第六章 生物工程中的下游加工（技术）
6.1前言
“下游加工（技术）” 对于从任何工业化生产中回收有用产品所需要的所有步骤来说是一个有用的词语。对于生物工程特别重要，我们想要的最终形式的产物常常非常远的从最先在生物反应器中获得的状态除去。例如，一个典型的发酵
过程是一个分散的固体（细胞、也许有营养培养基的某些组
分等）与稀释水溶液的混合物；所想要的产物也许作为一种
非常复杂的混合物的组分存在于细胞中，或者存在于稀释的
培养基溶液中，或甚至两者中都有。任何情况下，这个产品的回收、浓缩和纯化都需要有用并有效的操作，这也受生产经济性的限制。任何特殊的要求，如需要除去污染物或限制生产微生物（process organism）都只会增加困难。
许多实验室中的标准操作在生产中都是不实用或者不经
济的。而且，生物产品常常是非常脆弱（labile 物，其活性结构只能在限定并有限的pH 要用到所有可用的科学方法以发挥最佳的效果就需要更多
的创造性。也明显的是，没有一种独特的、理想的、普遍适
用的操作或者仅是操作顺序可以推荐；对一个特定的问题应
当以最适宜的方式把单个单元操作结合起来。 垂悬分词
6.2 粒子的分离
在发酵终点，多数情况下第一步是将固体（通常是细胞，
但也可以是在一个特定支持物上的细胞或者酶，不包括反应
培养基固体组分）从几乎一直是水溶液的连续均匀的液体系
统中分离出来。与这个分离相关的一些细胞特性列于表6.1；
注意，细胞的比重不比fermentation broth 大很多。细胞的
大小也给细菌带来了困难，但是比较大的细胞更容易分离，有时候甚至只需要简单的定位于倾析器。分离的容易性取决
于fermentation broth的性质，它的pH 、温度等等，在许多
情况下，通过添加助滤剂、絮凝剂的等等进行改进（见后面）。
表6.2给出了分离方法的大体分类。
6.2.1 过滤
这个是分离filamentous fungi 和fermentation broth 中
的filamentous bacteria（例如，链霉菌）所使用的最广泛和
最典型的方法。它也可以用于酵母絮凝物的分离。根据机理，过滤可以采用表面过滤或者深层过滤；或者离心过滤；所有情况下的驱动力都是压力，由超压产生或者由真空产生。
过滤的速率，如在一定时间内收集的滤液的体积，是过
滤面积、液体的黏度和通过过滤基质的压力降以及
（deposited filter cake）沉积的滤饼的作用。过滤基质与滤
饼filter cake的抗性( resistance) 因此是关键的，决定了它
的可压性（compressibility ）。对于不可压的filter cake滤饼，
过滤速率与压力无关，但是多数生物材料是可压的，所以滤
饼的抗性随着时间而增大而与过滤和滤饼形成过程中增大
的总体抗性无关。 错流过滤实现了过滤流的巨大的改进，在错流过滤中，固体不经过过滤器而通过跨膜的湍流保持悬浮状态。这可以通过安排悬浮物流经膜来实现或者通过在过滤器中固定移
动的blades or impellor来实现。简单的平板过滤广泛用于液体的澄清，也可以用于过滤少量的悬浮物，但是它们的载量
是有限的；有时使用filer-press assemblies 尤其对于分批操作。
旋转鼓式真空过滤器大概是从fermentation broth 分离
微生物最为广泛使用的装置；在这些过滤器中，过滤部分是一个旋转的鼓维持在减少的内压下。这个鼓转到液体中进行
过滤，它的连续转动使滤饼层进行重要的后续操作，如图6.1
所示。为了避免在过滤器表面形成生物体增加过滤的抗性，
这种过滤器常常fitted with a knife discharge，像图中所描绘
的；if a mycelium which forms a coherent carpet is being seperated, it can be lifted from the filter by strings.常预先用
助滤剂覆盖（precoate ） 鼓，有助于防止阻塞并且保持一个
恒定的压力降。最主要的优点是以最小的升温、低的动力消耗及将过滤与洗涤和部分去水（dewatering ）相结合而有效
过滤；但是助滤剂被过滤掉的物质所污染是一个严重的缺
点。也可以使用在正压下操作的旋转过滤器。而带式过滤器
（belt filter ）是对原理明显的改动，非常适于需要大量洗涤
的易过滤的沉淀物。带式过滤器可以与a press 结合以促进除水。
6.2.2 离心
细菌往往由于太小而不能由简单的过滤基质进行分离，
但通过离心进行分离也是困难的因为粒子与悬浮液之间密
度的微小差异。经常采用离心分离蛋白质沉淀也有类似的困难。离心机的效果可以特征表达为：（方程式）
在表达式中，Q =体积进料速率、d =粒子直径、Δρ=密度差、
g =重力加速度、F =沉淀面积、η=黏度、R =radius、ω=角速
度及n =每分钟的转速。
公式∑=FZ 在比较不同的离心机的时候是有用的。因为
F 随着转子旋转（axial ）长度的增加而增加，而Z 随着转子
的直径和速度增加而增加，通过采用长转子（F ）或者快的、
宽转子（Z ）可以改进分离效果；可获得的Z 值受到结构材
料的限制。图6.2 列出了一些转子的安排方式，不同安排方
式的关键特点总结在表6.3中。所有的设计都有单独的缺点，
添加上成本（包括维护）、动力消耗及温度升高（除过结合
冷冻）这些总体缺点。
6.2.3 絮凝和浮选
既然细菌的微小细胞大小使从fermentation broth 中对
它们进行回收变得非常困难，甚至通过离心的方法，那么可以采用絮凝实现一种改进；粒子的沉淀速率随着粒子直径的
增大而增大（Stokes ’s 法则）。絮凝可以是可逆的，如果细
