳酸的浓度。为了获得大颗粒石膏结晶，便于过滤操作，必须严格控
制如下工艺条件： A. 溶液中石膏的过饱和系数为1.3~1.4； B. 乳酸浓度不超过22%； C. 温度控制在80℃左右；D. 硫酸过量0.5%以下； E. 石膏晶体成熟时间为1h 。
59. 国内乳酸钙的精制工艺：（吸附、重结晶、离子交换、萃取、蒸馏、过滤、离心等）
前结晶工艺、直接酸解工艺、锌结晶工艺、溶剂萃取法、离子交换法
60. 葡糖糖酸发酵主要菌种：黑曲霉、醋酸菌
61. 葡萄糖酸盐的制备方法：生物发酵法、均相化学氧化法、电解氧化法、多相催化氧
化法
62. 果醋、白醋、陈醋的定义
果醋：是以水果或果品加工下脚料为主要原料，利用现代生物技术酿制而成的一种营养丰富、风味优良的酸味调味品。
白醋：以蒸馏过的酒发酵制成，或直接用食品级别的醋酸兑制。可用作烹调的酸味辅料 陈醋：酿成后存放较久的醋，先加入多量酒曲，采用低温酒精进行发酵，然后再拌入谷糠麸皮经醋酸发酵
63. 山西老陈醋酿造中，夏日晒和冬捞冰的概念：是指冬天捞出醋中的冰, 夏日暴晒
蒸发醋中的水分, 以提高醋的品质
64. 我国目前的几种食醋发酵工艺：固态发酵，液态发酵，固液发酵
65. 食醋发酵工艺原料（按工艺要求分）主料、辅料、填充料、添加剂。
固态发酵：
原料：粮食 辅料：麸皮 填充料：谷糠，稻壳 糖化剂：麸曲，大曲，小曲
液态发酵：淀粉
66. 食醋发酵工艺分哪三阶段组成，其中我国的双边发酵工艺特点
淀粉糖化过程、酒精发酵、醋酸发酵
固态双边发酵特点是采用比较低的温度，让糖化和酒精同时进行，即采用边糖化边发酵工艺。
67. 醋酸菌按其氧化能力差别可分为哪四大群？
过氧化菌，氧化菌，中氧化菌，弱氧化菌
68. 我国食醋酿造中应用最广的糖化剂：麸曲
69. 酒精发酵过程中，酒母制备的四个主要质量指标
（1）酵母细胞数：繁殖能力指标，一亿/ml；
（2）出芽率：繁殖旺盛指标，15-30%；
（3）酵母死亡率：
（4） 酸度：污染指标，
70. 醋酸提取工艺中，采用高沸点溶剂萃取的萃取剂一般是：磷酸三丁酯、三辛基
氧磷
71. 醋酸的常用提取工艺：分馏、恒沸蒸馏、溶剂萃取、联合提取
72. 苹果酸的生产方法：提取法、化学合成法、一步发酵法、两步发酵法、固定化酶或细
胞转化法
73. 苹果酸发酵中，培养基添加CaCO 3的作用：养基中碳酸钙的存在是苹果酸有效积
累的必要条件, 碳酸钙的作用一是作为中和剂中和代谢生成的苹果酸形成苹果酸钙, 维持相对稳定的pH 值, 保证发酵的正常进行, 二是形成的苹果酸与碳酸钙反应放出CO 2, 为CO 2固定支路提供CO 2, 促进苹果酸的积累
74. 衣康酸发酵工艺生产常用微生物：衣康酸曲霉、土曲霉
75. 衣康酸发酵菌种的选育通常传统的菌种筛选步骤：
（1）形态筛选法
（2）高酸、高渗透压平板筛选法
（3）摇瓶初筛
（4）摇瓶复筛
76. 衣康酸发酵菌种诱变时的四种筛选方法
（1）形态筛选法；（2）指示剂显色法；（3）“浓缩”过滤筛选法；（4）标记筛选法。
77. 影响衣康酸发酵的几个重要因素
（1） 蔗糖为原料：发酵条件（温度、pH 、接种量、通气与搅拌、菌体生长量），发酵培
养基组成（蔗糖浓度、氮源、镁盐、磷酸盐，其他盐类、消泡剂）
（2） 淀粉为原料：发酵原料、温度、pH 、溶解氧