第26卷 第2期2005年6月
首都师范大学学报(自然科学版) Journal of Capital N ormal University
(Natural Science Edition )
V ol. 26,N o. 2June 2005
新型萃取分离技术在生物技术中的应用
刘 波 王英锋 郭雪清
(首都师范大学分析测试中心, 北京 100037)
摘要
本文介绍各种新型萃取技术:双水相萃取、凝胶萃取、反胶束萃取、膜萃取、液膜萃取、超临界萃取、微波萃取和固相微萃取在生物技术上的应用.
关键词:萃取, 分离, 生物技术.
中图分类号:Q 233
系,1979年德国G BF 的K ula 等人将双水相萃取用于生物产品分离. 此后, 对于双水相体系的研究和应用逐步展开, 并取得很大进展. 现在双水相萃取已被广泛用于蛋白质、酶、核酸、病毒、细胞、细胞器等生物产品的分离和纯化, 并逐步向工业化生产迈进, 展现了在食品工业、生物学研究和生物工程方面的巨大应用前景, 将有力推动生物技术的发展.
常用的双水相体系是聚乙二醇/葡聚糖体系和聚乙二醇/磷酸盐体系. 物质在两相中的选择性分配是疏水键、氢键和离子键等相互作用的结果. 影响蛋白质及细胞碎片在双水相体系中分配行为的主要参数有成相聚合物的种类、成相聚合物的分子质量和总浓度、无机盐的种类和浓度、pH 值、温度等.
双水相萃取主要具有如下基本特点:(1) 体系有生物亲和性. 含水量高, 水分含量通常高为70%～90%, 是在接近生理环境温度和体系中进行萃取, 不会引起生物活性物质失活或变性. (2) 易于工程放大和连续操作. 在提取酶等生物活性物质的过程中, 双水相萃取能够在较少的溶液量和较短的操作时间内获得较高产量的产品. 另外, 操作能够容易、精确地按比例放大, 非常适合大规模应用, 可进行连续生[2]
产. (3) 界面张力小, 有助于生物活性与强化相际间的质量传递. (4) 分相时间短, 一般为5～15min. (5) 不存在有机溶剂残留问题. (6) 能进行萃取性的生物转化. 在一些双水相体系中可将发酵生产过程中的生物转化与下游处理的第1步相结合, 即生物
[1]
1 引 言
21世纪是生物工程技术占主导地位的时代, 而
生化分离是生物工程技术转化为生产力传统的过程中必不可少的重要环节. 由于生物工程技术特别是细胞工程、基因工程、蛋白质工程等技术产品的特殊性, 要求分离技术既具有较高的分离效率又不影响产品的生物活性. 传统的液-液萃取分离技术成本低, 易于操作, 已广泛用于多组分物质的分离, 但是由于缺乏相应的生化溶剂, 难以分离蛋白质、核酸等大分子生物活性物质; 随着液相色谱技术的发展, 特别是制备型色谱技术的应用, 使大多数生物分子的批量分离成为可能, 然而由于该技术本身也存在某些局限性, 如有时会引起目标物的不可逆吸附, 甚至变性等现象, 在一定程度上限制了其在生化分离中的应用. 随着双水相萃取、反胶束萃取、膜萃取等一些新型萃取分离技术不断的发展, 由于这些技术可以选择性分离生物活性分子, 越来越来引起人们的重视.
2 新型萃取分离技术
211 双水相萃取
双水相萃取(aqueous tw o phasepartitioning ) 是1956年瑞典伦德大学的Albertss on 发现双水相体
收稿日期:2004206214
反应在其中一相中进行, 同时生成的反应产物被连续萃取到另一相中. 不仅解决了产物反馈抑制作用造成的产量低的问题, 而且酶在高聚物溶液中比在缓冲溶液中更稳定, 活性更大. 因为生物反应和生物产物的提取同时进行, 尤其适于连续生产. (7) 亲和萃取(亲和分配) 可大大提高分配系数和萃取专一性. 由于目标蛋白质与其他杂蛋白的理化性质相近, 造成其萃取专一性不高. 亲和萃取就是将一种和目标蛋白质有很强亲和力的配基与一种成相聚合物共价结合, 该成相聚合物与另一种成相聚合物形成双水相体系进行萃取时, 目标蛋白质专一性地进入结合有配基的那种成相聚合物所在相中, 其它杂蛋白则进入另一相
[3,4]
术, 尤其是电敏凝胶, 具有快速、简便和无污染的特点, 很有可能更快的获得工业应用
[13]
. 但凝胶本身
的性质由很多种因素确定, 但主要的影响因素, 则是凝咬的离子度和联度. 对凝胶胀缩机理目前有两种不同的解释. 其确切的阐述还需要进一步试验研究证实.