胞表面的电荷能够被相反电荷的离子中和，也可以是不可逆
的，如果带电的多聚分子在细胞之间形成桥。因此絮凝剂就
包括无机盐、矿物水胶体、有机polyelectrolytes. 除了取决于
絮凝剂的选择，絮凝作用还取决于这样的其他一些因素如细
胞的性质（生理年龄）、离子环境、温度及表面shear stress。
如果没有形成一个足够紧密的絮凝物，那么可以采用浮
选的方法，在这个过程中小的气泡吸收并进入到微生物中。这种分离取决于气泡的大小；气体可以鼓泡产生或者（更好
的）非常精致的气泡可以由溶解的气体释放过多的压力来产
生或者通过电解作用。不可溶的 “收集物质”如长链脂肪酸或
者胺可以促使一个稳定的肥皂泡的形成，而且收集在肥皂泡
层的粒子能被除去。在某些情况下，絮凝和浮选的联合使用
非常有效地用于回收生物体。
6.3 细胞破碎
6.3.1 微生物
由于细胞壁的强度和高的内在渗透压，破碎微生物常常是困难的；粒子太小而不能采用简单的机械手段如碾碎而获得必要的强力。同时，细胞破碎不能破坏所需要的细胞组分，
但通常所作的要求是矛盾的。分解微生物的方法总结于图
6.3中。它们的作用效果通常以破碎的细胞的悬浮液中回收
的细胞酶的活性水平来证实（assessed ），与以破坏程度衡量破坏效率相结合。
机械方法
机械方法采用的是shear （在球磨机、胶磨机中搅碎）、压力和释放压力（匀浆机）及超声波。一种广泛使用的方法
是采用高压紧接着突然的解压，是由细胞悬浮液流经fine
nozzle 管口的结果。其中的一种处理方法如图6.4所示。这
里，破碎是由hydrodynamic shear 和空穴现象导致的。超
声波主要通过空穴现象而作用，但主要用于实验室，因为在
大规模中，热量的除去是困难的。
也可以采用加热、化学或者酶方法来破坏细胞。其中一种广
泛使用的方法就是干燥，它引起细胞壁结构的变化而且常常
可以用缓冲液或者盐溶液对细胞物质进行后续提取；一个著
名的程序就是将细胞导入过量的冷丙酮中以制备“丙酮粉”。
通过化学方法可以引起细胞裂解，如盐或者表面活性剂、或
者渗透压冲击、或者采用合适的裂解酶，现在可利用的裂解
酶的种类非常多而且可以与所要处理的微生物的具体性质
相匹配。采用所有的方法并进行比较，细胞破碎后活性细胞
酶的回收效果经酶处理和超声波处理为最好；加热或者渗透
方法次之，而机械法破碎通常效果最差。
6.3.2 植物和动物细胞
来自动物组织或者植物的细胞通常不稳定且更容易通过机械方法破碎。如果物质首先经过冷冻，就可采用额外的shear 方法，而合适的酶就可以帮助从动物或者植物中进行
提取。在技术上，人们非常关注通过合适的裂解酶（纤维素
和半纤维素）处理来提高所有植物提取量而不是传统的提取
方法。
6.4 提取方法
当用于生物产品时，提取同时具有分离和浓缩的作用。
对于回收亲脂性物质尤为有用，不管这些物质最初是胞外的
还是通过对细胞的合适处理而释放出来的。含有目标物的溶
液或者甚至是悬浮液与不相溶的 溶剂相混合，产物在这个
溶剂中是更易溶解的而且更容易进行特异回收。物质在这两相中的分配由它的特征分配系数K 控制：
K =A相中物质的浓度/B相中物质的浓度 …to be.. 然而，任何实际的提取过程的系数还取决于达平衡时两相的
萃取的效率较高；而当欲差别地萃取某一种组分，而非其他
组分时，则反萃取必能提高选择性。这样，液－液萃取可以
单步进行（如果分配系数是非常理想的），通过多步顺流萃
取或者逆流萃取（最复杂的处理过程但是能够很好的处理混
合物）。
在回收抗生素时，溶剂萃取是在除去细胞或者细胞碎片
后的早期步骤。全发酵液的萃取也可采用萃取－倾析器，萃
取柱或者用到离心机的混合澄清器。图6.5示例了一个从发
酵液中回收抗生素的全发酵液提取过程。
全发酵液回收方法明显的减少了回收步骤，这样应该会
减少步步损失尽管萃取过程由于细胞的存在会被削弱impaired 。减少了产物滞留于水溶液相中的时间，在水相中
产物的降解是非常快的，这也是一个优点。 从细胞或者细胞碎片中分离酶可以采用水溶液多相系统进行萃取。细胞碎片和酶分配在水溶液的聚乙二醇－葡聚
糖混合物中，其形成分离相且因此可以容易的分离开。这个
方法避免了在离心过程中出现的一些困难（小粒子尺寸dimension ）而且产量高。
6.5 浓缩方法
生物加工过程中形成的低浓度产物通过初始分离步骤
而被浓缩，如在萃取过程（见上），但一般在经济纯化之前
必须进一步浓缩。又由于许多产物的脆弱性，对它们浓缩的
方法必须非常温和。一些适宜的方法包括：
● 萃取（已经考虑到了）
● 蒸发
● 膜处理过程
● 离子交换法
吸收法
6.5.1 蒸发
蒸发常用于溶剂提取所得到的溶液，在这种情况下，小心的处理以回收蒸发的溶剂是必要的；因为蒸发产生高的特殊的热量，当用于水溶液制备物时，需要更为关键的处理。某种喷雾干燥的方法。
物质中不稳定的产物进行浓缩；在降膜falling film 蒸发器
中，热交换器更好，基于大的热交换表面，它使得在加热介
质与溶液之间产生最小的温度差。滞留时间 are in the order
of a minute. In thin-film evaporators, 薄层是通过机械方法
形成的且非常湍流的；热交换器是非常有效的，而且这些蒸
发器可以用于浓缩黏性液体，甚至浓缩至干燥的产品。在离
心式薄膜蒸发器thin-film evaporators 中，蒸发是在旋转转
6.5.2 膜过滤
膜过滤是一种多功能的程序，可以用于富集和分离不同
的分子或者粒子。Under hydrostatic pressure流体静压, 如
果采用的压力超过溶液的渗透压，那么粒子就可以通过某种
适宜的膜，渗透压驱动浓溶液中的溶剂流向更稀的溶液。在
…due to..
