高效液相色谱
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
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高效液相色谱
一 二 三 四 五 概述 液相色谱仪 HPLC 检测器 各种色谱方法 HPLC分离利用
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一,概述 - 定义
高效液相色谱
以液体作为流动相的色谱过程
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一,概述 - 特点
高压 --- 150 ~ 350 x 105 Pa 高速 --- 小于1h 高效 --- 3万塔板/米 (气相色谱2000塔板/米) 高灵敏度 --- 10-9 10-11 g
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GC与HPLC比较
GC
流动相
HPLC
不同极性的液体(有一定 亲和作用) 高沸点,不稳定的天然产 物,生物大分子,高分子 化合物 一般室温
惰性气体(无亲和性,只 起运载作用) 气体,沸点较低的化合物 较高
分析对象
温
度
5
一,概述 - 分类
(1) 分配色谱 (2) 吸附或液固色谱 (3) 离子色谱 (4) 凝胶色谱或尺寸排阻色谱
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二,各种色谱方法
(一)分配色谱 (二)吸附色谱 (三)离子交换色谱法 (四)排阻色谱法
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(一)分配色谱
(Partition Chromatography) 液液分配色谱(LLPC)
分配色谱
液体固定相通过物理 吸附固定于载体表面
键合固定相分配色谱(LSPC)
有机分子通过化学反 应键合到载体表面
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(一)分配色谱 – 分离原理
分离原理 不同组分在两相间分配系数不同
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(一)分配色谱- 固定相
固定相 --- 物理吸附 (担体 + 固定液)
全多孔型担体 薄壳型微珠担体
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(一)分配色谱- 固定相
固定相 --- 化学键合
Si O Si O O HCl Si O Si OH OH Cl Si(CH3)2R Si O Si O Si(CH3)2R O Si(CH3)2R
R --- 极性基团
疏水基团
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HPLC的固定相的化学构造
非键合相表面 键合相表面 ODC C18 C8 C1 Phenyl -NH2 -CN
OH OH
正相分配色谱 固定相性质 键合基团 流动相性质 出峰顺序
反相分配色谱
极性 极性基团 非极性 极性小先出
非极性 疏水基团 极性 极性大先出
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(二)吸附色谱 – 分离原理
分离原理
溶质与流动相分子在吸附剂表面上 的吸附竞争
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(二),吸附色谱- 固定相
固定相 以固体吸附剂为固定相,如硅 胶,氧化铝等,较常使用的是5～ 10μm的硅胶吸附剂.流动相可以是 各种不同极性的一元或多元溶剂.
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(三),离子交换色谱
分离原理 各种离子根据它们与树脂上的交换基 团的交换能力的不同而得到分离. 固定相 固定相为离子交换树 脂,流动相为无机酸 或无机碱的水溶液.
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(三),离子交换色谱
分离对象 离子或可离解的化合物
(无机离子,氨基酸,蛋白质等)
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(四)排阻色谱法
分离原理 根据样品分子尺寸大小分离
大分子不能进入多孔中,不被保留,随 Vm流出
中分子部分进入多孔中,一般保留 小分子完全进入多孔中,长时间保留.
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固定相
1. 软凝胶:铰链葡萄糖的多孔聚合物, 聚丙烯酰胺凝胶.(凝胶过滤色谱) 2. 半硬凝胶:聚苯乙烯珠(凝胶渗透色谱) 3. 高硬凝胶和玻璃:多孔玻璃或多孔硅 球,经化学键合处
理,不随压力及溶剂 改变尺寸,(高效排阻色 谱)
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(四)排阻色谱法
应用 高分子化合物分子量及分子量分布 DNA碎片不同碱基支链分离.