213 反胶束萃取
反胶束(reversed micelle ) 是双亲物质在非极性有机溶剂中自发聚集体, 又称为反胶团、逆胶束. 1977年,Luisi 等首先发现胰凝乳蛋白酶可以溶解于
双亲物质(表面活性剂) 的有机溶剂中, 超离心数据显示有机相中反胶束的存在, 同时, 光谱分析表明这一过程未引起酶的变性. 随后的20多年里, 反胶束萃取技术已广泛应用于蛋白质的分离和纯化, 并逐渐延伸至其他生物分子(氨基酸、抗生素、核酸) 的分离研究; 近年来, 该技术结合其他一些技术、方法的应用正在研究和开发, 显示了良好的应用前景.
与其它的分离技术相比, 蛋白质等生物活性分子通过反胶束增溶于有机溶剂而不影响其活性, 这是分离技术研究的一项突破. 反胶束萃取技术的应用过程中, 不存在毒性试剂, 对人体无害, 而且反胶束溶液可以反复利用, 亲和配体的引入, 提高了目标物的萃取率及分离的选择性.
通常, 形成反胶束的有机溶剂为脂肪烷烃; 双亲物质根据其极性头基性质的不同, 可分为以下4种类型:非离子型(如脂肪醇聚氧乙烯醚) , 阳离子型(如丁二酸二2222乙基已基质磺酸钠) , 阴离子型(如
.
[5～7]
双水相萃取技术目前仍不是十分成熟, 在其运用中存在一定的问题
. 成相聚合物价格昂贵是
阻碍该技术应用于工业生产的主要因素. 葡聚糖价格很高, 用粗品代替精制品又会造成葡聚糖相粘度太高, 使分离困难. 研究应用最多的PEG 并不是双水相体系最适合的聚合物, 磷酸盐又会带来环境问题, 故开发新的聚合物是该技术应用急需解决的问题. Niss on 等人利用改性淀粉代替dextran 取得了比较好的结果. 212 凝胶萃取
[8]
凝胶萃取(G el Extraction ) 是Cussler 等在1984年首次提出的分离过程. 它是利用凝胶在溶剂中溶胀特性和凝胶网络对大分子、微粒等的排斥作用达到溶液浓缩分离的目的. 凝胶是一种吸收液体而溶胀的交联聚合物网络, 具有介入固体和液体的物质形态. 凝胶的性质在很大程度上取决于聚合物的网络和液体介质的相互作用. 液体介质阻止聚合物网络皱缩成致密物质, 而聚合物网络则阻止液体流失. 当外部条件, 如温度、溶剂组成等发生变化时, 凝胶可以发生可逆的、非连续的溶胀和皱缩, 吸收或释放出液体, 其体积变化常达数百乃至数千倍. 凝胶对所吸收的液体只具有选择性, 即它只吸收小分子物质而不吸收如蛋白质等大分子物质.
凝胶萃取分离技术相比其它分离方法, 它的设备简单、能耗低, 所用的凝胶再生比较简单, 有着良好的应用前景敏型
[12]
[9～11]
二辛基二甲基氯化铵) , 两性离子剂(如卵磷脂(; 某些双亲物质, 如三辛基甲基氯化铵, 卵磷脂, 需要加
入一定量的注表面活化剂(一般为C 4～C 12脂肪醇) 才能形成稳定的反胶束体系.
[14]
K arpe 等研究了α2凝乳蛋白酶在AOT/异辛烷体系中的酶超活性, 用双电层理论解释, 同时考虑局部电场强度和局部离子强度影响. 通过计算, 很好地符合泊松2玻兹曼等式. Rergalado C 等
[15]
用AOT/
异辛烷反胶束体系从辣根的粗渗透水液中经两阶段萃取提纯辣根过氧化物酶(H R P ) . 前萃利用H R P 溶解时窄的pH 值范围而除去杂质蛋白质, 在第二次萃取中, 用水相与有机相之比为10来选择性溶解并浓缩HRP. HRP 最终特异活性为86, 纯化80倍, 产率为46%.J PHE N 等
[16]
. 凝胶萃取根据凝胶在发生相变
时, 外界条件的不同, 可以分为温敏型、酸敏型和电
.
