1. 前言
酸性蛋白酶是一类最适pH 值为2.5〜5.0的天冬氨酸蛋白酶，相对分子质量为30000 〜40000。酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和微生物分泌物, 包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根据其产生菌的不同，微生物酸性蛋白酶可分为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶. 根据作用方式可分为两类：一类是与胃蛋白酶相似，主要产酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛霉和栗疫霉等。 细菌中尚未发现产酸性蛋白酶的菌株. 由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。
国外关于酸性蛋白酶的生产研究从20世纪初就开始了。1908年，德国科学家从动物的胰脏中提取出胰蛋白酶，并将其用于皮革的鞣质。1911年美国科学家从木瓜中提取木瓜蛋白酶（在酸性，碱性和中性的条件下都能分解蛋白质的酶）并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白质浑浊物。自1954年吉田首次发现黑曲霉可产生酸性蛋白酶以来，国内外对微生物发酵生产酸性蛋白酶进行了广泛的研究。1964年外国科学家首次发现大孢子黑曲霉突变体能产生两种不同的酸性蛋白酶，即酸性蛋白酶和酸性蛋白酶。1965年又从血红色陀螺孔菌，中分离出了一种酸性蛋白酶，并对该酶进行了纯化和结晶。1968年从微小毛霉中筛选出了一种酸性蛋白酶，并对其进行了纯化和酶学性质分析。1995年外国科学家对烟曲霉酸性蛋白酶的基因进行了克隆和测序。2001年又从假丝酵母中筛选出了一种酸性蛋白酶菌株，并对该酶进行了核苷酸序列分析和功能分析。国外学者对曲霉酸性蛋白酶的结构和功能等己经研究的较为透彻。
与国外相比，我国对酸性蛋白酶的研究相对较晚些。1970年上海工业微生物研究所首先从黑曲霉中筛选出一株产酸性蛋白酶菌株，并和上海酒精厂协作进行中试生产，填补了我国酸性蛋白酶制剂的空白. 近年来国内在酸性蛋白酶上的研究大都致力于选育产酶活力高、抗逆性好的菌种，并获得了一些很有应用前途的产酶菌株。目前用于酸性蛋白酶生产的高产菌株主要有黑曲霉、宇佐美曲霉和青霉及它们的突变株。李永泉等，对宇佐美曲霉所产的酸性蛋白酶进行了发酵过程动力学研究. 戚淑威等对青霉产酸性蛋白酶的适宜条件和酶学性质进行了分析。谢必峰等，采用硫酸铵盐析法和离子交换层析法分离纯化了黑曲霉产酸性蛋
白酶，并对其氨基酸组分进行了分析。2008年王云等，通过质谱指纹法对黑曲霉发酵液中所产蛋白进行了分析比对和鉴定酸性蛋白酶分子生物学方面的研究，国内仅仅集中于凝乳酶和胃蛋白酶方面，有关真菌酸性蛋白酶的分子生物学研究报道很少
摘要：本课题设计是利用黑曲霉（Aspergillus niger ）3.350制备酸性蛋白酶，主要从菌种的选育，培养基的配置，灭菌，种子扩大培养，和发酵罐的设计，发酵车间的物料衡算，发酵过程的工艺控制，下游加工十点进行。阐述了1000吨饲用酸性蛋白酶的制取工艺。其中对发酵罐做了创新性设计。
2. 菌种的选育
2.1 菌种的制备
不管在过去、现在和将来，微生物是各种生物活性产物的丰富资源。在发酵前期，微生物的选择至关重要，此课题设计的是利用黑曲霉发酵生产酸性蛋白酶的整体过程。
选择性分离的一般步骤如下：
含微生物材料的选择——材料的预处理——所需菌种的分离——菌种的培养——菌种初筛——菌种复筛——性能鉴定——菌种保藏。
本实验选用黑曲霉作为菌种，发酵生产酸性蛋白酶，该霉菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为3．350。
而黑曲霉（Aspergillus niger ）生产酸性蛋白酶的工艺流程为：
原始菌株→分离纯化→紫外线诱变→选育菌株分离纯化→亚硝
基胍诱变→选育菌株分离纯化→选育菌株生产工艺优化→传代试验→选育菌株→斜面菌种→三角瓶菌种→浅盘菌种_________________
↓
主原料→混料（水、无机氮、无机盐）→蒸料→冷却→接种→发酵→稳定化处理→干燥→粉碎→包装→检测→成品
↓
粗酶→抽提→过滤→盐析→沉淀→干燥粉碎→包装→检测→成品
2.2 菌种的保藏
菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产工业，更离不开菌种。所以，菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分，其任务是使菌种不死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。
菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状态、干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。常用的菌种保藏方法有：斜面冰箱保藏法、沙土管保藏法、菌丝速冻法、石蜡油封
存法、真空冷冻干燥保藏法和液氮超低温保藏法。
此课题中黑曲霉采用真空冷冻干燥保藏法，预冻：本实验采用-80 ℃预冻2h 后进行干燥。干燥过程：第一阶段干燥．样品温度分别控制在-15 ℃ 14 h，10 ℃ 10 h，真空度为150 Pa，直到样品的水分升华除去90%；第二阶段干燥。升高板层温度至20℃，迅速蒸发样品中的残余水分。该过程大约需要10h 。将冻干菌存放于0℃冰箱中备用.
3．培养基的配制
培养基的类型很多，可以根据组成、状态和用途等进行分类，按照用途可以分成孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。微生物大规模发酵设计主要用到孢子、种子和发酵培养基这三种类型。
3.1活化培养基
黑曲霉的活化培养基的配制如下：斜面培养基：蔗糖 30g ，NaNO 3 3 g，MgSO 4 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO 4 0.01 g，K 2HPO 4 1 g，琼脂20 g，将上述各组分溶于1000 mL 水中，121 ℃灭菌20 min，备用。
3.2 种子培养基
种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长的粗壮成为活力强的种子。对于种子培养基的营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也比较高些，浓度以稀薄为好，可以达到较高的溶解氧，供大量菌体生长和繁殖。
黑曲霉的种子培养基为麦芽汁培养基。
3.3 发酵培养基
发酵培养基的要求是营养要适当丰富和完全适合于菌种的生理特性和要求，使菌种迅速生长、健壮，能在比较短的周期内充分发挥产生菌合成发酵产物的能
力，但要注意成本和能耗。
黑曲霉3．350发酵培养基的配方：豆饼粉 3.75％, 玉米粉0.625％，鱼粉 0.625％，氯化铵 1.0％，氯化钙 0.5％，磷酸二氢钠0.2％，豆饼石灰水解液10％，pH 5.5。
3.4 补料培养基
黑曲霉3．350发酵培养基的配方：豆饼粉 37.5％, 玉米粉0.625％，鱼粉 0.625％，氯化铵 1.0％，氯化钙 0.5％，磷酸二氢钠0.2％，豆饼石灰水解液10％，pH 5.5。主要加大豆饼粉的量，起补充碳源，氮源和生长因子之用。
4 .灭菌
生物化学反应过程中，特别是细胞培养过程中，往往要求在没有杂菌污染的情况下进行，这是由于生物反应系统中通常含有比较丰富的营养物质，因而很容易受到杂菌的污染，进而产生各种不良的后果：
（1）由于杂菌的污染，使生物化学反应的基质或产物消耗，造成产率下降；