超滤中，膜可以看作一个筛网（microporous 膜） 它的孔
的大小控制着分离，但是这种简单的模型不能用于反渗透，
在反渗透过程中，相似大小的分子仍然是分离的。这依赖于
分散及分子与膜材料之间的相互作用。图6.4给出了应用膜
过滤过程的例子。 为了获得高的流速，通常采用不对称膜，它具有由一种coarser 海绵状结构机械支持的紧密的薄膜层。超滤过程中
出现的最严重的问题之一是“浓差极化”现象。在膜高浓度的
一面，溶液的浓度随着靠近膜而增加，而在膜的另一面为零。
这导致形成“次级膜”作用，具有不同的flux 和分离特性。与在错流过滤中一样，尽管不能完全用经过膜表面高的流速来消除这种作用，但是可以减少，采用高的泵速包括湍流或者
对高速层流装配 thin channels 。典型的装置如图6.6和图
6.7。
微滤可以取代过滤以从发酵液中分离细胞或者甚至是特定的代谢产物；封闭的系统便于无菌操作，而在必要的时候也便于进行限制。
6.5.3 离子交换和吸附树脂
使用吸附剂从发酵液中回收产物是一种长期所采用大
方法，最初基于活性炭的使用。这种方法经过单一的步骤就
会产生非常大的浓缩效应，而且由于可以采用大范围的较特
异的吸附剂，所以被越来越多的采用。例如，在研究
新的抗生素回收方法中，exploration 探测常常是初始步骤之一。
离子交换树脂
离子交换树脂是带有紧密连接的可离子化基团的多聚物，离子基团根据选择可以是阳离子或者是阴离子，而且根据环境条件可以是离子形式或者为非离子形式。
可采用的类型列于表6.5中；固体离子交换剂可以采用分配加入，然后通过倾析除去，或者采用柱程序使用。涉及这种离子交换柱的色谱分离将在下面的6.6.2部分中讨论。
液体离子交换剂通过相似的原理进行操作，但是可离子化的物质之溶液非水溶剂载体中；然后通过液－液萃取进行分离。不管是哪种情况，目标物质通过离子解离从离子交换剂上回收，然后对离子交换剂进行再生。
在合适的情况下，抗生素可以从全发酵液中进行回收，在分批式发酵中相对于澄清发酵液而选择采用离子交换树脂。
吸附树脂 这些树脂提供了与不能混合的液体溶剂有相似特性的固体相，因此可以用于萃取过程。现在，有大范围这样的树脂可以使用，将它们重要的特性总结在表6.6中。该树脂是孔状的多聚物载体，其功能基团，如果是任易的一种，修饰载体的总体极性，不离子化。多数化合物处于非解离状态 通
常从水溶液中被吸附；通过有机溶剂萃取或者改变溶液相的pH 或离子强度而对它们进行回收。吸附树脂的孔隙度是重要的，因为孔隙度决定了可进行吸附的表面积，从而决定了树脂的吸附容量。
6.6 混合物的纯化和分解 在设计的合适的过程顺序中，产物的回收和浓缩已经伴有某些程度的纯化。然而，进一步纯化产物的需求通常存在，尤其是当目标产品伴随有重要的相似的副代谢物的时候，这些副代谢物常常可以通过早期的回收步骤。因此，在纯化时将要面对的清况也许需要高度的分解或者也许不需要。两种常被使用的方法是结晶和各种色谱操作；结晶更容易进行放大，但是色谱方法有助于混合物更好的分解。
6.6.1 结晶
结晶主要用于纯化低分子量化合物，如抗生素。例如，常采用丁酸乙酯butyl acetate从发酵液中提取青霉素G ，并通过添加乙醇溶液中的乙酸钾potassium acetate进行结晶。图6.8是采用相似的顺序分离和纯化放线菌素的过程。结晶开始于50℃下在乙酸乙酯ethyl acetate 中浓缩某一溶液，通过向溶液中添加轻汽油直到溶液变得浑浊，；将溶液加热到65℃然后冷却。 在一个更大的规模中，结晶是纯化柠檬酸和次谷氨酸盐这种产品的最后步骤。
6.6.2 色谱方法
色谱方法用于低分子量的化合物（ 如同源抗生素），需要重溶混合物resolution ，及巨大分子尤其是酶，产物有着及其相似的性质。必要的设备是柱子，填充有载体材料，通常是粒子， 储备和泵系统for 洗脱液，有选择的收集洗脱组分。
根据具体的分离问题，柱子的比例可以变动，从相对高的窄的柱子到短的宽的柱子；一个例子是pharmacia segment column，这个柱子是由不锈钢构建的。为了获得最大处理量，采用大小均匀的微粒；柱的填充常常受到在分离的罐中混合吸附剂与溶剂系统的影响，如果需要在减少的压力下除气，然后以稠的糊状物传递到柱子中。某些物质尤其是在分子筛层析中使用的那些物质，当用缓冲液与有机溶剂平衡或者用不同离子强度的缓冲液平衡（ 盐梯度洗脱）的时候，体积发生变化，然后必须固定到柱子中采用可调节的end-plate 。柱子可以进行向上和向下流动操作，通常安装有泵输入的液体的流动计和一个输入压力控制装置。在柱子的两端安装无菌滤纸是所需要的，以消除细菌的污染和可能的产物破坏。
通常情况下需要控制每一阶段从柱子上被洗脱下来的组分，如遵照洗脱液在254nm 和280nm 处的紫外吸收分别是核酸和蛋白质；缓冲液梯度通过衡量电导性来控制，或者
在极端情况下，安装自动分析仪旁路途径来控制。为了分开已分离的产物需要某些形式的部分收集器，而且对于使用有机溶剂的大规模分离过程，this must be a flame-proof installation in an explosion-proof room.