采用卵磷脂/黄油反胶束
凝胶萃取, 不论其是温敏、酸敏或电敏型, 均可能成为取代超滤或蒸发浓缩高分子溶液的新分离技
体系, 利用Candidavylindracea 脂酶水解奶油, 在温度为56℃、pH 值4～6、W 0为10时分别使酶活性达最
大值, 在一定范围内, 增大表面活性剂或酶的浓度, 酶的活性同时也增加. 另外, 此体系中酶的耐热性有很大提高. 陈复生等
[17]
以液膜为分离介质、以溶度差为推动力的膜分离操作. 它与溶剂萃取是机理不同, 但都属于液2液系统的传质分离过程. 由于液膜分离技术具技术因其选择性和逆浓度梯度传递等优点, 在生物工程领域的应用引起了众多学者的极大兴趣. 目前液膜分离技术已经广泛应用于有机酸、氨基酸、抗生素、脂肪酸等生化产物的分离、提取.
M onlinari 等
[22]
用AOT/异辛烷反胶束体系
同时萃取植物蛋白和油脂, 采用正交试验, 确定了最佳工艺条件:时间50min , K Cl 浓度0115m ol ΠL ,AOT/异辛烷为8g/50m L. 得到影响萃取效果各因素主次顺序:时间>AOT/异辛烷>K Cl 浓度.
大量的研究表明利用反胶束技术提取分离酶和蛋白质等具有可行性和优越性. 但反胶束技术目前仍限于实验室研究, 没有商品化产品. 主要是由于对反胶束萃取的机理不清楚, 尤其是酶在其中的作用机理; 而且还缺乏合适的满足食品工业需要的天然安全反胶束体系. 通过进一步对萃取动力学的热力学过程的认识. 特别是随着新型天然安全反胶束体系的开发, 则可在油脂水解、植物蛋白和油脂的分离、发酵滤液的提取上实现工业化生产. 214 膜萃取
人报道了利用支撑液膜萃取苯丙
氨酸, 以季铵盐Aliquat 2336作载体、煤油作为有机溶剂从水溶液中提取苯丙氨酸、提出了一种传质理论, 并讨论了载体浓度、温度、载体组分等因素的影响.
莫凤奎等
[23]
人利用S pan 280作为表面活性剂,
煤油作为有机溶剂从北豆根中提取北豆根总碱. 文中考察了膜材料、外相pH 值、内相盐酸浓度、表面活性剂种类以及用量等因素对北豆根总碱提取率的影响, 得出了一个萃取北豆根总碱的最佳条件, 萃取率达到85%.
报道了利用AOT 和S pan 280混合反
胶团作为载体的乳化液膜对α2chym otrypsin 进行萃
Stobbe 等
[24]
膜萃取(Membrane extraction ) 是膜过程和液2液萃取过程集合形成的一种分离技术,1984年K im BM 等人
[18]
提出膜萃取分离技术以来, 随着对该技术的
取, 最大萃取率达98%, 但只有65%被回收, α2chym otrypsin 的活性保持在60%左右. 并提出利用液
不断深入研究, 膜萃取分离技术得到了很大的发展, 在诸如药物提取、有机物萃取、金属萃取等领域得到了广泛的应用.
与传统萃取技术相比, 膜萃取可以减少萃取剂在物料相中的夹带损失; 选择萃取剂时可以放宽对物性的要求; 过程可以免受“液泛”条件的限制, 减少了“返混”的影响; 易于实现同级萃取反萃过程, 且可得到很高的单位体积传质速率
Y amini 等
[20]
[19]
膜技术萃取蛋白质具有较为广阔的前景.
经过30多年的发展, 液膜萃取在机理探讨和应用研究方面都有很大的进展. 但是液膜萃取过程中的不同相之间的可能存在的相互渗透, 大面积支撑液膜的形成与支撑液体的流失等问题难以解决. 到目前为止, 液膜稳定性和破乳技术仍然是制约液膜技术工业化的关键因素, 因而, 液膜萃取技术的应用研究大多仍停留在实验室阶段, 要达到大规模工业应用水平还需作大量工作. 而且选择好的表面活性剂、提高液膜稳定性、减少液膜的破损也是研究的热点.
216 超临界萃取
.