（2）由于杂菌所产生的某些代谢产物，或污染后发酵液的某些理化性质的改变，使产物的提取变得困难，造成收得率降低或使产品质量下降；
（3）污染的杂菌可能会分解产物而使生产失败；
（4）污染的杂菌大量繁殖，会改变反应介质的pH ，从而使生物化学反应发生异常变化；
（5）发生噬菌体污染，微生物细胞被破裂而使生产失败等。
4.1 灭菌方法
所谓灭菌，就是指用物理或化学杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。常用的灭菌方法有：化学灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和过滤灭菌等。本设计采用湿热灭菌。
4.2 培养基的连续灭菌
图4-1 连续灭菌的流程图
培养基连续灭菌为在短时间内被加热到灭菌温度（130℃~140℃），短时间内保温（一般为5~8min）, 升降温时间相对较短，可以实现自动控制、提高发酵罐的设备利用率，蒸汽用量平稳等优点，培养基在短时间内被加热到灭菌温度，短时间保温后快速冷却，再进入早已灭完菌的发酵罐，这样不但可以节省时间，更重要的是减少了培养基的破坏率。对补料培养基的灭菌方法跟发酵培养基的灭菌方法一样都是湿热灭菌，其加热蒸汽压力要求较高，一般不小于0.45MPa 。连续灭菌流程如上图。
影响灭菌效果的因素有：微生物的种类和数量；培养基的性质、浓度、成分；灭菌的温度和时间。
灭菌原理：对数残留定律（对培养基进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比）。
4.3 空气灭菌
此课题以空气为氧源。根据国家药品质量管理规范的要求，生物制品、药品的生产场地业需要符合空气洁净度的要求。获得无菌空气的方法有：辐射灭菌、化学灭菌、加热灭菌、静电除菌、过滤介质除菌等。
过滤介质除菌是目前发酵工业中空气除菌的主要手段，常用的过滤介质有棉花、活性炭或玻璃纤维、有机合成纤维、有机和无机烧结材料等。
4.3.1 过滤除菌流程及设备
过滤除菌流程图如图4-1所示：
1-粗过滤器；2-压缩机；3-贮罐；4，6-冷却器；5-旋风分离器；7-丝网除沫器；8-加热器；
9-空气过滤器
图4-1 空气除菌设备流程图
4.3.2 无菌空气的检查
无菌检查方法有肉汤培养法、斜面培养法和双碟培养法。这里采用斜面培养法进行无菌空气的检查，具体方法为：500ml 三角瓶内装斜面培养基50ml ，接种后置旋转式摇床上，30℃下培养24h 后观察有无菌落形成。
4.4 发酵罐的灭菌
发酵罐的灭菌可采用空罐灭菌，此处采用空罐灭菌。空罐灭菌是将所有的通气口都稍微打开，然后通入水蒸汽，让水蒸汽尽量通过每一个菌落达到灭菌效果。具体方法是：在121℃灭菌80分钟。
5．种子扩大培养
本发酵属于一级种子罐扩大培养，二级发酵。设计流程图如图5-1：
图5-1 种子扩大培养流程图
5.1 种子制备
将菌种接种于活化斜面培养基培养, 30℃活化24h 。活化后的菌种用生理盐水洗下，转接于摇瓶种子培养基, 接种量5%~6%，30℃培养12h 。经摇瓶培养后的种子，以接种量5%接种于种子罐，30℃培养12h ，菌种浓度达到108~109个/mL。
5.2 发酵罐培养
将扩大培养后的菌种以5%的接种量接入发酵罐中，发酵温度控制在30℃，罐压0.5㎏/cm2，发酵过程中通过流加Na0H 溶液控制发酵液pH 。根据菌体浓度、pH 决定具体发酵时间为35.5h 。发酵过程中采用自动搅拌器，将转速控制在100r/min，使流加碱液与发酵液快速混合均匀。
6．发酵罐的设计
广东省微生物研究所通过改变摇瓶装液量和转速来考察溶氧对黑曲霉菌种的影响。实验结果表明：在250ml 的三角瓶中装液量为100ml ，转速150r/min酶活最高，装液量过多或过少，产酶量较低。摇床转速较低时，通气量不够，生长较慢，产酶量也低。当摇床转速过快时，产酶量也不高，可能是菌丝断裂过度。培养基中的营养主要被菌体用于自身的生长。
此课程设计中选择使用机械搅拌式通风发酵罐。机械搅拌通风发酵罐是发酵工厂最常用类型。它是利用机械搅拌器的作用，使空气和发酵液充分混合，促使氧在发酵液中溶解，以保证供给微生物生长繁殖、发酵所需要的氧气。
6.1 发酵罐的结构
机械搅拌式通风发酵罐的主要组成部件有：罐体、搅拌器、轴封、消泡器、联轴器、中间轴承、空气吹泡管(或空气喷射器) 、挡板、冷却装置、人孔以及管路等。
6.2 发酵罐罐体的几何尺寸计算
1. 发酵罐普遍H 0/D=1.97，而酸性蛋白酶对空气有一定要求，为了使之更大面积的接受氧气，黑曲霉所用发酵罐设计为矮胖形，即：H 0/D=1.63，从通风角度讲，空压机为无油润滑一级压缩, 出口压力0.3MPa 。压缩空气经过约60m 米以上路程才送到发酵车间, 管道阻力加上空气过滤器阻力, 空气压降厉害, 若大型发酵罐再设计成瘦高形, 势必会增加液柱高度, 直接影响到进罐通风管口空气的压头和流速, 若空压机房贮气筒压头稍有波动产生下降, 发酵罐进风口风速无喷力, 对供气量及溶氧带来不利影响。所以大型发酵罐设计成矮胖形可降低液柱高度, 有利通风溶氧。
2. 发酵罐上下封头采用十二块西瓜片拼装而成, 顶部中心太阳板直径Φ1800，在现场施工拼装，解决了封头整体成形无法运输的困难。
3. 传动部采用卧式电动机通过联轴节带动大型减速箱直接带动搅拌轴, 就是减速箱内设一对弧形伞齿轮使进轴作90°变向用联轴节通过十二根尼龙销棒联接卧式电动机。既降低了设备安装高度, 又给安装维修带来了很大方便, 如图：
图6-1 传动部卧式电动机联轴图
四台发酵罐采用二种减速箱, 前二台罐为迸口减速箱, 减速箱内装有一对直齿轮和一对弧形伞齿轮, 结构简单, 维修方便, 一般只有伞齿轮及进轴、轴承损坏要维修更新。后二台罐采用国产福州发电设备厂生产的行星齿轮箱, 箱内加设一对弧形伞齿轮使进轴作90°变向, 由联轴节与卧式电动机相联。与进口减速箱
比, 结构复杂、行星轮坏很难修理。
4. 减速箱下传动架上传动轴设计安放一部轴承座, 内装中型普通轴承一粒, 轻型平面受力轴承一粒，轴承上端轴头由夹壳联轴节与减速箱出轴联接。设计少放一部轴承降低传动架约米的高度, 增强了减速箱及电机在罐顶上的稳定性。罐内设计放二部轴瓦来定位罐内轴与上主轴的同心度, 上部轴瓦在盘管上方, 下部轴瓦安装在轴端。轴瓦、轴套材质均为铸铁。只要上下轴垂直同心度装得好, 轴瓦、轴套半年到一年更换一次。
5. 对发酵罐来讲, 冷却面积及冷却管的设计非常重要, 既要考虑排作形式, 又要起到最好冷却效果, 还要便于安装维修。设计中采取盘管式, 列管式同时采用的做法, 加设盘管组相对来讲好布置, 可利用盘管间之间隙当楼梯用, 给安装及今后维修带来很大方便。加设列管组可弥补全用盘管时需用冷却面积的管量放不下和盘管无档板作用的缺点。考虑罐径大, 放热量集中冷却效果一定要好, 所以又在冷却管的合理进出水上做文章, 采用快进快出的接管法, 就是把盘管列管分成多组, 使冷却水分成多路进多路出, 以水在冷却管内1.5米/秒停留1分钟来分组。与发酵液热交换后的热水汇集总管进热水池、再用泵送冷却塔, 冷却后的水进冷水池, 由泵供送发酵罐进水用。原则冷却塔循环水量要大于发酵用水量约倍, 保证热水通过冷却塔及时降温到气温夏天满足发酵冷却用水的需要, 如图
图6-2 发酵罐冷却管设计
6. 搅拌桨叶形式及档次直接影响到产酸及搅拌功率, 由于罐体矮胖形, 罐径大, ，设计采用大桨叶, 低转速。底道桨Φ1900，八弯叶, 中道桨小, 六弯叶, 转速65r.p.m 。所以, 采用高通风, 大桨叶, 低转速搅抖, 可降低搅拌功率, 同样达到高产酸的效果。桨叶叶片做成可装拆式, 部件拿进罐内后组装, 用不锈螺栓把叶片锁紧在园盘上, 给运输安装带来方便, 司时罐顶人孔可缩小, 开Φ600即可。
八万叶轮尺寸如下：
叶径d=0.365D=0.365×5200=1900mm， 盘径d=0.62d=0.62×1900=1175mm， 叶片高h=0.15d=0.15×1900=280mm， 叶片弧长L=0.4d=0.4×1900=760mm，