不同的层析过程可以按下列区分为：
● 吸附
● 离子交换
● 凝胶过滤
● 疏水
● 亲和
● 共价
● 分配
这些层析的特性描述如下。 分离产物依据的是它们对固体介质表面不同的吸附性，可以是无机载体如硅胶、氧化铝或者羟基磷灰石，也可以是有机多聚物。 可溶或交联的多糖（纤维素，琼脂糖），离子功能基团吸附到上面。它对巨型分子的分解高；图6.9给出了分解复杂的蛋白质混合物的例子。这个所示的是生产规模的人血浆蛋白的分离，通过联合离子交换层析第4，6步与凝胶过滤第2，9步。
“分子筛”效应的，即一种中性的交联载体其有确定的孔大小以进行分子的分离。大于最大孔的分子不能进入到介质内部而直接通过柱子；小一些的分子进入载体内部并被保留；这样分散到孔中是由于孔大小的作用，所以保留的分子就可以按照分子大小减小的顺序洗脱下来。
与分子量范围从几百到百万或者更大相对应，就需要大范围的可控孔大小的载体；它们通常由线性多聚物产生（葡聚糖、琼脂糖），受交联度的控制。这些一般在溶液系统中使用，凝胶过滤液可以用于多肽或者蛋白质溶液的除盐。引入相对疏水基团的分子筛可以在有机溶剂中使用，以相同的方式分离亲脂性物质。 具有不同疏水性的分子可以在含有疏水基团的载体上得到分离。因此，许多酶和其他蛋白质具有疏水区域，该区域积累中性氨基酸（如缬氨酸、苯丙氨酸），将与连接有不同长度酰基的载体发生不同程度的相互作用。 利用更专一的相互作用进行分离；在固体支持物载体上连接上一种特定的结构，并且与欲分离的化合物发生特异的相互作用。分离原理如图6.10所示。特异性效应物如酶的抑制剂（I ）固定在不溶于水的载体上（C ），载体被填充到一个柱子中。引入含有不同酶（E 1、E 2、E 3、E 4…. ）的复杂混合物的中性缓冲液，当E 1被抑制剂I 复杂化，所有剩下的酶通过柱子。采用不同pH 的缓冲液，现在，酶E 1就可
以选择性的从柱子上洗脱下来。可以分离的典型的特异性效应物与互补分子包括：
酶/酶的抑制剂（或反之亦然）
抗体/抗原或者半抗原（or vice versa）
外源凝集素/糖蛋白或多糖
核酸/互补碱基序列
激素/受体
维生素/载体蛋白
等等
这种类型的分离依赖于相同的高特异性相互作用，这种作用调控着生物过程。例如，脱氢酶根据它们与辅酶的特异性作用采用带有键合的NAD +的琼脂糖载体可以进行分离。可以利用抗原/抗体反应：例如经过带有固定的单克隆抗体的琼脂糖层析，人白细胞介素以高产量且高纯度形式得到回收。显而易见，这种固定的特异性效应物的成本是非常高的，应该多次循环使用。
为了制备特异性固定物，载体如琼脂糖凝胶in head form 要被活化，例如通过与溴化氢反应，然后当连接的是小分子的时候如辅酶，就可以直接进行连接，或者当要连接的是较大的效应物分子的时候通过“手臂”分子进行连接。 以相似的方式采用低特异性的“化学”相互作用；例如，带有二羟硼基的多聚物可以分离糖蛋白
和核苷酸因为在硼酸和1,2－diols 之间可以形成可逆的复合物。 是一种微小的变化，利用固定的功能基团与欲纯化的物质之间形成可逆的共价键；特别是，硫醇化的多聚物可以用来分离含有SH-的蛋白质因为形成可逆的二硫化物。
6.7 干燥
生物产品的干燥在多数情况下作为最后的处理方法，通过干燥使产物形成稳定的形式以适于处理和储存；多数生物产品的热敏性意味着只能采用的方法是以最小的升温而除去水分。在某些情况下，产物如酶或者药物制品的热稳定性
为了以蒸汽的形式除去水分，必须传递热量而且需要严格控制条件以确保温度的升高在可以忍受的范围内，温度的升高是由于热量输入的速率与潜在的 heat equivalent of蒸发速率间的平衡而导致的。热量的传递受传导、对流、或者辐射的影响或者这些作用的联合影响。表6.7示例了三种最重要的干燥方法和它们的操作条件。为了得到完整的信息，读者需要参考标准手册；这里，我们只概括的介绍一下最重要的技术。 应用于分批式模式在间隔式干燥机中进行，或者连续模式象在旋转鼓式真空干燥机中进行。热量的传递主要通过与加热的表面接触而产生，而且当液体相浓度更高时应
当考虑其特点的变化。 提供了关于对流方法的最重要的例子，在这个方法中，热量的传递、产物的运动及蒸汽的去除均受到气流的影响。在连续操作中可以处理大的量。欲干燥的液体用作溶液或者浆且被nozzle 或者旋转的碟片雾化。热气流（150－250℃）引起迅速的蒸发以至于粒子的温度仍处于很低的状态。喷雾干燥可以用于干燥酶和抗生素，而且当其他存在的物质是无害的时候，它可以用于干燥全发酵液，例如清洁剂级的detergent-grade 酶和饲料级的feed-grade 抗生素。这种方法也广泛应用于食品工业。
是最温和的干燥方法，因为水分从冷冻的物质而升华。为了水蒸气的升华，大约每kg 水需要将680kcal 热量传递到升华的表面，通过加热金属板的传导或者表面辐射：促进快速升华、维持非常低的压力而且通过低温浓缩要将蒸汽除去。通过控制干燥室中的压力来调节固体温度，测量被干燥物质的电导率为物质中存在的任何液态水的检测提供了一种非常灵敏的检测方法。
许多药物产品是冷冻干燥的，如病毒、疫苗、血浆、激素及酶制品，还有不稳定的而且高成本的诊断试剂；同时，在食品工业中，这种技术大规模的应用是重要的。
第六章 生物工程中的下游加工（技术）
6.1前言
“下游加工（技术）” 对于从任何工业化生产中回收有用产品所需要的所有步骤来说是一个有用的词语。对于生物工程特别重要，我们想要的最终形式的产物常常非常远的从最先在生物反应器中获得的状态除去。例如，一个典型的发酵
过程是一个分散的固体（细胞、也许有营养培养基的某些组
