CRISPR-Cas9植物基因敲除
试剂盒说明书
Cat. No. GP0138
Protocol No. PT140730-1 出版日期 July. 2014
南京市汉中门大街301号
南京国际服务外包产业园01栋13层A 座 电话：+86-25-66776700/66776718
传真：+86-25-66776701 邮编：210036
网址：www.genloci.com
目 录
I ．组份列表……………………………………………………………………………….. ……….…2 II ．产品概要…………………………………………………. ….……………………………. ………2 III ．操作步骤…………………………………………………….………………………………..…..3
1. 设计Oligo DNA 序列………………………………………………………………………..3 2. 线性化pP1C.2载体………………………………………………………………………... …3 3. 重组pP1C.2载体的构建………………………………………………………………... ……3 4. 重组pP1C.1载体的构建……………………………………………………………. ………..3 IV ．附录pP1C 系统质粒图谱……………..…………………….……. ………………...…………4-5 V ．参考文献…………………………………..……. ……………….…….…………..…...………6 图
Figure 1. CRISPR-Cas9工作原理示意图 Figure 2. pP1C.1质粒图谱 Figure 3. pP1C.2质粒图谱 表
Table1. CRISPR-Cas9植物基因敲除试剂盒组份列表
Protocol No. PT140730-1 www.genloci.com Genloci Biotechnologies Inc.
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I ． 组份列表
CRISPR-Cas9基因敲除试剂盒组份如下：
Table1. CRISPR-Cas9植物基因敲除试剂盒组份列表
组份列表
pP1C.1 Vector pP1C.2 Vector
含量 2μg 2μg
贮存条件
※注意：在收到货后，请您将pP1C.1 Vector 和pP1C.2 Vector瞬时离心后再保存。
将pP1C.1 Vector、pP1C.2 Vector置于-20℃保存，且避免污染；
II ．产品概要
CRISPR/Cas9植物基因敲除试剂盒是一款高效、精准的基因编辑试剂盒，它是基于最新代的人工核酸内切酶CRISPR-Cas9而研发的，相对于传统敲除技术和TALENs\ZFNs技术而言，其操作更加简便，敲除效率最高，基因的编辑更加的精准，大大降低了脱靶机率。CRISPR/Cas9植物基因敲除试剂盒能够适用于几乎所有植物细胞的基因修饰研究。
pP1C 系列载体是CRISPR/Cas9系统在植物中应用的载体，支持使用农杆菌介导进行的随机整合以及原生质体共转的瞬时表达系统。pP1C 载体系列中使用的Cas9基因及其核定位信号已经文献报道能够正常发挥其作用，并在水稻等植物中得到实践。限于CRISPR 系统中trancrRNA 的结构需要，以及pP1C 载体中结构限制，难以将所有元件置于一个载体中并使其易于操作，因此，每一套pP1C 载体至少包含两个载体，如pP1C.1、pP1C.2。
Genloci 公司为您提供完整的基因敲除解决方案，从敲除方案设计→敲除位点设计→载体构建→转染→敲除检测→结果分析，让您的实验一次成功！
Figure1. CRISPR-Cas9工作原理示意图
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III ．操作步骤
实验前，请您务必做好以下验证实验：
A ． 目的基因的表达情况分析，为防止因染色体缺失等情况导致靶基因缺失，首先需要PCR 扩增
靶基因，并对PCR 结果进行测序，确保靶基因的完整存在；其次，您还可以用RT-PCR 分析靶基因的活跃度。
1. 设计Oligo DNA序列
首先，您需要在靶标DNA 区域中设计一对20bp 左右的oligo DNA，您可以通过以下在线工具设计：
●麻省理工学院的
CRISPR Design：http://crispr.mit.edu/
E-Crisp ：www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html
●德国癌症研究中心的
引物合成模板：
上游：5’_GCAA（20bp 靶位点正向）_3’ 下游：3’_（20bp 靶位点反向）-CAAA_ 5’
其中上游的GCAA ，下游的CAAA 为Bbs I 酶切形成的粘性末端。 示例：
正链oligo ：GCAATGTACGGGAGGGACCCGTGC 负链oligo ：AAACCACGGGTCCCTCCCGTACAG
将设计后的序列送到值得信赖的公司合成，纯化级别为PAGE 。
2. 线性化pP1C.2载体
使用Bbs I 酶切pP1C.2（氨苄抗性）载体，回收3.2kb 的片段；
3. 重组pP1C.2载体的构建
将正负链oligos （100μM）等比例混合后，加热到95℃，3min ，自然冷却至40℃以下，制备得到双链DNA ；将双链DNA 与酶切纯化后的pP1C.2载体片段连接、转化大肠杆菌，构建得到重组pP1C.2载体。对重组载体进行测序，确认插入序列的正确性。
然后EcoR I 、Nhe I 双酶切重组载体pP1C.2，回收约520bp 的DNA 片段；
4. 重组pP1C.1载体的构建