风管：罐压：0.02MPa ，罐温：35℃，培养基量：最大通风比1：0.38时120 m 3。
液柱高度：H=7.3米，风管出口压P=0.193MPa。
贮气筒压头P （供气最低压力）：空气输送管道阻力0.02MPa ，二级空气过滤器阻力0.04MPa 。故P=0.02+0.04+0.193=0.253MPa（绝对压力）
7. 进风管采用盘管式（管径根据通风量计算, 在盘管上放二付不锈法兰, 便于安装及今后清洗，盘管径等于低道桨径。盘管放在底道桨叶片下面, 盘管下方开三排小孔, ，二排成45°角，小孔径Φ4~6，交叉排列、这样有利于罐底部液体的搅拌和通风, 且不易被固体物堵塞, 孔数根据盘管内截面积计算, 小孔总面积镇盘管内截面积, 使风通过各个小孔时有产生喷力。
8. 罐体支座设计成由六根园柱脚支承整台罐体放在盆形的水泥墩上, 放料管从罐底中接出斜穿过水泥墩壁排水孔引接到打料泵送等电点提取。避免了裙座造成罐底难清洗, 死角多, 长杂菌、难消毒的缺点。整台罐底下通风好, 阳光照, 清洗消毒非常方便。
9. 利用下轴瓦座筒形架下部四孔封上2目不锈钢网来捕集罐内螺褚全、螺母等另部件的脱落回收, 给查罐时及时提供维修信息, 保证了放料阀、打料泵不易损
坏, 使用安全可靠性。
6.3 发酵罐壁厚
6.3.1 罐体壁厚
δ1=pD/(2σψ-p)+C （6-2） 式（6-2）中：p —耐受压强（取0.25MPa ）
ψ—焊缝系数，双面焊取0.8，无缝焊取1.0
σ—设计温度下的许用应力（不锈钢焊接压力容器许用应力为150℃,137 MPa）
C —腐蚀裕度，当 δ- C
解得罐体壁厚
δ1=pD/(2σψ-p)+C=0.25×1500/（2×137×0.8-0.25）+3=4. 7 mm 取整为δ1=5 mm 6.3.2 封头壁厚
δ2=pDy/(2σψ) +C （6-3） 式（6-3）中：p —耐受压强（取0.25MPa ）
y —开孔系数，取2.3
ψ—焊缝系数，双面焊取0.8，无缝焊取1.0
σ—设计温度下的许用应力（不锈钢焊接压力容器许用应力为150℃,137 MPa）
C —腐蚀裕度，当 δ- C
解得封头壁厚
δ2=pDy/(2σψ)+C=0.25×1500×2.3/（2×137×0.8）+3=6.9 mm 取整为δ2=7 mm
6.4 发酵罐个数的确定
已知年产量为1000吨，一年有300个工作日，黑曲霉发酵周期T=48h=2d，其中清理发酵罐1天，产量为50 g/L，罐压0.5㎏/㎝2。查相关资料有：酸性蛋白酶发酵周期48h ，清理及维修发酵罐时间为1天，则发酵总时间为3天，产量为50g/L,灭菌时间为5h ，发酵液预处理收率约为90 %，提取时的收率约为95%，浓缩干燥收率为90%，装料系数为60%
一年需放罐的次数：300÷3=100次 每批次产酸性蛋白酶1000/100=10吨 总提取率为：90 %×95%×90 %=76.95%
假设用一台发酵罐，则发酵罐的体积V=10×1000/76.95%/60%/50=433.2 m3 选发酵罐的公称体积为200 m 3，则需要发酵罐3个，则购置4台发酵罐，一台备用。
6.5 发酵罐附属结构的计算
6.5.1 搅拌器
搅拌桨叶形式及档次直接影响到产酸及搅拌功率, 由于罐体矮胖形, 罐径大, ，设计采用大桨叶, 低转速。底道桨Φ1900，八弯叶, 中道桨小, 六弯叶, 转速65r.p.m 。所以, 采用高通风, 大桨叶, 低转速搅抖, 可降低搅拌功率, 同样达到高产酸的效果。桨叶叶片做成可装拆式, 部件拿进罐内后组装, 用不锈螺栓把叶片锁紧在园盘上, 给运输安装带来方便, 司时罐顶人孔可缩小, 开Φ600即可。
八万叶轮尺寸如下：
叶径d=0.365D=0.365×5200=1900mm，
盘径d=0.62d=0.62×1900=1175mm， 叶片高h=0.15d=0.15×1900=280mm， 叶片弧长L=0.4d=0.4×1900=760mm，
风管：罐压：0.02MPa ，罐温：35℃，培养基量：最大通风比1：0.38时120 m 3。
液柱高度：H=7.3米，风管出口压P=0.193MPa。
贮气筒压头P （供气最低压力）：空气输送管道阻力0.02MPa ，二级空气过滤器阻力0.04MPa 。故P=0.02+0.04+0.193=0.253MPa（绝对压力）
6.5.2手孔、视镜、温度计和工艺接管
手孔：由《平盖手孔》(JB/T589-1979)或《板式平焊法兰手孔》(HG21529-1995)，选用光滑密封面的平盖手孔APNl ，DN250 JB/T589-1979。
视镜：由标准《压力容器视镜》(HG/T21619-21620-1986)或《组合式视镜》(HG21505-1992)，选用碳钢带颈视镜IPNl ，DN80(HG/T21619-21620-1986)。
温度计：加强套管温度计的选用可以参考生产厂家的产品目录，这里取公称长度1 430 mm，配凸面板式平焊管法兰PNO.6 MPa，DN65，HG20593--1997(《板式平焊钢制管法兰》) 。
工艺接管：(《钢制管法兰型式、参数(欧洲体系) 》) 。
进料管口采用Ф57×3.5无缝钢管，配法兰PNo.6，DN50，HG20592-1997出料管口采用Ф76×4无缝钢管，配法兰PNo.6，DN65，HG20592-1997 加热蒸汽进口管采用Ф38×3.5无缝钢管，配法兰PNO ．6，DN32，HG20592-1997
冷凝液出口管和压力表接管都选用Ф32×3.5无缝钢管，配法兰PNO.6, DN25, HG20592-1997
安全阀接管采用Ф45×3.5无缝钢管，配法兰PNO.6，DN40，HG20592-1997
6.6发酵设备一览表
通过设备的工艺设计计算，可列出淀粉酶生产的所有设备，如表4-1
表6-6 1000t/a酸性蛋白酶生产车间设备一览表
序号 1 2
设备名称 发酵罐 种子罐
台数 6 3
规格与型号
公称容积200m 3, φ5200mm 公称容积5m 3, φ1400mm
材料 A 3钢 A 3钢
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
种子罐分过滤器 发酵罐分过滤器
连消塔 维持罐 喷淋冷却器 螺旋板换热器 预处理罐 硅藻土过滤机 真空浓缩锅 盐析罐 板框压滤机 物料泵 清水泵 空气压缩机 空气贮罐 油水分离器 丝网分离器 热交换器
3 6 1 1 1 1 3 3 1 1 5 4 4 3 1 1 1
φ40mm φ300mm φ350×2600mm
A 3钢 A 3钢 A 3钢 A 3钢 A 3钢 A 3钢 A 3钢 A 3钢 A 3钢 A 3钢 A 3钢 机体铸铁 机体铸铁 A 3钢 A 3钢 A 3钢 A 3钢 A 3钢
V=4m3 F=171.9m2 F=20m2 V=100m WK500-A SZN —1200 V=50m XYJ800 GNF64×4 JL×20-36-G 4L-40/2-3.2 φ1300mm φ600mm φ120mm
33
4
JM220QF
7．发酵车间的物料衡算
7.1 工艺技术指标及基础数据
7.1.1 主要技术指标见表7-1
表7-1黑曲霉主要技术指标
指标名称 生产规模(G)
单位 t/a
指标数 1000
指标名称 产品纯度
单位 %
指标数 95
年生产天数(D) 产品质量(U) 倒罐率(η0) 发酵周期(T)
d/a IU/mg % d
300 50 2.0 3
接种量 发酵罐装料系数(η1) 放罐发酵单位(Um ) 提取总收率(η2)
% % IU/ml %
5 60 8000 77
7.1.2 培养基（g/L）
黑曲霉3．350发酵培养基的配方：豆饼粉 3.75％, 玉米粉0.625％, 鱼粉 0.625％ , 氯化铵 1.0％, 氯化钙 0.5％ , 磷酸二氢钠0.2％, 豆饼石灰水解液10％, pH 5.5.