分等）与稀释水溶液的混合物；所想要的产物也许作为一种
非常复杂的混合物的组分存在于细胞中，或者存在于稀释的
培养基溶液中，或甚至两者中都有。任何情况下，这个产品的回收、浓缩和纯化都需要有用并有效的操作，这也受生产经济性的限制。任何特殊的要求，如需要除去污染物或限制生产微生物（process organism）都只会增加困难。
许多实验室中的标准操作在生产中都是不实用或者不经
济的。而且，生物产品常常是非常脆弱（labile 物，其活性结构只能在限定并有限的pH 要用到所有可用的科学方法以发挥最佳的效果就需要更多
的创造性。也明显的是，没有一种独特的、理想的、普遍适
用的操作或者仅是操作顺序可以推荐；对一个特定的问题应
当以最适宜的方式把单个单元操作结合起来。 垂悬分词
6.2 粒子的分离
在发酵终点，多数情况下第一步是将固体（通常是细胞，
但也可以是在一个特定支持物上的细胞或者酶，不包括反应
培养基固体组分）从几乎一直是水溶液的连续均匀的液体系
统中分离出来。与这个分离相关的一些细胞特性列于表6.1；
注意，细胞的比重不比fermentation broth 大很多。细胞的
大小也给细菌带来了困难，但是比较大的细胞更容易分离，有时候甚至只需要简单的定位于倾析器。分离的容易性取决
于fermentation broth的性质，它的pH 、温度等等，在许多
情况下，通过添加助滤剂、絮凝剂的等等进行改进（见后面）。
表6.2给出了分离方法的大体分类。
6.2.1 过滤
这个是分离filamentous fungi 和fermentation broth 中
的filamentous bacteria（例如，链霉菌）所使用的最广泛和
最典型的方法。它也可以用于酵母絮凝物的分离。根据机理，过滤可以采用表面过滤或者深层过滤；或者离心过滤；所有情况下的驱动力都是压力，由超压产生或者由真空产生。
过滤的速率，如在一定时间内收集的滤液的体积，是过
滤面积、液体的黏度和通过过滤基质的压力降以及
（deposited filter cake）沉积的滤饼的作用。过滤基质与滤
饼filter cake的抗性( resistance) 因此是关键的，决定了它
的可压性（compressibility ）。对于不可压的filter cake滤饼，
过滤速率与压力无关，但是多数生物材料是可压的，所以滤
饼的抗性随着时间而增大而与过滤和滤饼形成过程中增大
的总体抗性无关。 错流过滤实现了过滤流的巨大的改进，在错流过滤中，固体不经过过滤器而通过跨膜的湍流保持悬浮状态。这可以通过安排悬浮物流经膜来实现或者通过在过滤器中固定移
动的blades or impellor来实现。简单的平板过滤广泛用于液体的澄清，也可以用于过滤少量的悬浮物，但是它们的载量
是有限的；有时使用filer-press assemblies 尤其对于分批操作。
旋转鼓式真空过滤器大概是从fermentation broth 分离
微生物最为广泛使用的装置；在这些过滤器中，过滤部分是一个旋转的鼓维持在减少的内压下。这个鼓转到液体中进行
过滤，它的连续转动使滤饼层进行重要的后续操作，如图6.1
所示。为了避免在过滤器表面形成生物体增加过滤的抗性，
这种过滤器常常fitted with a knife discharge，像图中所描绘
的；if a mycelium which forms a coherent carpet is being seperated, it can be lifted from the filter by strings.常预先用
助滤剂覆盖（precoate ） 鼓，有助于防止阻塞并且保持一个
恒定的压力降。最主要的优点是以最小的升温、低的动力消耗及将过滤与洗涤和部分去水（dewatering ）相结合而有效
过滤；但是助滤剂被过滤掉的物质所污染是一个严重的缺
点。也可以使用在正压下操作的旋转过滤器。而带式过滤器
（belt filter ）是对原理明显的改动，非常适于需要大量洗涤
的易过滤的沉淀物。带式过滤器可以与a press 结合以促进除水。
6.2.2 离心
细菌往往由于太小而不能由简单的过滤基质进行分离，
但通过离心进行分离也是困难的因为粒子与悬浮液之间密
度的微小差异。经常采用离心分离蛋白质沉淀也有类似的困难。离心机的效果可以特征表达为：（方程式）
在表达式中，Q =体积进料速率、d =粒子直径、Δρ=密度差、
g =重力加速度、F =沉淀面积、η=黏度、R =radius、ω=角速
度及n =每分钟的转速。
公式∑=FZ 在比较不同的离心机的时候是有用的。因为
F 随着转子旋转（axial ）长度的增加而增加，而Z 随着转子
的直径和速度增加而增加，通过采用长转子（F ）或者快的、
宽转子（Z ）可以改进分离效果；可获得的Z 值受到结构材
料的限制。图6.2 列出了一些转子的安排方式，不同安排方
式的关键特点总结在表6.3中。所有的设计都有单独的缺点，
添加上成本（包括维护）、动力消耗及温度升高（除过结合
冷冻）这些总体缺点。
6.2.3 絮凝和浮选
既然细菌的微小细胞大小使从fermentation broth 中对
它们进行回收变得非常困难，甚至通过离心的方法，那么可以采用絮凝实现一种改进；粒子的沉淀速率随着粒子直径的
增大而增大（Stokes ’s 法则）。絮凝可以是可逆的，如果细
胞表面的电荷能够被相反电荷的离子中和，也可以是不可逆
的，如果带电的多聚分子在细胞之间形成桥。因此絮凝剂就
包括无机盐、矿物水胶体、有机polyelectrolytes. 除了取决于