报道了用膜从水溶液中萃取分离
醚类有机物的研究, 其萃取效率大于95%.Lauritsen 等
[21]
将MI MS 技术用于生物反应监测的研究, 结果
-12
表明, 该项技术可实现10级水平的在线监测生物
反应, 这不但开辟了膜萃取应用的新领域, 还为人们在痕量水平监测生物反应提供了新的手段.
膜萃取技术是80年代初发展起来的一种新型的高效分离技术, 在生物活性物质分离、生物及食品工业、环境保护、石油化工等方面得到广泛的应用. 但注意的是, 在膜萃取中, 由于有机溶剂的作用, 常使膜发生溶胀, 从而严重影响其传质效率, 因此, 开发能耐溶胀的膜材料及强化膜的传质是实现膜萃取工业化的关键, 也是膜萃取研究的热点. 215 液膜萃取
超临界流体萃取(supercritical fluid extraction , SFE ) 是新型的提取技术, 它以超临界条件下的气体
作为萃取剂, 从液体或固体中萃取出某些成分并进行分离的技术. 近十几年来,SFE 技术在食品、医药、生物化工等领域的应用研究取得了长足的进步, 已逐步地从实验室走出了工业化规模阶段.
与一般液体萃取相比,SFE 的萃取速率和范围更为扩大. 萃取过程是通过温度(T ) 和压力(P ) 的调节来控制与溶质的亲和性而实现分离的. 通过调节
T 、P 可提取纯度较高的有效成分或脱出有害成分;
液膜萃取法(liquid membrance extraction ) 是一种
选择适宜的溶剂如C O 2可在较低温度或无氧环境下操作, 分离、精制热敏性物质和易氧化物质; SFE 还具有良好的渗透性利溶解性, 能从固体或粘稠的原料中快速提取有效成分; 降低超临界流体的密度, 容易使溶剂从产品中分离, 无溶剂污染, 且回收溶剂无相变过程, 能耗低; 兼有萃取和蒸馏的双重功效, 可用于有机物的分离、精制; 同类物质, 如有机同系物, 按沸点升高顺序进入超临界相.
A12Jabari 等
[25]
溶剂(60%乙醇) , 以5min 作为一个循环, 萃取率可达83%, 经5个循环后大部分营养成分被萃取.
与传统的萃取技术、样品制备技术相比较, 微波萃取技术具有以下特点:质量高、产量大、对萃取物料具有较高的选择性, 反应或萃取快, 能耗低, 安全, 无污染. 但到目前为止, 它主要还是作为一种分析试样预处理的手段和一种提取精油等有用物质的方法, 其研究处于初期阶段. 萃取机理论上还有待于深一步地研究. 鉴于微波能对萃取过程中传质传热的促进作用, 将其应用于生物成分的提取和浓缩必会产生很好的效果. 同时, 如果能在仪器设计上实现突破, 使微波萃取象超临界流体萃取那样与检测仪器实现在线联机, 则该方法将会得到进一步发展. 218 固相微萃取
1989年,Belardi 与Pawliszyn 提出固相微萃取(s olid phase microextraction ,SPME ) 技术以来, 固相萃
, 通过试验建立了超临界萃取的
动力学模型, 并指出了传递过程随温度、压力的变化规律, 为萃取参数的确定提供基本的理论依据. G e 等E.
SFE 技术已走出实验室进入规模化生产阶段,
[26]
利用C O 2超临界萃取分离了小麦中的维生素
工业生产不断扩大, 萃取产品种类不断涌现. SFE 作为一种新型萃取技术大规模应用于工业生产, 还需研究SFE 的热力学特性和传质规律, 建立萃取系统的动态传质模型, 以预测并且要进一步探讨萃取机理, 开发萃取工艺, 特别是探讨溶剂、物料性质对萃取过程及对食品物料大分子以提高萃取率和产品纯度
[27]
取作为化学分离和纯化的一个强有力工具出现了. 从痕量样品的前处理到工业规模的化学分离, 吸附剂萃取在制药、精细化工、生物医学、食品分析、有机合成、环境和其他领域起着越来越重要的作用.
固相微萃取技术的主要优点是:不用或少用溶剂; 操作简便; 易于自动化和与其他技术在线联用. 与其他常用的富集技术相比, 克服了传统的液2液萃取法需使用大量溶剂和样品、处理时间长、操作步骤多的缺点. SPME 与近年来新发展的样品前处理技术相比也具有独到之处, 如:超临界流体萃取装置价格昂贵, 不适于水样分析; 以溶剂脱附的固相萃取法回收率低; 热脱附的固相萃取法需要专用的加热装置, 且固体吸附剂的孔隙易被堵塞.