使用EcoR I 、Xba I 双酶切pP1C.1（卡那霉素抗性）载体，回收载体片段；将步骤3中得到的520bp DNA片段与酶切后的pP1C.1进行T4 DNA酶连接，转化大肠杆菌， 得到重组载体pP1C.1，重组载体pP1C.1即为构建好的CRISPR-Cas9植物基因敲除载体。后续可进行重组载体pP1C.1转化农杆菌，农杆菌介导植物转化，筛选阳性克隆，测序验证，敲除效率检测及敲除序列比对分析等。
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IV ．附录pP1C 系列质粒图谱
Figure2. pP1C.1质粒图谱
pP1C.1部分序列（片段转移位置）
5’-……GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCAC ACAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC GTCGACC TGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTT ACC ……-3’
EcoR I位点：GAATTC Xba I 位点：TCTAGA
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CRISPR-Cas9植物基因敲除试剂盒
Figure3. pP1C.2质粒图谱
pP1C.2部分序列（靶点插入位置）
5’-……CATGAAGCCTTTCAGGACATGTATTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGGCTATCCACATAGATCAAAGCTGATTTAAAAGAGTTGTGCAGAT GATCCGTGGCA
TATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCC GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTC TGCAGTCGACGGTACCCGTTACA TAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTAACTAGAGA ……-3’
转录起始位点：A
双BbsI 位点：gggtcttcgagaagacct 绿色标示的序列：sgRNA （trancrRNA ） EcoR I位点：GAATTC Xba I 位点：TCTAGA
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V. 参考文献
1.
Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J.A., and Charpentie E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptiv bacterial immunity. Science, 2012,337: 816～821. 2.
Horvath P., Barrangou R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science , 2010, 327 (5962): 167～170. 3.
Hale CR, Zhao P., Olson S., et al. RNA-Guided RNA Cleavage by a CRISPR RNA-Cas Protein Complex. Cell , 2009, 139 (5): 945～956. 4. 5.
Zhang F., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science , 2013, 339(6121): 819～823 Westra ER., Swarts DC., Staals RH., Jore MM., Brouns SJ., van der Oost J. The CRISPRs, they are a-changin': how prokaryotes generate adaptive immunity. Annu Rev Genet, 2012, 46: 311～339. 6.
Marraffini LA., Sontheimer EJ. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nature Rev Genet , 2010, 11 (3): 181～190. 7.
Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., and Marraffini, L.A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology, 2013, 31: 233～239. 8.
Hwang WY ., Fu Y ., Reyon D., Maeder ML., Tsai SQ., Sander JD., Peterson RT., Yeh JR., Joung JK. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology, 2013, 31:227～229 9.
Liu P, Long L, Xiong K, Yu B, Chang N, Xiong JW, Zhu Z, Liu D. Heritable/conditional genome editing in C. elegans using a CRISPR-Cas9 feeding system. Cell Research. 2014, 24(7):886～889.