菌种培养基的配置：查氏培养基NaNO3 2g，KHPO4 1g，KCl 0.5g ，MgSO4 5g ，FeSO4 0.01g，蔗糖 30g ，琼脂 15g ，水 1000ml ，pH 自然。
7.2 发酵车间的物料衡算
7.2.1 放罐成熟发酵液量
成熟发酵液放罐单位为U m =8000IU/mL，生产G=1000t酸性蛋白酶发酵液量为：
V 0=(G×U)/(Um ×η2×98%×95%) （7-1） 式（7-1）中：G —生产规模
U —产品质量
U m —放罐发酵单位
95%—产品的纯度
98%—除去倒罐率2%后的发酵成功率
7.2.2 放罐成熟发酵液量V 0分为三部分组成
底料 V 1=156960×84%=131846.4m3 种液量 V 2=156960×5%=7848m3 补料液 V 3=156960×11%=17265.6m3 7.2.3 培养基各组分耗用量
豆饼粉耗用量： m1=3.75％×156960=5886 玉米粉耗用量： m2=0.625％×156960=981, 鱼粉耗用量： m3=0.625％×156960=981
氯化铵耗用量： m4=1.0％×156960=1569.6 氯化钙耗用量： m5=0.5％×156960=7784.8 磷酸二氢钠耗用量： m6=0.2％×156960=313.92 豆饼石灰水解液耗用量：m7=10％×156960=15696 pH 5.5
7.3物料衡算表
表7-3 1000t/a黑曲霉发酵生产物料衡算表
物料名称
1000 t/a黑曲霉生产的物料量
5886 981 981 1569.6 7784.8 313.92 15696 据情况而定
每周期物料量
588.6 98.1 98.1 156.96 778.48 31.392 156.96 据情况而定
豆饼粉/㎏ 玉米粉/㎏ 鱼粉/㎏ 氯化铵/㎏ 氯化钙㎏ 磷酸二氢钠/㎏ 豆饼石灰水解液/㎏
HCI
7.4 简单的物料衡算
放罐发酵单位U m =8000IU/mL，折合成产量为50g/L，折合系数为k=1.6×105 IU/g。
本设计采用3个发酵罐，每个为200m 3，酸性蛋白酶的产量50g/L，提炼总收率为95%，装料系数为60%，浓缩干燥收率为90%，产品纯度为95%，则： 每个发酵罐在一个发酵周期中酸性蛋白酶的产量为： 200×50×95%×60%,90%×95%=4873.5㎏ 那么3个发酵罐一年的总产量为： （4873.5×300/3）×3=1462050㎏=1462.05t
在后期损耗合理的情况下，故符合年产1000t 的生产要求。
8．发酵过程的工艺控制
8.1 发酵过程的补料策略
中间补料是在发酵过程中补充某些营养物料、水或产酶促进剂，以满足微生物的代谢活动和产酶需要。由于黑曲霉发酵周期短，故采用补料分批发酵。在补料分批发酵中，初始发酵培养基中玉米粉浓度为3.75g/100ml,从发酵第3h 开始恒速（200L/h）补入原培养液，其中玉米粉浓度变为原料液十倍37.5g/100ml，每隔1h 取样一次，不合适处加以微调。
8.2 发酵过程pH 值的控制
各种微生物需要在一定的pH 环境中方能正常生长繁殖。
黑曲霉酸性蛋白酶的最适pH 是2.5~2.7，但黑曲霉3．350发酵产生酸性蛋白酶培养基的最初浓度应调节为4.5~5.5左右。一般控制在5.5。
8.3 发酵过程温度的控制
温度对微生物的生长、产物的合成和代谢调节有重要作用。温度变化一方面影响各种酶反应的速率和蛋白的性质，另一方面影响发酵液的物理性质。不同的菌种有着不同的最适温度。黑曲霉发酵温度控制在30℃左右最适宜。
8.4 发酵过程溶氧的控制
液体深层培养中大部分微生物在合成蛋白酶时需要强烈搅拌通风。氧是黑曲霉生物合成酸性蛋白酶必须的，通风量较大对产酸性蛋白酶有利，通风气量不足对黑曲霉菌丝体的生长无明显影响，但对酶产量有严重的影响，通风量对产酶的影响在培养前期更为明显，短暂停止通风搅拌会导致酶产量急剧下降。因此发酵工程中应控制好通风量，0~24h为1:0.25,24~48h为1:0.5,48h至结束为1:1.0，发酵周期为72h 左右。
8.5发酵过程氧载体的控制
在发酵过程中，在发酵培养基中加入正十二烷、全氟化碳，液态烷烃(为12—16碳直链烷烃混合物) 等氧载体，使培养基中氧传递速度加快，产生气泡少，剪切力小，能明显提高菌株产酸性蛋白酶的量。
8.6发酵过程染菌的控制
在工业发酵中，染菌轻则影响产品的质和量、重则倒罐或停产、影响工厂效益。因此要严格要求无菌操作，种子灭菌要彻底，净化空气设备，操作要慎重，设备灭菌要彻底。若在前期染菌，应重新灭菌；中期染菌，应偏离杂菌生长条件；后期染菌，可提前或及时放罐。
可能出现的异常发酵现象：
（1）培养基变稀：可能是噬菌体污染或营养成分缺乏，也可能是设备渗漏或灭菌完成后冷凝水过多；
（2）培养基过浓：会抑制微生物的生长，考虑可能是污水污染、灭菌时水分散失过多，或微生物生长速率过慢；
（3）耗糖慢：可能是环境问题，或种子生长能力降低，检测种子是否衰退，发酵条件是否合适，以及营养成分是否全面，尤其注意缺磷；
（4）pH 值不正常：用缓冲对来调节，检查是否染菌，碳氮比是否合适； （5）生长缓慢：最可能的原因就是营养成分不足或细胞本身出现问题。
9．下游加工
下游加工过程是生物工程的一个组成部分，是生物化工产品通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得，以上述发酵液、反应液或培养液分离、精制有关产品的过程。
9.1 下游加工工艺流程
将发酵液过滤得到滤液，然后加入单宁酸沉淀，离心得到酸性蛋白酶与单宁酸的复合物，其后加入相对分子质量为6000的聚乙二醇溶液，搅拌，离心，去滤液，加入糖用活性炭脱色，得到浅黄色酶液，先用乙醇沉淀，后加入硫酸铵盐析，得到湿晶体，干燥后得到浅色酶，磨粉，制得浅色酶粉，成品加工成工业用酶制剂。
10. 总结和讨论
通过本次课程设计, 大量翻阅有关资料，进一步掌握了《发酵工程》课程的基本知识，掌握了发酵工艺设计要点及其相关工程设计要点，锻炼了自己初步的发酵工程工艺及设备的独立设计能力；培养了综合运用所学的理论知识独立分析和解决发酵工程实际问题的实践能力。
本次课程设计中仍然存在许多不足和缺陷, 比如说提炼总收率不是很高。跟其他发酵产品相比，酸性蛋白酶的产量不是很高，为了增加酸性蛋白酶的产量，我们还要做出很多努力，利用各种遗传学技术手段改变生产菌株的特性，或者通过过程控制法控制乳链菌肽的发酵过程来进一步提高乳链菌肽的产量，以满足广大民众对乳链菌肽的需求。
在本次设计过程中贾万利老师和多位老师给予了大力指导和帮助和支持，这才使得我能够顺利地完成课程设计。在此，我对课程设计所有老师表示诚挚的感谢！
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1. 前言
酸性蛋白酶是一类最适pH 值为2.5〜5.0的天冬氨酸蛋白酶，相对分子质量为30000 〜40000。酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和微生物分泌物, 包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根据其产生菌的不同，微生物酸性蛋白酶可分为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶. 根据作用方式可分为两类：一类是与胃蛋白酶相似，主要产酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛霉和栗疫霉等。 细菌中尚未发现产酸性蛋白酶的菌株. 由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。