SPME 最初与G C 联用主要用于生物样品的分
. 目前, 应用于工业生产的萃取设备还未实现
规范化, 配套性也不尽合理, 对此, 应以传递模型为基础, 建立设备放大的数学模型, 以便工业设计. 同时还应降低设备成本、以便利于推广. 217 微波萃取
微波萃取技术(microwave 2assisted Extraction T echnique ) 是指使用微波及合适的溶剂在微波反应器中从各种物质中提取各种化学成分的技术和方法. 1986年, 美国科学家首先利用微波进行微波萃取以来, 微波萃取技术在食品化学领域飞速发展, 现阶段主要包括食品分析的样品制备(包括土壤、水分、水质和空气过滤物的污染物, 食品中的营养成分, 动植物组织中的药物和农药残留物) , 植物天然成分的提取. 以及和新兴的分离技术的配合如超临界流体萃取技术的配合解决溶剂残留问题等.
K av ocs 等
[28]
析. 李朴等
[31]
应用酶解2气质联用法测定生物检材
中安定的含量, 应用糜蛋白酶, 固萃取法提取后, 提高了生物检材中安定的提取率.
近些年来,SPME 研究成为一个热点,SPME 技术正在进一步的完善. SPME 发展与其他仪器, 如傅里叶变换红外光谱(FTIR ) 、电感耦合等离子体质谱仪(ICP 2M5) 及拉曼光谱仪联用的情况也有报道. SPME 正朝着多样化、仪器化、标准化的方向发展.
用奶酪等四种食品在不同温度、不
同时间下微波萃取, 以考察微波萃取氨基酸的萃取效率以及可重现性, 结果表明与传统萃取方法相比, 微波萃取法萃取率高10%, 而时间减少66%, 是一种有效的氨基酸萃取技术.
陈翠莲等
[29]
3 展 望
随着生物技术的不断发展, 由于生物技术产品的特殊性, 传统的萃取分离技术已经远远不能满足生物产品的分离需要. 生物技术在科研和生产过程
从预混合饮料中使用微波成功萃
[30]
取维生素A 、维生素D 、维生素E. K yungeun 将人
参粉碎至60目左右的粗细度后以1g Πm L 的量加入
中, 存在着大量的蛋白质、多肽和核工业酸等到生物
大分子的分离和纯化工作. 迫切需要高效快速成的分离和制备方法. 特别是基因工程及细胞工程的蛋白质类大分子的回收, 既要考虑使用高选择性的分离、纯化方法, 又要考虑不影响产品的生物活性的因素, 近20年来, 人们进行了大量的研究, 开发了许多新技术、新材料和新设备. 但是仍有几个待改进的方面:(1) 这些技术的大多数还没有工业化, 解决这些技术在工业化过程中的障碍是当今萃取分离技术发展的一个方向, 如膜的溶胀及带来的寿命问题等.
(2) 技术的联用, 如固相微萃取与气相、液相联用等. (3) 萃取方法的影响因素和分离机理的探索, 一些萃
取方法的机理如反胶束萃取还没有完全研究明白, 有待于进一步的探索.
总之, 随着生化产品的广泛应用, 新型萃取技术将在生化技术产品的分离过程起着越来越重要的作用. 因此, 更应加强对新型萃取技术的研究以期缩短与国外的差距, 使这些高新技术在国内得到广泛应用.
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Application of N e w Extraction T echnique to Biotechnology
Liu Bo Wang Y ing feng G uo Xueqing
(The Analysis T est Center ,Capital N ormal University ,Beijing 100037)
Abstract
In this paper , the application of new extraction techniques :aqueous tw o phasepartitioning , gel extraction , reversedmicelle , membrane extraction , liquid membrance extraction , supercritical fluid extraction , microwave 2assisted extraction technique and s olid phase microextraction in biotechnology was introduced.
K ey w ords :extraction, separation , biotechology.