10. Barrangou R. RNA events. Cas9 targeting and the CRISPR revolution. Science . 2014, 344(6185):707～708.
11. Nishimasu H., et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell , 2014, 156(5)935～949.
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南京国际服务外包产业园01栋13层A 座 电话：+86-25-66776700/66776718
传真：+86-25-66776701 邮编：210036
网址：www.genloci.com
目 录
I ．组份列表……………………………………………………………………………….. ……….…2 II ．产品概要…………………………………………………. ….……………………………. ………2 III ．操作步骤…………………………………………………….………………………………..…..3
1. 设计Oligo DNA 序列………………………………………………………………………..3 2. 线性化pP1C.2载体………………………………………………………………………... …3 3. 重组pP1C.2载体的构建………………………………………………………………... ……3 4. 重组pP1C.1载体的构建……………………………………………………………. ………..3 IV ．附录pP1C 系统质粒图谱……………..…………………….……. ………………...…………4-5 V ．参考文献…………………………………..……. ……………….…….…………..…...………6 图
Figure 1. CRISPR-Cas9工作原理示意图 Figure 2. pP1C.1质粒图谱 Figure 3. pP1C.2质粒图谱 表
Table1. CRISPR-Cas9植物基因敲除试剂盒组份列表
Protocol No. PT140730-1 www.genloci.com Genloci Biotechnologies Inc.
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I ． 组份列表
CRISPR-Cas9基因敲除试剂盒组份如下：
Table1. CRISPR-Cas9植物基因敲除试剂盒组份列表
组份列表
pP1C.1 Vector pP1C.2 Vector
含量 2μg 2μg
贮存条件
※注意：在收到货后，请您将pP1C.1 Vector 和pP1C.2 Vector瞬时离心后再保存。
将pP1C.1 Vector、pP1C.2 Vector置于-20℃保存，且避免污染；
II ．产品概要
CRISPR/Cas9植物基因敲除试剂盒是一款高效、精准的基因编辑试剂盒，它是基于最新代的人工核酸内切酶CRISPR-Cas9而研发的，相对于传统敲除技术和TALENs\ZFNs技术而言，其操作更加简便，敲除效率最高，基因的编辑更加的精准，大大降低了脱靶机率。CRISPR/Cas9植物基因敲除试剂盒能够适用于几乎所有植物细胞的基因修饰研究。
pP1C 系列载体是CRISPR/Cas9系统在植物中应用的载体，支持使用农杆菌介导进行的随机整合以及原生质体共转的瞬时表达系统。pP1C 载体系列中使用的Cas9基因及其核定位信号已经文献报道能够正常发挥其作用，并在水稻等植物中得到实践。限于CRISPR 系统中trancrRNA 的结构需要，以及pP1C 载体中结构限制，难以将所有元件置于一个载体中并使其易于操作，因此，每一套pP1C 载体至少包含两个载体，如pP1C.1、pP1C.2。
Genloci 公司为您提供完整的基因敲除解决方案，从敲除方案设计→敲除位点设计→载体构建→转染→敲除检测→结果分析，让您的实验一次成功！
Figure1. CRISPR-Cas9工作原理示意图
Protocol No. PT140730-1 www.genloci.com Genloci Biotechnologies Inc.