国外关于酸性蛋白酶的生产研究从20世纪初就开始了。1908年，德国科学家从动物的胰脏中提取出胰蛋白酶，并将其用于皮革的鞣质。1911年美国科学家从木瓜中提取木瓜蛋白酶（在酸性，碱性和中性的条件下都能分解蛋白质的酶）并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白质浑浊物。自1954年吉田首次发现黑曲霉可产生酸性蛋白酶以来，国内外对微生物发酵生产酸性蛋白酶进行了广泛的研究。1964年外国科学家首次发现大孢子黑曲霉突变体能产生两种不同的酸性蛋白酶，即酸性蛋白酶和酸性蛋白酶。1965年又从血红色陀螺孔菌，中分离出了一种酸性蛋白酶，并对该酶进行了纯化和结晶。1968年从微小毛霉中筛选出了一种酸性蛋白酶，并对其进行了纯化和酶学性质分析。1995年外国科学家对烟曲霉酸性蛋白酶的基因进行了克隆和测序。2001年又从假丝酵母中筛选出了一种酸性蛋白酶菌株，并对该酶进行了核苷酸序列分析和功能分析。国外学者对曲霉酸性蛋白酶的结构和功能等己经研究的较为透彻。
与国外相比，我国对酸性蛋白酶的研究相对较晚些。1970年上海工业微生物研究所首先从黑曲霉中筛选出一株产酸性蛋白酶菌株，并和上海酒精厂协作进行中试生产，填补了我国酸性蛋白酶制剂的空白. 近年来国内在酸性蛋白酶上的研究大都致力于选育产酶活力高、抗逆性好的菌种，并获得了一些很有应用前途的产酶菌株。目前用于酸性蛋白酶生产的高产菌株主要有黑曲霉、宇佐美曲霉和青霉及它们的突变株。李永泉等，对宇佐美曲霉所产的酸性蛋白酶进行了发酵过程动力学研究. 戚淑威等对青霉产酸性蛋白酶的适宜条件和酶学性质进行了分析。谢必峰等，采用硫酸铵盐析法和离子交换层析法分离纯化了黑曲霉产酸性蛋
白酶，并对其氨基酸组分进行了分析。2008年王云等，通过质谱指纹法对黑曲霉发酵液中所产蛋白进行了分析比对和鉴定酸性蛋白酶分子生物学方面的研究，国内仅仅集中于凝乳酶和胃蛋白酶方面，有关真菌酸性蛋白酶的分子生物学研究报道很少
摘要：本课题设计是利用黑曲霉（Aspergillus niger ）3.350制备酸性蛋白酶，主要从菌种的选育，培养基的配置，灭菌，种子扩大培养，和发酵罐的设计，发酵车间的物料衡算，发酵过程的工艺控制，下游加工十点进行。阐述了1000吨饲用酸性蛋白酶的制取工艺。其中对发酵罐做了创新性设计。
2. 菌种的选育
2.1 菌种的制备
不管在过去、现在和将来，微生物是各种生物活性产物的丰富资源。在发酵前期，微生物的选择至关重要，此课题设计的是利用黑曲霉发酵生产酸性蛋白酶的整体过程。
选择性分离的一般步骤如下：
含微生物材料的选择——材料的预处理——所需菌种的分离——菌种的培养——菌种初筛——菌种复筛——性能鉴定——菌种保藏。
本实验选用黑曲霉作为菌种，发酵生产酸性蛋白酶，该霉菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为3．350。
而黑曲霉（Aspergillus niger ）生产酸性蛋白酶的工艺流程为：
原始菌株→分离纯化→紫外线诱变→选育菌株分离纯化→亚硝
基胍诱变→选育菌株分离纯化→选育菌株生产工艺优化→传代试验→选育菌株→斜面菌种→三角瓶菌种→浅盘菌种_________________
↓
主原料→混料（水、无机氮、无机盐）→蒸料→冷却→接种→发酵→稳定化处理→干燥→粉碎→包装→检测→成品
↓
粗酶→抽提→过滤→盐析→沉淀→干燥粉碎→包装→检测→成品
2.2 菌种的保藏
菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产工业，更离不开菌种。所以，菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分，其任务是使菌种不死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。
菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状态、干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。常用的菌种保藏方法有：斜面冰箱保藏法、沙土管保藏法、菌丝速冻法、石蜡油封
存法、真空冷冻干燥保藏法和液氮超低温保藏法。
此课题中黑曲霉采用真空冷冻干燥保藏法，预冻：本实验采用-80 ℃预冻2h 后进行干燥。干燥过程：第一阶段干燥．样品温度分别控制在-15 ℃ 14 h，10 ℃ 10 h，真空度为150 Pa，直到样品的水分升华除去90%；第二阶段干燥。升高板层温度至20℃，迅速蒸发样品中的残余水分。该过程大约需要10h 。将冻干菌存放于0℃冰箱中备用.
3．培养基的配制
培养基的类型很多，可以根据组成、状态和用途等进行分类，按照用途可以分成孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。微生物大规模发酵设计主要用到孢子、种子和发酵培养基这三种类型。
3.1活化培养基
黑曲霉的活化培养基的配制如下：斜面培养基：蔗糖 30g ，NaNO 3 3 g，MgSO 4 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO 4 0.01 g，K 2HPO 4 1 g，琼脂20 g，将上述各组分溶于1000 mL 水中，121 ℃灭菌20 min，备用。
3.2 种子培养基
种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长的粗壮成为活力强的种子。对于种子培养基的营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也比较高些，浓度以稀薄为好，可以达到较高的溶解氧，供大量菌体生长和繁殖。
黑曲霉的种子培养基为麦芽汁培养基。
3.3 发酵培养基
发酵培养基的要求是营养要适当丰富和完全适合于菌种的生理特性和要求，使菌种迅速生长、健壮，能在比较短的周期内充分发挥产生菌合成发酵产物的能
力，但要注意成本和能耗。
黑曲霉3．350发酵培养基的配方：豆饼粉 3.75％, 玉米粉0.625％，鱼粉 0.625％，氯化铵 1.0％，氯化钙 0.5％，磷酸二氢钠0.2％，豆饼石灰水解液10％，pH 5.5。
3.4 补料培养基
黑曲霉3．350发酵培养基的配方：豆饼粉 37.5％, 玉米粉0.625％，鱼粉 0.625％，氯化铵 1.0％，氯化钙 0.5％，磷酸二氢钠0.2％，豆饼石灰水解液10％，pH 5.5。主要加大豆饼粉的量，起补充碳源，氮源和生长因子之用。
4 .灭菌
生物化学反应过程中，特别是细胞培养过程中，往往要求在没有杂菌污染的情况下进行，这是由于生物反应系统中通常含有比较丰富的营养物质，因而很容易受到杂菌的污染，进而产生各种不良的后果：
（1）由于杂菌的污染，使生物化学反应的基质或产物消耗，造成产率下降；
（2）由于杂菌所产生的某些代谢产物，或污染后发酵液的某些理化性质的改变，使产物的提取变得困难，造成收得率降低或使产品质量下降；
（3）污染的杂菌可能会分解产物而使生产失败；
（4）污染的杂菌大量繁殖，会改变反应介质的pH ，从而使生物化学反应发生异常变化；
（5）发生噬菌体污染，微生物细胞被破裂而使生产失败等。
4.1 灭菌方法
所谓灭菌，就是指用物理或化学杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。常用的灭菌方法有：化学灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和过滤灭菌等。本设计采用湿热灭菌。