(上接第25页)
The Prepartation and Characterization of Surface 2modified N ano 2zirconia
Chen Wen Zhang Cunlin Y ang X iaoyi
(Physics Department of Capital N ormal University 100037)
Abstract
The mechanisms about the aggregation and dispersibility of nano 2zirconia were analyzed in detail. And nano 2zirconia powders which were surface 2m odified with acrylic acid were prepared in order to disperse hom ogeneously in acetone in this investigation. Research and characterization on the structure and surface characteristic of surface 2m odified nano 2zirconia were achieved by TG,TE M and FT 2IR. The results given by FT 2IR showed acrylic acid was jointed on the surface of nano 2ziconia after dehydration reaction between carboxyl and the hydroxy on the surface of nano 2zirconia. The images provided by TE M presented intuitionistic effects of surface m odification on the dispersibility of nano 2zirconia in acetone. And the TG analysis ascertained the am ount of acrylic acid that was jointed on the surface of nano 2zirconia.
K ey w ords :zirconia, surface m odification , acrylic acid , dispersibility.
作者简介 陈文, 首都师范大学物理系02级研究生.
第26卷 第2期2005年6月
首都师范大学学报(自然科学版) Journal of Capital N ormal University
(Natural Science Edition )
V ol. 26,N o. 2June 2005
新型萃取分离技术在生物技术中的应用
刘 波 王英锋 郭雪清
(首都师范大学分析测试中心, 北京 100037)
摘要
本文介绍各种新型萃取技术:双水相萃取、凝胶萃取、反胶束萃取、膜萃取、液膜萃取、超临界萃取、微波萃取和固相微萃取在生物技术上的应用.
关键词:萃取, 分离, 生物技术.
中图分类号:Q 233
系,1979年德国G BF 的K ula 等人将双水相萃取用于生物产品分离. 此后, 对于双水相体系的研究和应用逐步展开, 并取得很大进展. 现在双水相萃取已被广泛用于蛋白质、酶、核酸、病毒、细胞、细胞器等生物产品的分离和纯化, 并逐步向工业化生产迈进, 展现了在食品工业、生物学研究和生物工程方面的巨大应用前景, 将有力推动生物技术的发展.
常用的双水相体系是聚乙二醇/葡聚糖体系和聚乙二醇/磷酸盐体系. 物质在两相中的选择性分配是疏水键、氢键和离子键等相互作用的结果. 影响蛋白质及细胞碎片在双水相体系中分配行为的主要参数有成相聚合物的种类、成相聚合物的分子质量和总浓度、无机盐的种类和浓度、pH 值、温度等.
双水相萃取主要具有如下基本特点:(1) 体系有生物亲和性. 含水量高, 水分含量通常高为70%～90%, 是在接近生理环境温度和体系中进行萃取, 不会引起生物活性物质失活或变性. (2) 易于工程放大和连续操作. 在提取酶等生物活性物质的过程中, 双水相萃取能够在较少的溶液量和较短的操作时间内获得较高产量的产品. 另外, 操作能够容易、精确地按比例放大, 非常适合大规模应用, 可进行连续生[2]
产. (3) 界面张力小, 有助于生物活性与强化相际间的质量传递. (4) 分相时间短, 一般为5～15min. (5) 不存在有机溶剂残留问题. (6) 能进行萃取性的生物转化. 在一些双水相体系中可将发酵生产过程中的生物转化与下游处理的第1步相结合, 即生物
[1]
1 引 言
21世纪是生物工程技术占主导地位的时代, 而
生化分离是生物工程技术转化为生产力传统的过程中必不可少的重要环节. 由于生物工程技术特别是细胞工程、基因工程、蛋白质工程等技术产品的特殊性, 要求分离技术既具有较高的分离效率又不影响产品的生物活性. 传统的液-液萃取分离技术成本低, 易于操作, 已广泛用于多组分物质的分离, 但是由于缺乏相应的生化溶剂, 难以分离蛋白质、核酸等大分子生物活性物质; 随着液相色谱技术的发展, 特别是制备型色谱技术的应用, 使大多数生物分子的批量分离成为可能, 然而由于该技术本身也存在某些局限性, 如有时会引起目标物的不可逆吸附, 甚至变性等现象, 在一定程度上限制了其在生化分离中的应用. 随着双水相萃取、反胶束萃取、膜萃取等一些新型萃取分离技术不断的发展, 由于这些技术可以选择性分离生物活性分子, 越来越来引起人们的重视.