絮凝剂的选择，絮凝作用还取决于这样的其他一些因素如细
胞的性质（生理年龄）、离子环境、温度及表面shear stress。
如果没有形成一个足够紧密的絮凝物，那么可以采用浮
选的方法，在这个过程中小的气泡吸收并进入到微生物中。这种分离取决于气泡的大小；气体可以鼓泡产生或者（更好
的）非常精致的气泡可以由溶解的气体释放过多的压力来产
生或者通过电解作用。不可溶的 “收集物质”如长链脂肪酸或
者胺可以促使一个稳定的肥皂泡的形成，而且收集在肥皂泡
层的粒子能被除去。在某些情况下，絮凝和浮选的联合使用
非常有效地用于回收生物体。
6.3 细胞破碎
6.3.1 微生物
由于细胞壁的强度和高的内在渗透压，破碎微生物常常是困难的；粒子太小而不能采用简单的机械手段如碾碎而获得必要的强力。同时，细胞破碎不能破坏所需要的细胞组分，
但通常所作的要求是矛盾的。分解微生物的方法总结于图
6.3中。它们的作用效果通常以破碎的细胞的悬浮液中回收
的细胞酶的活性水平来证实（assessed ），与以破坏程度衡量破坏效率相结合。
机械方法
机械方法采用的是shear （在球磨机、胶磨机中搅碎）、压力和释放压力（匀浆机）及超声波。一种广泛使用的方法
是采用高压紧接着突然的解压，是由细胞悬浮液流经fine
nozzle 管口的结果。其中的一种处理方法如图6.4所示。这
里，破碎是由hydrodynamic shear 和空穴现象导致的。超
声波主要通过空穴现象而作用，但主要用于实验室，因为在
大规模中，热量的除去是困难的。
也可以采用加热、化学或者酶方法来破坏细胞。其中一种广
泛使用的方法就是干燥，它引起细胞壁结构的变化而且常常
可以用缓冲液或者盐溶液对细胞物质进行后续提取；一个著
名的程序就是将细胞导入过量的冷丙酮中以制备“丙酮粉”。
通过化学方法可以引起细胞裂解，如盐或者表面活性剂、或
者渗透压冲击、或者采用合适的裂解酶，现在可利用的裂解
酶的种类非常多而且可以与所要处理的微生物的具体性质
相匹配。采用所有的方法并进行比较，细胞破碎后活性细胞
酶的回收效果经酶处理和超声波处理为最好；加热或者渗透
方法次之，而机械法破碎通常效果最差。
6.3.2 植物和动物细胞
来自动物组织或者植物的细胞通常不稳定且更容易通过机械方法破碎。如果物质首先经过冷冻，就可采用额外的shear 方法，而合适的酶就可以帮助从动物或者植物中进行
提取。在技术上，人们非常关注通过合适的裂解酶（纤维素
和半纤维素）处理来提高所有植物提取量而不是传统的提取
方法。
6.4 提取方法
当用于生物产品时，提取同时具有分离和浓缩的作用。
对于回收亲脂性物质尤为有用，不管这些物质最初是胞外的
还是通过对细胞的合适处理而释放出来的。含有目标物的溶
液或者甚至是悬浮液与不相溶的 溶剂相混合，产物在这个
溶剂中是更易溶解的而且更容易进行特异回收。物质在这两相中的分配由它的特征分配系数K 控制：
K =A相中物质的浓度/B相中物质的浓度 …to be.. 然而，任何实际的提取过程的系数还取决于达平衡时两相的
萃取的效率较高；而当欲差别地萃取某一种组分，而非其他
组分时，则反萃取必能提高选择性。这样，液－液萃取可以
单步进行（如果分配系数是非常理想的），通过多步顺流萃
取或者逆流萃取（最复杂的处理过程但是能够很好的处理混
合物）。
在回收抗生素时，溶剂萃取是在除去细胞或者细胞碎片
后的早期步骤。全发酵液的萃取也可采用萃取－倾析器，萃
取柱或者用到离心机的混合澄清器。图6.5示例了一个从发
酵液中回收抗生素的全发酵液提取过程。
全发酵液回收方法明显的减少了回收步骤，这样应该会
减少步步损失尽管萃取过程由于细胞的存在会被削弱impaired 。减少了产物滞留于水溶液相中的时间，在水相中
产物的降解是非常快的，这也是一个优点。 从细胞或者细胞碎片中分离酶可以采用水溶液多相系统进行萃取。细胞碎片和酶分配在水溶液的聚乙二醇－葡聚
糖混合物中，其形成分离相且因此可以容易的分离开。这个
方法避免了在离心过程中出现的一些困难（小粒子尺寸dimension ）而且产量高。
6.5 浓缩方法
生物加工过程中形成的低浓度产物通过初始分离步骤
而被浓缩，如在萃取过程（见上），但一般在经济纯化之前
必须进一步浓缩。又由于许多产物的脆弱性，对它们浓缩的
方法必须非常温和。一些适宜的方法包括：
● 萃取（已经考虑到了）
● 蒸发
● 膜处理过程
● 离子交换法
吸收法
6.5.1 蒸发
蒸发常用于溶剂提取所得到的溶液，在这种情况下，小心的处理以回收蒸发的溶剂是必要的；因为蒸发产生高的特殊的热量，当用于水溶液制备物时，需要更为关键的处理。某种喷雾干燥的方法。
物质中不稳定的产物进行浓缩；在降膜falling film 蒸发器
中，热交换器更好，基于大的热交换表面，它使得在加热介
质与溶液之间产生最小的温度差。滞留时间 are in the order
of a minute. In thin-film evaporators, 薄层是通过机械方法
形成的且非常湍流的；热交换器是非常有效的，而且这些蒸
发器可以用于浓缩黏性液体，甚至浓缩至干燥的产品。在离
心式薄膜蒸发器thin-film evaporators 中，蒸发是在旋转转
6.5.2 膜过滤
膜过滤是一种多功能的程序，可以用于富集和分离不同
的分子或者粒子。Under hydrostatic pressure流体静压, 如
果采用的压力超过溶液的渗透压，那么粒子就可以通过某种
适宜的膜，渗透压驱动浓溶液中的溶剂流向更稀的溶液。在
…due to..