4.2 培养基的连续灭菌
图4-1 连续灭菌的流程图
培养基连续灭菌为在短时间内被加热到灭菌温度（130℃~140℃），短时间内保温（一般为5~8min）, 升降温时间相对较短，可以实现自动控制、提高发酵罐的设备利用率，蒸汽用量平稳等优点，培养基在短时间内被加热到灭菌温度，短时间保温后快速冷却，再进入早已灭完菌的发酵罐，这样不但可以节省时间，更重要的是减少了培养基的破坏率。对补料培养基的灭菌方法跟发酵培养基的灭菌方法一样都是湿热灭菌，其加热蒸汽压力要求较高，一般不小于0.45MPa 。连续灭菌流程如上图。
影响灭菌效果的因素有：微生物的种类和数量；培养基的性质、浓度、成分；灭菌的温度和时间。
灭菌原理：对数残留定律（对培养基进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比）。
4.3 空气灭菌
此课题以空气为氧源。根据国家药品质量管理规范的要求，生物制品、药品的生产场地业需要符合空气洁净度的要求。获得无菌空气的方法有：辐射灭菌、化学灭菌、加热灭菌、静电除菌、过滤介质除菌等。
过滤介质除菌是目前发酵工业中空气除菌的主要手段，常用的过滤介质有棉花、活性炭或玻璃纤维、有机合成纤维、有机和无机烧结材料等。
4.3.1 过滤除菌流程及设备
过滤除菌流程图如图4-1所示：
1-粗过滤器；2-压缩机；3-贮罐；4，6-冷却器；5-旋风分离器；7-丝网除沫器；8-加热器；
9-空气过滤器
图4-1 空气除菌设备流程图
4.3.2 无菌空气的检查
无菌检查方法有肉汤培养法、斜面培养法和双碟培养法。这里采用斜面培养法进行无菌空气的检查，具体方法为：500ml 三角瓶内装斜面培养基50ml ，接种后置旋转式摇床上，30℃下培养24h 后观察有无菌落形成。
4.4 发酵罐的灭菌
发酵罐的灭菌可采用空罐灭菌，此处采用空罐灭菌。空罐灭菌是将所有的通气口都稍微打开，然后通入水蒸汽，让水蒸汽尽量通过每一个菌落达到灭菌效果。具体方法是：在121℃灭菌80分钟。
5．种子扩大培养
本发酵属于一级种子罐扩大培养，二级发酵。设计流程图如图5-1：
图5-1 种子扩大培养流程图
5.1 种子制备
将菌种接种于活化斜面培养基培养, 30℃活化24h 。活化后的菌种用生理盐水洗下，转接于摇瓶种子培养基, 接种量5%~6%，30℃培养12h 。经摇瓶培养后的种子，以接种量5%接种于种子罐，30℃培养12h ，菌种浓度达到108~109个/mL。
5.2 发酵罐培养
将扩大培养后的菌种以5%的接种量接入发酵罐中，发酵温度控制在30℃，罐压0.5㎏/cm2，发酵过程中通过流加Na0H 溶液控制发酵液pH 。根据菌体浓度、pH 决定具体发酵时间为35.5h 。发酵过程中采用自动搅拌器，将转速控制在100r/min，使流加碱液与发酵液快速混合均匀。
6．发酵罐的设计
广东省微生物研究所通过改变摇瓶装液量和转速来考察溶氧对黑曲霉菌种的影响。实验结果表明：在250ml 的三角瓶中装液量为100ml ，转速150r/min酶活最高，装液量过多或过少，产酶量较低。摇床转速较低时，通气量不够，生长较慢，产酶量也低。当摇床转速过快时，产酶量也不高，可能是菌丝断裂过度。培养基中的营养主要被菌体用于自身的生长。
此课程设计中选择使用机械搅拌式通风发酵罐。机械搅拌通风发酵罐是发酵工厂最常用类型。它是利用机械搅拌器的作用，使空气和发酵液充分混合，促使氧在发酵液中溶解，以保证供给微生物生长繁殖、发酵所需要的氧气。
6.1 发酵罐的结构
机械搅拌式通风发酵罐的主要组成部件有：罐体、搅拌器、轴封、消泡器、联轴器、中间轴承、空气吹泡管(或空气喷射器) 、挡板、冷却装置、人孔以及管路等。
6.2 发酵罐罐体的几何尺寸计算
1. 发酵罐普遍H 0/D=1.97，而酸性蛋白酶对空气有一定要求，为了使之更大面积的接受氧气，黑曲霉所用发酵罐设计为矮胖形，即：H 0/D=1.63，从通风角度讲，空压机为无油润滑一级压缩, 出口压力0.3MPa 。压缩空气经过约60m 米以上路程才送到发酵车间, 管道阻力加上空气过滤器阻力, 空气压降厉害, 若大型发酵罐再设计成瘦高形, 势必会增加液柱高度, 直接影响到进罐通风管口空气的压头和流速, 若空压机房贮气筒压头稍有波动产生下降, 发酵罐进风口风速无喷力, 对供气量及溶氧带来不利影响。所以大型发酵罐设计成矮胖形可降低液柱高度, 有利通风溶氧。
2. 发酵罐上下封头采用十二块西瓜片拼装而成, 顶部中心太阳板直径Φ1800，在现场施工拼装，解决了封头整体成形无法运输的困难。
3. 传动部采用卧式电动机通过联轴节带动大型减速箱直接带动搅拌轴, 就是减速箱内设一对弧形伞齿轮使进轴作90°变向用联轴节通过十二根尼龙销棒联接卧式电动机。既降低了设备安装高度, 又给安装维修带来了很大方便, 如图：
图6-1 传动部卧式电动机联轴图
四台发酵罐采用二种减速箱, 前二台罐为迸口减速箱, 减速箱内装有一对直齿轮和一对弧形伞齿轮, 结构简单, 维修方便, 一般只有伞齿轮及进轴、轴承损坏要维修更新。后二台罐采用国产福州发电设备厂生产的行星齿轮箱, 箱内加设一对弧形伞齿轮使进轴作90°变向, 由联轴节与卧式电动机相联。与进口减速箱
比, 结构复杂、行星轮坏很难修理。
4. 减速箱下传动架上传动轴设计安放一部轴承座, 内装中型普通轴承一粒, 轻型平面受力轴承一粒，轴承上端轴头由夹壳联轴节与减速箱出轴联接。设计少放一部轴承降低传动架约米的高度, 增强了减速箱及电机在罐顶上的稳定性。罐内设计放二部轴瓦来定位罐内轴与上主轴的同心度, 上部轴瓦在盘管上方, 下部轴瓦安装在轴端。轴瓦、轴套材质均为铸铁。只要上下轴垂直同心度装得好, 轴瓦、轴套半年到一年更换一次。
5. 对发酵罐来讲, 冷却面积及冷却管的设计非常重要, 既要考虑排作形式, 又要起到最好冷却效果, 还要便于安装维修。设计中采取盘管式, 列管式同时采用的做法, 加设盘管组相对来讲好布置, 可利用盘管间之间隙当楼梯用, 给安装及今后维修带来很大方便。加设列管组可弥补全用盘管时需用冷却面积的管量放不下和盘管无档板作用的缺点。考虑罐径大, 放热量集中冷却效果一定要好, 所以又在冷却管的合理进出水上做文章, 采用快进快出的接管法, 就是把盘管列管分成多组, 使冷却水分成多路进多路出, 以水在冷却管内1.5米/秒停留1分钟来分组。与发酵液热交换后的热水汇集总管进热水池、再用泵送冷却塔, 冷却后的水进冷水池, 由泵供送发酵罐进水用。原则冷却塔循环水量要大于发酵用水量约倍, 保证热水通过冷却塔及时降温到气温夏天满足发酵冷却用水的需要, 如图
图6-2 发酵罐冷却管设计
6. 搅拌桨叶形式及档次直接影响到产酸及搅拌功率, 由于罐体矮胖形, 罐径大, ，设计采用大桨叶, 低转速。底道桨Φ1900，八弯叶, 中道桨小, 六弯叶, 转速65r.p.m 。所以, 采用高通风, 大桨叶, 低转速搅抖, 可降低搅拌功率, 同样达到高产酸的效果。桨叶叶片做成可装拆式, 部件拿进罐内后组装, 用不锈螺栓把叶片锁紧在园盘上, 给运输安装带来方便, 司时罐顶人孔可缩小, 开Φ600即可。
八万叶轮尺寸如下：
叶径d=0.365D=0.365×5200=1900mm， 盘径d=0.62d=0.62×1900=1175mm， 叶片高h=0.15d=0.15×1900=280mm， 叶片弧长L=0.4d=0.4×1900=760mm，
风管：罐压：0.02MPa ，罐温：35℃，培养基量：最大通风比1：0.38时120 m 3。
液柱高度：H=7.3米，风管出口压P=0.193MPa。