2 新型萃取分离技术
211 双水相萃取
双水相萃取(aqueous tw o phasepartitioning ) 是1956年瑞典伦德大学的Albertss on 发现双水相体
收稿日期:2004206214
反应在其中一相中进行, 同时生成的反应产物被连续萃取到另一相中. 不仅解决了产物反馈抑制作用造成的产量低的问题, 而且酶在高聚物溶液中比在缓冲溶液中更稳定, 活性更大. 因为生物反应和生物产物的提取同时进行, 尤其适于连续生产. (7) 亲和萃取(亲和分配) 可大大提高分配系数和萃取专一性. 由于目标蛋白质与其他杂蛋白的理化性质相近, 造成其萃取专一性不高. 亲和萃取就是将一种和目标蛋白质有很强亲和力的配基与一种成相聚合物共价结合, 该成相聚合物与另一种成相聚合物形成双水相体系进行萃取时, 目标蛋白质专一性地进入结合有配基的那种成相聚合物所在相中, 其它杂蛋白则进入另一相
[3,4]
术, 尤其是电敏凝胶, 具有快速、简便和无污染的特点, 很有可能更快的获得工业应用
[13]
. 但凝胶本身
的性质由很多种因素确定, 但主要的影响因素, 则是凝咬的离子度和联度. 对凝胶胀缩机理目前有两种不同的解释. 其确切的阐述还需要进一步试验研究证实.
213 反胶束萃取
反胶束(reversed micelle ) 是双亲物质在非极性有机溶剂中自发聚集体, 又称为反胶团、逆胶束. 1977年,Luisi 等首先发现胰凝乳蛋白酶可以溶解于
双亲物质(表面活性剂) 的有机溶剂中, 超离心数据显示有机相中反胶束的存在, 同时, 光谱分析表明这一过程未引起酶的变性. 随后的20多年里, 反胶束萃取技术已广泛应用于蛋白质的分离和纯化, 并逐渐延伸至其他生物分子(氨基酸、抗生素、核酸) 的分离研究; 近年来, 该技术结合其他一些技术、方法的应用正在研究和开发, 显示了良好的应用前景.
与其它的分离技术相比, 蛋白质等生物活性分子通过反胶束增溶于有机溶剂而不影响其活性, 这是分离技术研究的一项突破. 反胶束萃取技术的应用过程中, 不存在毒性试剂, 对人体无害, 而且反胶束溶液可以反复利用, 亲和配体的引入, 提高了目标物的萃取率及分离的选择性.
通常, 形成反胶束的有机溶剂为脂肪烷烃; 双亲物质根据其极性头基性质的不同, 可分为以下4种类型:非离子型(如脂肪醇聚氧乙烯醚) , 阳离子型(如丁二酸二2222乙基已基质磺酸钠) , 阴离子型(如
.
[5～7]
双水相萃取技术目前仍不是十分成熟, 在其运用中存在一定的问题
. 成相聚合物价格昂贵是
阻碍该技术应用于工业生产的主要因素. 葡聚糖价格很高, 用粗品代替精制品又会造成葡聚糖相粘度太高, 使分离困难. 研究应用最多的PEG 并不是双水相体系最适合的聚合物, 磷酸盐又会带来环境问题, 故开发新的聚合物是该技术应用急需解决的问题. Niss on 等人利用改性淀粉代替dextran 取得了比较好的结果. 212 凝胶萃取
[8]
凝胶萃取(G el Extraction ) 是Cussler 等在1984年首次提出的分离过程. 它是利用凝胶在溶剂中溶胀特性和凝胶网络对大分子、微粒等的排斥作用达到溶液浓缩分离的目的. 凝胶是一种吸收液体而溶胀的交联聚合物网络, 具有介入固体和液体的物质形态. 凝胶的性质在很大程度上取决于聚合物的网络和液体介质的相互作用. 液体介质阻止聚合物网络皱缩成致密物质, 而聚合物网络则阻止液体流失. 当外部条件, 如温度、溶剂组成等发生变化时, 凝胶可以发生可逆的、非连续的溶胀和皱缩, 吸收或释放出液体, 其体积变化常达数百乃至数千倍. 凝胶对所吸收的液体只具有选择性, 即它只吸收小分子物质而不吸收如蛋白质等大分子物质.
凝胶萃取分离技术相比其它分离方法, 它的设备简单、能耗低, 所用的凝胶再生比较简单, 有着良好的应用前景敏型
[12]
[9～11]
二辛基二甲基氯化铵) , 两性离子剂(如卵磷脂(; 某些双亲物质, 如三辛基甲基氯化铵, 卵磷脂, 需要加
入一定量的注表面活化剂(一般为C 4～C 12脂肪醇) 才能形成稳定的反胶束体系.