超滤中，膜可以看作一个筛网（microporous 膜） 它的孔
的大小控制着分离，但是这种简单的模型不能用于反渗透，
在反渗透过程中，相似大小的分子仍然是分离的。这依赖于
分散及分子与膜材料之间的相互作用。图6.4给出了应用膜
过滤过程的例子。 为了获得高的流速，通常采用不对称膜，它具有由一种coarser 海绵状结构机械支持的紧密的薄膜层。超滤过程中
出现的最严重的问题之一是“浓差极化”现象。在膜高浓度的
一面，溶液的浓度随着靠近膜而增加，而在膜的另一面为零。
这导致形成“次级膜”作用，具有不同的flux 和分离特性。与在错流过滤中一样，尽管不能完全用经过膜表面高的流速来消除这种作用，但是可以减少，采用高的泵速包括湍流或者
对高速层流装配 thin channels 。典型的装置如图6.6和图
6.7。
微滤可以取代过滤以从发酵液中分离细胞或者甚至是特定的代谢产物；封闭的系统便于无菌操作，而在必要的时候也便于进行限制。
6.5.3 离子交换和吸附树脂
使用吸附剂从发酵液中回收产物是一种长期所采用大
方法，最初基于活性炭的使用。这种方法经过单一的步骤就
会产生非常大的浓缩效应，而且由于可以采用大范围的较特
异的吸附剂，所以被越来越多的采用。例如，在研究
新的抗生素回收方法中，exploration 探测常常是初始步骤之一。
离子交换树脂
离子交换树脂是带有紧密连接的可离子化基团的多聚物，离子基团根据选择可以是阳离子或者是阴离子，而且根据环境条件可以是离子形式或者为非离子形式。
可采用的类型列于表6.5中；固体离子交换剂可以采用分配加入，然后通过倾析除去，或者采用柱程序使用。涉及这种离子交换柱的色谱分离将在下面的6.6.2部分中讨论。
液体离子交换剂通过相似的原理进行操作，但是可离子化的物质之溶液非水溶剂载体中；然后通过液－液萃取进行分离。不管是哪种情况，目标物质通过离子解离从离子交换剂上回收，然后对离子交换剂进行再生。
在合适的情况下，抗生素可以从全发酵液中进行回收，在分批式发酵中相对于澄清发酵液而选择采用离子交换树脂。
吸附树脂 这些树脂提供了与不能混合的液体溶剂有相似特性的固体相，因此可以用于萃取过程。现在，有大范围这样的树脂可以使用，将它们重要的特性总结在表6.6中。该树脂是孔状的多聚物载体，其功能基团，如果是任易的一种，修饰载体的总体极性，不离子化。多数化合物处于非解离状态 通
常从水溶液中被吸附；通过有机溶剂萃取或者改变溶液相的pH 或离子强度而对它们进行回收。吸附树脂的孔隙度是重要的，因为孔隙度决定了可进行吸附的表面积，从而决定了树脂的吸附容量。
6.6 混合物的纯化和分解 在设计的合适的过程顺序中，产物的回收和浓缩已经伴有某些程度的纯化。然而，进一步纯化产物的需求通常存在，尤其是当目标产品伴随有重要的相似的副代谢物的时候，这些副代谢物常常可以通过早期的回收步骤。因此，在纯化时将要面对的清况也许需要高度的分解或者也许不需要。两种常被使用的方法是结晶和各种色谱操作；结晶更容易进行放大，但是色谱方法有助于混合物更好的分解。
6.6.1 结晶
结晶主要用于纯化低分子量化合物，如抗生素。例如，常采用丁酸乙酯butyl acetate从发酵液中提取青霉素G ，并通过添加乙醇溶液中的乙酸钾potassium acetate进行结晶。图6.8是采用相似的顺序分离和纯化放线菌素的过程。结晶开始于50℃下在乙酸乙酯ethyl acetate 中浓缩某一溶液，通过向溶液中添加轻汽油直到溶液变得浑浊，；将溶液加热到65℃然后冷却。 在一个更大的规模中，结晶是纯化柠檬酸和次谷氨酸盐这种产品的最后步骤。
6.6.2 色谱方法
色谱方法用于低分子量的化合物（ 如同源抗生素），需要重溶混合物resolution ，及巨大分子尤其是酶，产物有着及其相似的性质。必要的设备是柱子，填充有载体材料，通常是粒子， 储备和泵系统for 洗脱液，有选择的收集洗脱组分。
根据具体的分离问题，柱子的比例可以变动，从相对高的窄的柱子到短的宽的柱子；一个例子是pharmacia segment column，这个柱子是由不锈钢构建的。为了获得最大处理量，采用大小均匀的微粒；柱的填充常常受到在分离的罐中混合吸附剂与溶剂系统的影响，如果需要在减少的压力下除气，然后以稠的糊状物传递到柱子中。某些物质尤其是在分子筛层析中使用的那些物质，当用缓冲液与有机溶剂平衡或者用不同离子强度的缓冲液平衡（ 盐梯度洗脱）的时候，体积发生变化，然后必须固定到柱子中采用可调节的end-plate 。柱子可以进行向上和向下流动操作，通常安装有泵输入的液体的流动计和一个输入压力控制装置。在柱子的两端安装无菌滤纸是所需要的，以消除细菌的污染和可能的产物破坏。
通常情况下需要控制每一阶段从柱子上被洗脱下来的组分，如遵照洗脱液在254nm 和280nm 处的紫外吸收分别是核酸和蛋白质；缓冲液梯度通过衡量电导性来控制，或者
在极端情况下，安装自动分析仪旁路途径来控制。为了分开已分离的产物需要某些形式的部分收集器，而且对于使用有机溶剂的大规模分离过程，this must be a flame-proof installation in an explosion-proof room.