贮气筒压头P （供气最低压力）：空气输送管道阻力0.02MPa ，二级空气过滤器阻力0.04MPa 。故P=0.02+0.04+0.193=0.253MPa（绝对压力）
7. 进风管采用盘管式（管径根据通风量计算, 在盘管上放二付不锈法兰, 便于安装及今后清洗，盘管径等于低道桨径。盘管放在底道桨叶片下面, 盘管下方开三排小孔, ，二排成45°角，小孔径Φ4~6，交叉排列、这样有利于罐底部液体的搅拌和通风, 且不易被固体物堵塞, 孔数根据盘管内截面积计算, 小孔总面积镇盘管内截面积, 使风通过各个小孔时有产生喷力。
8. 罐体支座设计成由六根园柱脚支承整台罐体放在盆形的水泥墩上, 放料管从罐底中接出斜穿过水泥墩壁排水孔引接到打料泵送等电点提取。避免了裙座造成罐底难清洗, 死角多, 长杂菌、难消毒的缺点。整台罐底下通风好, 阳光照, 清洗消毒非常方便。
9. 利用下轴瓦座筒形架下部四孔封上2目不锈钢网来捕集罐内螺褚全、螺母等另部件的脱落回收, 给查罐时及时提供维修信息, 保证了放料阀、打料泵不易损
坏, 使用安全可靠性。
6.3 发酵罐壁厚
6.3.1 罐体壁厚
δ1=pD/(2σψ-p)+C （6-2） 式（6-2）中：p —耐受压强（取0.25MPa ）
ψ—焊缝系数，双面焊取0.8，无缝焊取1.0
σ—设计温度下的许用应力（不锈钢焊接压力容器许用应力为150℃,137 MPa）
C —腐蚀裕度，当 δ- C
解得罐体壁厚
δ1=pD/(2σψ-p)+C=0.25×1500/（2×137×0.8-0.25）+3=4. 7 mm 取整为δ1=5 mm 6.3.2 封头壁厚
δ2=pDy/(2σψ) +C （6-3） 式（6-3）中：p —耐受压强（取0.25MPa ）
y —开孔系数，取2.3
ψ—焊缝系数，双面焊取0.8，无缝焊取1.0
σ—设计温度下的许用应力（不锈钢焊接压力容器许用应力为150℃,137 MPa）
C —腐蚀裕度，当 δ- C
解得封头壁厚
δ2=pDy/(2σψ)+C=0.25×1500×2.3/（2×137×0.8）+3=6.9 mm 取整为δ2=7 mm
6.4 发酵罐个数的确定
已知年产量为1000吨，一年有300个工作日，黑曲霉发酵周期T=48h=2d，其中清理发酵罐1天，产量为50 g/L，罐压0.5㎏/㎝2。查相关资料有：酸性蛋白酶发酵周期48h ，清理及维修发酵罐时间为1天，则发酵总时间为3天，产量为50g/L,灭菌时间为5h ，发酵液预处理收率约为90 %，提取时的收率约为95%，浓缩干燥收率为90%，装料系数为60%
一年需放罐的次数：300÷3=100次 每批次产酸性蛋白酶1000/100=10吨 总提取率为：90 %×95%×90 %=76.95%
假设用一台发酵罐，则发酵罐的体积V=10×1000/76.95%/60%/50=433.2 m3 选发酵罐的公称体积为200 m 3，则需要发酵罐3个，则购置4台发酵罐，一台备用。
6.5 发酵罐附属结构的计算
6.5.1 搅拌器
搅拌桨叶形式及档次直接影响到产酸及搅拌功率, 由于罐体矮胖形, 罐径大, ，设计采用大桨叶, 低转速。底道桨Φ1900，八弯叶, 中道桨小, 六弯叶, 转速65r.p.m 。所以, 采用高通风, 大桨叶, 低转速搅抖, 可降低搅拌功率, 同样达到高产酸的效果。桨叶叶片做成可装拆式, 部件拿进罐内后组装, 用不锈螺栓把叶片锁紧在园盘上, 给运输安装带来方便, 司时罐顶人孔可缩小, 开Φ600即可。
八万叶轮尺寸如下：
叶径d=0.365D=0.365×5200=1900mm，
盘径d=0.62d=0.62×1900=1175mm， 叶片高h=0.15d=0.15×1900=280mm， 叶片弧长L=0.4d=0.4×1900=760mm，
风管：罐压：0.02MPa ，罐温：35℃，培养基量：最大通风比1：0.38时120 m 3。
液柱高度：H=7.3米，风管出口压P=0.193MPa。
贮气筒压头P （供气最低压力）：空气输送管道阻力0.02MPa ，二级空气过滤器阻力0.04MPa 。故P=0.02+0.04+0.193=0.253MPa（绝对压力）
6.5.2手孔、视镜、温度计和工艺接管
手孔：由《平盖手孔》(JB/T589-1979)或《板式平焊法兰手孔》(HG21529-1995)，选用光滑密封面的平盖手孔APNl ，DN250 JB/T589-1979。
视镜：由标准《压力容器视镜》(HG/T21619-21620-1986)或《组合式视镜》(HG21505-1992)，选用碳钢带颈视镜IPNl ，DN80(HG/T21619-21620-1986)。
温度计：加强套管温度计的选用可以参考生产厂家的产品目录，这里取公称长度1 430 mm，配凸面板式平焊管法兰PNO.6 MPa，DN65，HG20593--1997(《板式平焊钢制管法兰》) 。
工艺接管：(《钢制管法兰型式、参数(欧洲体系) 》) 。
进料管口采用Ф57×3.5无缝钢管，配法兰PNo.6，DN50，HG20592-1997出料管口采用Ф76×4无缝钢管，配法兰PNo.6，DN65，HG20592-1997 加热蒸汽进口管采用Ф38×3.5无缝钢管，配法兰PNO ．6，DN32，HG20592-1997
冷凝液出口管和压力表接管都选用Ф32×3.5无缝钢管，配法兰PNO.6, DN25, HG20592-1997
安全阀接管采用Ф45×3.5无缝钢管，配法兰PNO.6，DN40，HG20592-1997
6.6发酵设备一览表
通过设备的工艺设计计算，可列出淀粉酶生产的所有设备，如表4-1
表6-6 1000t/a酸性蛋白酶生产车间设备一览表
序号 1 2
设备名称 发酵罐 种子罐
台数 6 3
规格与型号
公称容积200m 3, φ5200mm 公称容积5m 3, φ1400mm
材料 A 3钢 A 3钢
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
种子罐分过滤器 发酵罐分过滤器
连消塔 维持罐 喷淋冷却器 螺旋板换热器 预处理罐 硅藻土过滤机 真空浓缩锅 盐析罐 板框压滤机 物料泵 清水泵 空气压缩机 空气贮罐 油水分离器 丝网分离器 热交换器
3 6 1 1 1 1 3 3 1 1 5 4 4 3 1 1 1
φ40mm φ300mm φ350×2600mm
A 3钢 A 3钢 A 3钢 A 3钢 A 3钢 A 3钢 A 3钢 A 3钢 A 3钢 A 3钢 A 3钢 机体铸铁 机体铸铁 A 3钢 A 3钢 A 3钢 A 3钢 A 3钢
V=4m3 F=171.9m2 F=20m2 V=100m WK500-A SZN —1200 V=50m XYJ800 GNF64×4 JL×20-36-G 4L-40/2-3.2 φ1300mm φ600mm φ120mm
33
4
JM220QF
7．发酵车间的物料衡算
7.1 工艺技术指标及基础数据
7.1.1 主要技术指标见表7-1
表7-1黑曲霉主要技术指标
指标名称 生产规模(G)
单位 t/a
指标数 1000
指标名称 产品纯度
单位 %
指标数 95
年生产天数(D) 产品质量(U) 倒罐率(η0) 发酵周期(T)
d/a IU/mg % d
300 50 2.0 3
接种量 发酵罐装料系数(η1) 放罐发酵单位(Um ) 提取总收率(η2)
% % IU/ml %
5 60 8000 77
7.1.2 培养基（g/L）
黑曲霉3．350发酵培养基的配方：豆饼粉 3.75％, 玉米粉0.625％, 鱼粉 0.625％ , 氯化铵 1.0％, 氯化钙 0.5％ , 磷酸二氢钠0.2％, 豆饼石灰水解液10％, pH 5.5.