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极性
H P L C 应 用 概 图
水不溶性 非极性物质
水不溶性 离子 极性非离子型 分配
吸附
反相分 配色谱
正相分 离子交换 配色谱
凝胶渗透
排阻
凝胶过滤
三,液相色谱仪
流动液贮存提供脱气 输液泵 进样系统 分离系统 检测系统 控制与记录系统
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LC 系 统
23
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1. 流动相贮存与脱气
脱气方法 (1)真空泵抽滤系统 (2)低溶性惰性气体导入替换 (3)超声脱气
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2. 输液系统
活塞泵 注射泵 气动泵
26
活塞泵工作原理
注射泵
28
3. 进样系统
不使整个压力变化的情况下将样品 注入色谱柱,通常使用所谓六通阀
样品环
样品环
4,色谱柱
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5. HPLC 检测器
溶液:折光,介电常数,密度 溶质:吸光光度,荧光光度,扩散电流等 (1). 吸光检测器 (2). 红外检测器 (3). 荧光检测器 (4). 折光检测器 (5). 电化学检测器 (6). 质谱检测器
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常用LC检测器
名称 吸光度 荧光 电化学 折光 电导 质谱 FTIR 光散射 光离子化 元素选择 使用量 71% 13% 4.3% 5.4% 商品化 Yes Yes Yes Yes Yes No Yes Yes98 No No 灵敏度 100pg-1ng 1-10pg 10pg-1ng 100ng-1g 500pg-1g 1g 1ng 1pg-1ng 10ng 价格 1 2-20 1-2 111000 1000
5
(1)吸光检测器
单波长UV检测器,光源用Hg灯,加滤光 片 可 以 到 254 , 280 , 313 , 334 , 365 等.生化中用到很多. 多波长 光度计类似,光栅或棱镜分光
PMT/PD 单波长检测 PDA 多波长同时检测,三维
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流通池
典型光路
Tungsten lamp Coupling lens Deuterium lamp
Source lens (Achromat)
Support lens
Array
Holmium oxide filter Flow cell
Spectro lens
Programmable Slit Grating
Diode Array - Details
LIGHT
PHOTODIODE
CAPACITOR
Time msec nm Wavelength
TRANSISTOR SWITCH
SHIFT REGISTER
VIDEO LINE READOUT CYCLE
38
coelute
90% MeOH 0.5 mLs/min
39
(2)荧光检测器
灵敏度比吸光好,选择性亦较好,光 源可以使高强度汞灯或氘灯,但并不 是所有物质都有荧光,可通过柱前或 柱后衍生法来检测.
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(3) 折光检测器
优点:通用性好,不受流速影响 缺点: 折光率测定受温度影响很大
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(4)电化学检测器
四,HPLC分离利用
定性分析 定量分析 峰面积∝浓度或质量
标准样品法 谱库
HPLC-FTIR HPLC-MS
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用反相液-液色谱分离稠环芳烃
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 苯 萘 联苯 菲 蒽 12. 苯并[a]芘 萤蒽 芘 11. 苯并[e]芘 9. 北
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高效液相色谱
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
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高效液相色谱
一 二 三 四 五 概述 液相色谱仪 HPLC 检测器 各种色谱方法 HPLC分离利用
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一,概述 - 定义
高效液相色谱
以液体作为流动相的色谱过程
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一,概述 - 特点
高压 --- 150 ~ 350 x 105 Pa 高速 --- 小于1h 高效 --- 3万塔板/米 (气相色谱2000塔板/米) 高灵敏度 --- 10-9 10-11 g
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GC与HPLC比较
GC
流动相
HPLC
不同极性的液体(有一定 亲和作用) 高沸点,不稳定的天然产 物,生物大分子,高分子 化合物 一般室温
惰性气体(无亲和性,只 起运载作用) 气体,沸点较低的化合物 较高
分析对象
温
度
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一,概述 - 分类
(1) 分配色谱 (2) 吸附或液固色谱 (3) 离子色谱 (4) 凝胶色谱或尺寸排阻色谱
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二,各种色谱方法
(一)分配色谱 (二)吸附色谱 (三)离子交换色谱法 (四)排阻色谱法
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(一)分配色谱
(Partition Chromatography) 液液分配色谱(LLPC)
分配色谱
液体固定相通过物理 吸附固定于载体表面
键合固定相分配色谱(LSPC)
有机分子通过化学反 应键合到载体表面
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(一)分配色谱 – 分离原理
分离原理 不同组分在两相间分配系数不同
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(一)分配色谱- 固定相
固定相 --- 物理吸附 (担体 + 固定液)
全多孔型担体 薄壳型微珠担体
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(一)分配色谱- 固定相
固定相 --- 化学键合
Si O Si O O HCl Si O Si OH OH Cl Si(CH3)2R Si O Si O Si(CH3)2R O Si(CH3)2R
R --- 极性基团
疏水基团
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HPLC的固定相的化学构造
非键合相表面 键合相表面 ODC C18 C8 C1 Phenyl -NH2 -CN
OH OH
正相分配色谱 固定相性质 键合基团 流动相性质 出峰顺序
反相分配色谱
极性 极性基团 非极性 极性小先出
非极性 疏水基团 极性 极性大先出
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(二)吸附色谱 – 分离原理
分离原理
溶质与流动相分子在吸附剂表面上 的吸附竞争
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(二),吸附色谱- 固定相
固定相 以固体吸附剂为固定相,如硅 胶,氧化铝等,较常使用的是5～ 10μm的硅胶吸附剂.流动相可以是 各种不同极性的一元或多元溶剂.