不同的层析过程可以按下列区分为：
● 吸附
● 离子交换
● 凝胶过滤
● 疏水
● 亲和
● 共价
● 分配
这些层析的特性描述如下。 分离产物依据的是它们对固体介质表面不同的吸附性，可以是无机载体如硅胶、氧化铝或者羟基磷灰石，也可以是有机多聚物。 可溶或交联的多糖（纤维素，琼脂糖），离子功能基团吸附到上面。它对巨型分子的分解高；图6.9给出了分解复杂的蛋白质混合物的例子。这个所示的是生产规模的人血浆蛋白的分离，通过联合离子交换层析第4，6步与凝胶过滤第2，9步。
“分子筛”效应的，即一种中性的交联载体其有确定的孔大小以进行分子的分离。大于最大孔的分子不能进入到介质内部而直接通过柱子；小一些的分子进入载体内部并被保留；这样分散到孔中是由于孔大小的作用，所以保留的分子就可以按照分子大小减小的顺序洗脱下来。
与分子量范围从几百到百万或者更大相对应，就需要大范围的可控孔大小的载体；它们通常由线性多聚物产生（葡聚糖、琼脂糖），受交联度的控制。这些一般在溶液系统中使用，凝胶过滤液可以用于多肽或者蛋白质溶液的除盐。引入相对疏水基团的分子筛可以在有机溶剂中使用，以相同的方式分离亲脂性物质。 具有不同疏水性的分子可以在含有疏水基团的载体上得到分离。因此，许多酶和其他蛋白质具有疏水区域，该区域积累中性氨基酸（如缬氨酸、苯丙氨酸），将与连接有不同长度酰基的载体发生不同程度的相互作用。 利用更专一的相互作用进行分离；在固体支持物载体上连接上一种特定的结构，并且与欲分离的化合物发生特异的相互作用。分离原理如图6.10所示。特异性效应物如酶的抑制剂（I ）固定在不溶于水的载体上（C ），载体被填充到一个柱子中。引入含有不同酶（E 1、E 2、E 3、E 4…. ）的复杂混合物的中性缓冲液，当E 1被抑制剂I 复杂化，所有剩下的酶通过柱子。采用不同pH 的缓冲液，现在，酶E 1就可
以选择性的从柱子上洗脱下来。可以分离的典型的特异性效应物与互补分子包括：
酶/酶的抑制剂（或反之亦然）
抗体/抗原或者半抗原（or vice versa）
外源凝集素/糖蛋白或多糖
核酸/互补碱基序列
激素/受体
维生素/载体蛋白
等等
这种类型的分离依赖于相同的高特异性相互作用，这种作用调控着生物过程。例如，脱氢酶根据它们与辅酶的特异性作用采用带有键合的NAD +的琼脂糖载体可以进行分离。可以利用抗原/抗体反应：例如经过带有固定的单克隆抗体的琼脂糖层析，人白细胞介素以高产量且高纯度形式得到回收。显而易见，这种固定的特异性效应物的成本是非常高的，应该多次循环使用。
为了制备特异性固定物，载体如琼脂糖凝胶in head form 要被活化，例如通过与溴化氢反应，然后当连接的是小分子的时候如辅酶，就可以直接进行连接，或者当要连接的是较大的效应物分子的时候通过“手臂”分子进行连接。 以相似的方式采用低特异性的“化学”相互作用；例如，带有二羟硼基的多聚物可以分离糖蛋白
和核苷酸因为在硼酸和1,2－diols 之间可以形成可逆的复合物。 是一种微小的变化，利用固定的功能基团与欲纯化的物质之间形成可逆的共价键；特别是，硫醇化的多聚物可以用来分离含有SH-的蛋白质因为形成可逆的二硫化物。
6.7 干燥
生物产品的干燥在多数情况下作为最后的处理方法，通过干燥使产物形成稳定的形式以适于处理和储存；多数生物产品的热敏性意味着只能采用的方法是以最小的升温而除去水分。在某些情况下，产物如酶或者药物制品的热稳定性
为了以蒸汽的形式除去水分，必须传递热量而且需要严格控制条件以确保温度的升高在可以忍受的范围内，温度的升高是由于热量输入的速率与潜在的 heat equivalent of蒸发速率间的平衡而导致的。热量的传递受传导、对流、或者辐射的影响或者这些作用的联合影响。表6.7示例了三种最重要的干燥方法和它们的操作条件。为了得到完整的信息，读者需要参考标准手册；这里，我们只概括的介绍一下最重要的技术。 应用于分批式模式在间隔式干燥机中进行，或者连续模式象在旋转鼓式真空干燥机中进行。热量的传递主要通过与加热的表面接触而产生，而且当液体相浓度更高时应
当考虑其特点的变化。 提供了关于对流方法的最重要的例子，在这个方法中，热量的传递、产物的运动及蒸汽的去除均受到气流的影响。在连续操作中可以处理大的量。欲干燥的液体用作溶液或者浆且被nozzle 或者旋转的碟片雾化。热气流（150－250℃）引起迅速的蒸发以至于粒子的温度仍处于很低的状态。喷雾干燥可以用于干燥酶和抗生素，而且当其他存在的物质是无害的时候，它可以用于干燥全发酵液，例如清洁剂级的detergent-grade 酶和饲料级的feed-grade 抗生素。这种方法也广泛应用于食品工业。
是最温和的干燥方法，因为水分从冷冻的物质而升华。为了水蒸气的升华，大约每kg 水需要将680kcal 热量传递到升华的表面，通过加热金属板的传导或者表面辐射：促进快速升华、维持非常低的压力而且通过低温浓缩要将蒸汽除去。通过控制干燥室中的压力来调节固体温度，测量被干燥物质的电导率为物质中存在的任何液态水的检测提供了一种非常灵敏的检测方法。
许多药物产品是冷冻干燥的，如病毒、疫苗、血浆、激素及酶制品，还有不稳定的而且高成本的诊断试剂；同时，在食品工业中，这种技术大规模的应用是重要的。