菌种培养基的配置：查氏培养基NaNO3 2g，KHPO4 1g，KCl 0.5g ，MgSO4 5g ，FeSO4 0.01g，蔗糖 30g ，琼脂 15g ，水 1000ml ，pH 自然。
7.2 发酵车间的物料衡算
7.2.1 放罐成熟发酵液量
成熟发酵液放罐单位为U m =8000IU/mL，生产G=1000t酸性蛋白酶发酵液量为：
V 0=(G×U)/(Um ×η2×98%×95%) （7-1） 式（7-1）中：G —生产规模
U —产品质量
U m —放罐发酵单位
95%—产品的纯度
98%—除去倒罐率2%后的发酵成功率
7.2.2 放罐成熟发酵液量V 0分为三部分组成
底料 V 1=156960×84%=131846.4m3 种液量 V 2=156960×5%=7848m3 补料液 V 3=156960×11%=17265.6m3 7.2.3 培养基各组分耗用量
豆饼粉耗用量： m1=3.75％×156960=5886 玉米粉耗用量： m2=0.625％×156960=981, 鱼粉耗用量： m3=0.625％×156960=981
氯化铵耗用量： m4=1.0％×156960=1569.6 氯化钙耗用量： m5=0.5％×156960=7784.8 磷酸二氢钠耗用量： m6=0.2％×156960=313.92 豆饼石灰水解液耗用量：m7=10％×156960=15696 pH 5.5
7.3物料衡算表
表7-3 1000t/a黑曲霉发酵生产物料衡算表
物料名称
1000 t/a黑曲霉生产的物料量
5886 981 981 1569.6 7784.8 313.92 15696 据情况而定
每周期物料量
588.6 98.1 98.1 156.96 778.48 31.392 156.96 据情况而定
豆饼粉/㎏ 玉米粉/㎏ 鱼粉/㎏ 氯化铵/㎏ 氯化钙㎏ 磷酸二氢钠/㎏ 豆饼石灰水解液/㎏
HCI
7.4 简单的物料衡算
放罐发酵单位U m =8000IU/mL，折合成产量为50g/L，折合系数为k=1.6×105 IU/g。
本设计采用3个发酵罐，每个为200m 3，酸性蛋白酶的产量50g/L，提炼总收率为95%，装料系数为60%，浓缩干燥收率为90%，产品纯度为95%，则： 每个发酵罐在一个发酵周期中酸性蛋白酶的产量为： 200×50×95%×60%,90%×95%=4873.5㎏ 那么3个发酵罐一年的总产量为： （4873.5×300/3）×3=1462050㎏=1462.05t
在后期损耗合理的情况下，故符合年产1000t 的生产要求。
8．发酵过程的工艺控制
8.1 发酵过程的补料策略
中间补料是在发酵过程中补充某些营养物料、水或产酶促进剂，以满足微生物的代谢活动和产酶需要。由于黑曲霉发酵周期短，故采用补料分批发酵。在补料分批发酵中，初始发酵培养基中玉米粉浓度为3.75g/100ml,从发酵第3h 开始恒速（200L/h）补入原培养液，其中玉米粉浓度变为原料液十倍37.5g/100ml，每隔1h 取样一次，不合适处加以微调。
8.2 发酵过程pH 值的控制
各种微生物需要在一定的pH 环境中方能正常生长繁殖。
黑曲霉酸性蛋白酶的最适pH 是2.5~2.7，但黑曲霉3．350发酵产生酸性蛋白酶培养基的最初浓度应调节为4.5~5.5左右。一般控制在5.5。
8.3 发酵过程温度的控制
温度对微生物的生长、产物的合成和代谢调节有重要作用。温度变化一方面影响各种酶反应的速率和蛋白的性质，另一方面影响发酵液的物理性质。不同的菌种有着不同的最适温度。黑曲霉发酵温度控制在30℃左右最适宜。
8.4 发酵过程溶氧的控制
液体深层培养中大部分微生物在合成蛋白酶时需要强烈搅拌通风。氧是黑曲霉生物合成酸性蛋白酶必须的，通风量较大对产酸性蛋白酶有利，通风气量不足对黑曲霉菌丝体的生长无明显影响，但对酶产量有严重的影响，通风量对产酶的影响在培养前期更为明显，短暂停止通风搅拌会导致酶产量急剧下降。因此发酵工程中应控制好通风量，0~24h为1:0.25,24~48h为1:0.5,48h至结束为1:1.0，发酵周期为72h 左右。
8.5发酵过程氧载体的控制
在发酵过程中，在发酵培养基中加入正十二烷、全氟化碳，液态烷烃(为12—16碳直链烷烃混合物) 等氧载体，使培养基中氧传递速度加快，产生气泡少，剪切力小，能明显提高菌株产酸性蛋白酶的量。
8.6发酵过程染菌的控制
在工业发酵中，染菌轻则影响产品的质和量、重则倒罐或停产、影响工厂效益。因此要严格要求无菌操作，种子灭菌要彻底，净化空气设备，操作要慎重，设备灭菌要彻底。若在前期染菌，应重新灭菌；中期染菌，应偏离杂菌生长条件；后期染菌，可提前或及时放罐。
可能出现的异常发酵现象：
（1）培养基变稀：可能是噬菌体污染或营养成分缺乏，也可能是设备渗漏或灭菌完成后冷凝水过多；
（2）培养基过浓：会抑制微生物的生长，考虑可能是污水污染、灭菌时水分散失过多，或微生物生长速率过慢；
（3）耗糖慢：可能是环境问题，或种子生长能力降低，检测种子是否衰退，发酵条件是否合适，以及营养成分是否全面，尤其注意缺磷；
（4）pH 值不正常：用缓冲对来调节，检查是否染菌，碳氮比是否合适； （5）生长缓慢：最可能的原因就是营养成分不足或细胞本身出现问题。
9．下游加工
下游加工过程是生物工程的一个组成部分，是生物化工产品通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得，以上述发酵液、反应液或培养液分离、精制有关产品的过程。
9.1 下游加工工艺流程
将发酵液过滤得到滤液，然后加入单宁酸沉淀，离心得到酸性蛋白酶与单宁酸的复合物，其后加入相对分子质量为6000的聚乙二醇溶液，搅拌，离心，去滤液，加入糖用活性炭脱色，得到浅黄色酶液，先用乙醇沉淀，后加入硫酸铵盐析，得到湿晶体，干燥后得到浅色酶，磨粉，制得浅色酶粉，成品加工成工业用酶制剂。
10. 总结和讨论
通过本次课程设计, 大量翻阅有关资料，进一步掌握了《发酵工程》课程的基本知识，掌握了发酵工艺设计要点及其相关工程设计要点，锻炼了自己初步的发酵工程工艺及设备的独立设计能力；培养了综合运用所学的理论知识独立分析和解决发酵工程实际问题的实践能力。
本次课程设计中仍然存在许多不足和缺陷, 比如说提炼总收率不是很高。跟其他发酵产品相比，酸性蛋白酶的产量不是很高，为了增加酸性蛋白酶的产量，我们还要做出很多努力，利用各种遗传学技术手段改变生产菌株的特性，或者通过过程控制法控制乳链菌肽的发酵过程来进一步提高乳链菌肽的产量，以满足广大民众对乳链菌肽的需求。
在本次设计过程中贾万利老师和多位老师给予了大力指导和帮助和支持，这才使得我能够顺利地完成课程设计。在此，我对课程设计所有老师表示诚挚的感谢！
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