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(三),离子交换色谱
分离原理 各种离子根据它们与树脂上的交换基 团的交换能力的不同而得到分离. 固定相 固定相为离子交换树 脂,流动相为无机酸 或无机碱的水溶液.
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(三),离子交换色谱
分离对象 离子或可离解的化合物
(无机离子,氨基酸,蛋白质等)
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(四)排阻色谱法
分离原理 根据样品分子尺寸大小分离
大分子不能进入多孔中,不被保留,随 Vm流出
中分子部分进入多孔中,一般保留 小分子完全进入多孔中,长时间保留.
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固定相
1. 软凝胶:铰链葡萄糖的多孔聚合物, 聚丙烯酰胺凝胶.(凝胶过滤色谱) 2. 半硬凝胶:聚苯乙烯珠(凝胶渗透色谱) 3. 高硬凝胶和玻璃:多孔玻璃或多孔硅 球,经化学键合处
理,不随压力及溶剂 改变尺寸,(高效排阻色 谱)
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(四)排阻色谱法
应用 高分子化合物分子量及分子量分布 DNA碎片不同碱基支链分离.
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极性
H P L C 应 用 概 图
水不溶性 非极性物质
水不溶性 离子 极性非离子型 分配
吸附
反相分 配色谱
正相分 离子交换 配色谱
凝胶渗透
排阻
凝胶过滤
三,液相色谱仪
流动液贮存提供脱气 输液泵 进样系统 分离系统 检测系统 控制与记录系统
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LC 系 统
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1. 流动相贮存与脱气
脱气方法 (1)真空泵抽滤系统 (2)低溶性惰性气体导入替换 (3)超声脱气
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2. 输液系统
活塞泵 注射泵 气动泵
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活塞泵工作原理
注射泵
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3. 进样系统
不使整个压力变化的情况下将样品 注入色谱柱,通常使用所谓六通阀
样品环
样品环
4,色谱柱
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5. HPLC 检测器
溶液:折光,介电常数,密度 溶质:吸光光度,荧光光度,扩散电流等 (1). 吸光检测器 (2). 红外检测器 (3). 荧光检测器 (4). 折光检测器 (5). 电化学检测器 (6). 质谱检测器
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常用LC检测器
名称 吸光度 荧光 电化学 折光 电导 质谱 FTIR 光散射 光离子化 元素选择 使用量 71% 13% 4.3% 5.4% 商品化 Yes Yes Yes Yes Yes No Yes Yes98 No No 灵敏度 100pg-1ng 1-10pg 10pg-1ng 100ng-1g 500pg-1g 1g 1ng 1pg-1ng 10ng 价格 1 2-20 1-2 111000 1000
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(1)吸光检测器
单波长UV检测器,光源用Hg灯,加滤光 片 可 以 到 254 , 280 , 313 , 334 , 365 等.生化中用到很多. 多波长 光度计类似,光栅或棱镜分光
PMT/PD 单波长检测 PDA 多波长同时检测,三维
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流通池
典型光路
Tungsten lamp Coupling lens Deuterium lamp
Source lens (Achromat)
Support lens
Array
Holmium oxide filter Flow cell
Spectro lens
Programmable Slit Grating
Diode Array - Details
LIGHT
PHOTODIODE
CAPACITOR
Time msec nm Wavelength
TRANSISTOR SWITCH
SHIFT REGISTER
VIDEO LINE READOUT CYCLE
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coelute
90% MeOH 0.5 mLs/min
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(2)荧光检测器
灵敏度比吸光好,选择性亦较好,光 源可以使高强度汞灯或氘灯,但并不 是所有物质都有荧光,可通过柱前或 柱后衍生法来检测.
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(3) 折光检测器
优点:通用性好,不受流速影响 缺点: 折光率测定受温度影响很大
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(4)电化学检测器
四,HPLC分离利用
定性分析 定量分析 峰面积∝浓度或质量
标准样品法 谱库
HPLC-FTIR HPLC-MS
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用反相液-液色谱分离稠环芳烃
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 苯 萘 联苯 菲 蒽 12. 苯并[a]芘 萤蒽 芘 11. 苯并[e]芘 9. 北
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