2/6
III ．操作步骤
实验前，请您务必做好以下验证实验：
A ． 目的基因的表达情况分析，为防止因染色体缺失等情况导致靶基因缺失，首先需要PCR 扩增
靶基因，并对PCR 结果进行测序，确保靶基因的完整存在；其次，您还可以用RT-PCR 分析靶基因的活跃度。
1. 设计Oligo DNA序列
首先，您需要在靶标DNA 区域中设计一对20bp 左右的oligo DNA，您可以通过以下在线工具设计：
●麻省理工学院的
CRISPR Design：http://crispr.mit.edu/
E-Crisp ：www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html
●德国癌症研究中心的
引物合成模板：
上游：5’_GCAA（20bp 靶位点正向）_3’ 下游：3’_（20bp 靶位点反向）-CAAA_ 5’
其中上游的GCAA ，下游的CAAA 为Bbs I 酶切形成的粘性末端。 示例：
正链oligo ：GCAATGTACGGGAGGGACCCGTGC 负链oligo ：AAACCACGGGTCCCTCCCGTACAG
将设计后的序列送到值得信赖的公司合成，纯化级别为PAGE 。
2. 线性化pP1C.2载体
使用Bbs I 酶切pP1C.2（氨苄抗性）载体，回收3.2kb 的片段；
3. 重组pP1C.2载体的构建
将正负链oligos （100μM）等比例混合后，加热到95℃，3min ，自然冷却至40℃以下，制备得到双链DNA ；将双链DNA 与酶切纯化后的pP1C.2载体片段连接、转化大肠杆菌，构建得到重组pP1C.2载体。对重组载体进行测序，确认插入序列的正确性。
然后EcoR I 、Nhe I 双酶切重组载体pP1C.2，回收约520bp 的DNA 片段；
4. 重组pP1C.1载体的构建
使用EcoR I 、Xba I 双酶切pP1C.1（卡那霉素抗性）载体，回收载体片段；将步骤3中得到的520bp DNA片段与酶切后的pP1C.1进行T4 DNA酶连接，转化大肠杆菌， 得到重组载体pP1C.1，重组载体pP1C.1即为构建好的CRISPR-Cas9植物基因敲除载体。后续可进行重组载体pP1C.1转化农杆菌，农杆菌介导植物转化，筛选阳性克隆，测序验证，敲除效率检测及敲除序列比对分析等。
Protocol No. PT140730-1 www.genloci.com Genloci Biotechnologies Inc.
3/6
IV ．附录pP1C 系列质粒图谱
Figure2. pP1C.1质粒图谱
pP1C.1部分序列（片段转移位置）
5’-……GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCAC ACAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC GTCGACC TGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTT ACC ……-3’
EcoR I位点：GAATTC Xba I 位点：TCTAGA
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CRISPR-Cas9植物基因敲除试剂盒
Figure3. pP1C.2质粒图谱
pP1C.2部分序列（靶点插入位置）
5’-……CATGAAGCCTTTCAGGACATGTATTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGGCTATCCACATAGATCAAAGCTGATTTAAAAGAGTTGTGCAGAT GATCCGTGGCA
TATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCC GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTC TGCAGTCGACGGTACCCGTTACA TAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTAACTAGAGA ……-3’
转录起始位点：A
双BbsI 位点：gggtcttcgagaagacct 绿色标示的序列：sgRNA （trancrRNA ） EcoR I位点：GAATTC Xba I 位点：TCTAGA
Protocol No. PT140730-1 www.genloci.com Genloci Biotechnologies Inc.
5/6
CRISPR-Cas9植物基因敲除试剂盒
V. 参考文献
1.
Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J.A., and Charpentie E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptiv bacterial immunity. Science, 2012,337: 816～821. 2.
Horvath P., Barrangou R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science , 2010, 327 (5962): 167～170. 3.
Hale CR, Zhao P., Olson S., et al. RNA-Guided RNA Cleavage by a CRISPR RNA-Cas Protein Complex. Cell , 2009, 139 (5): 945～956. 4. 5.
Zhang F., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science , 2013, 339(6121): 819～823 Westra ER., Swarts DC., Staals RH., Jore MM., Brouns SJ., van der Oost J. The CRISPRs, they are a-changin': how prokaryotes generate adaptive immunity. Annu Rev Genet, 2012, 46: 311～339. 6.
Marraffini LA., Sontheimer EJ. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nature Rev Genet , 2010, 11 (3): 181～190. 7.
Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., and Marraffini, L.A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology, 2013, 31: 233～239. 8.
Hwang WY ., Fu Y ., Reyon D., Maeder ML., Tsai SQ., Sander JD., Peterson RT., Yeh JR., Joung JK. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology, 2013, 31:227～229 9.
Liu P, Long L, Xiong K, Yu B, Chang N, Xiong JW, Zhu Z, Liu D. Heritable/conditional genome editing in C. elegans using a CRISPR-Cas9 feeding system. Cell Research. 2014, 24(7):886～889.
10. Barrangou R. RNA events. Cas9 targeting and the CRISPR revolution. Science . 2014, 344(6185):707～708.
11. Nishimasu H., et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell , 2014, 156(5)935～949.
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