[14]
K arpe 等研究了α2凝乳蛋白酶在AOT/异辛烷体系中的酶超活性, 用双电层理论解释, 同时考虑局部电场强度和局部离子强度影响. 通过计算, 很好地符合泊松2玻兹曼等式. Rergalado C 等
[15]
用AOT/
异辛烷反胶束体系从辣根的粗渗透水液中经两阶段萃取提纯辣根过氧化物酶(H R P ) . 前萃利用H R P 溶解时窄的pH 值范围而除去杂质蛋白质, 在第二次萃取中, 用水相与有机相之比为10来选择性溶解并浓缩HRP. HRP 最终特异活性为86, 纯化80倍, 产率为46%.J PHE N 等
[16]
. 凝胶萃取根据凝胶在发生相变
时, 外界条件的不同, 可以分为温敏型、酸敏型和电
.
采用卵磷脂/黄油反胶束
凝胶萃取, 不论其是温敏、酸敏或电敏型, 均可能成为取代超滤或蒸发浓缩高分子溶液的新分离技
体系, 利用Candidavylindracea 脂酶水解奶油, 在温度为56℃、pH 值4～6、W 0为10时分别使酶活性达最
大值, 在一定范围内, 增大表面活性剂或酶的浓度, 酶的活性同时也增加. 另外, 此体系中酶的耐热性有很大提高. 陈复生等
[17]
以液膜为分离介质、以溶度差为推动力的膜分离操作. 它与溶剂萃取是机理不同, 但都属于液2液系统的传质分离过程. 由于液膜分离技术具技术因其选择性和逆浓度梯度传递等优点, 在生物工程领域的应用引起了众多学者的极大兴趣. 目前液膜分离技术已经广泛应用于有机酸、氨基酸、抗生素、脂肪酸等生化产物的分离、提取.
M onlinari 等
[22]
用AOT/异辛烷反胶束体系
同时萃取植物蛋白和油脂, 采用正交试验, 确定了最佳工艺条件:时间50min , K Cl 浓度0115m ol ΠL ,AOT/异辛烷为8g/50m L. 得到影响萃取效果各因素主次顺序:时间>AOT/异辛烷>K Cl 浓度.
大量的研究表明利用反胶束技术提取分离酶和蛋白质等具有可行性和优越性. 但反胶束技术目前仍限于实验室研究, 没有商品化产品. 主要是由于对反胶束萃取的机理不清楚, 尤其是酶在其中的作用机理; 而且还缺乏合适的满足食品工业需要的天然安全反胶束体系. 通过进一步对萃取动力学的热力学过程的认识. 特别是随着新型天然安全反胶束体系的开发, 则可在油脂水解、植物蛋白和油脂的分离、发酵滤液的提取上实现工业化生产. 214 膜萃取
人报道了利用支撑液膜萃取苯丙
氨酸, 以季铵盐Aliquat 2336作载体、煤油作为有机溶剂从水溶液中提取苯丙氨酸、提出了一种传质理论, 并讨论了载体浓度、温度、载体组分等因素的影响.
莫凤奎等
[23]
人利用S pan 280作为表面活性剂,
煤油作为有机溶剂从北豆根中提取北豆根总碱. 文中考察了膜材料、外相pH 值、内相盐酸浓度、表面活性剂种类以及用量等因素对北豆根总碱提取率的影响, 得出了一个萃取北豆根总碱的最佳条件, 萃取率达到85%.
报道了利用AOT 和S pan 280混合反
胶团作为载体的乳化液膜对α2chym otrypsin 进行萃
Stobbe 等
[24]
膜萃取(Membrane extraction ) 是膜过程和液2液萃取过程集合形成的一种分离技术,1984年K im BM 等人
[18]
提出膜萃取分离技术以来, 随着对该技术的
取, 最大萃取率达98%, 但只有65%被回收, α2chym otrypsin 的活性保持在60%左右. 并提出利用液
不断深入研究, 膜萃取分离技术得到了很大的发展, 在诸如药物提取、有机物萃取、金属萃取等领域得到了广泛的应用.
与传统萃取技术相比, 膜萃取可以减少萃取剂在物料相中的夹带损失; 选择萃取剂时可以放宽对物性的要求; 过程可以免受“液泛”条件的限制, 减少了“返混”的影响; 易于实现同级萃取反萃过程, 且可得到很高的单位体积传质速率
Y amini 等
[20]
[19]
膜技术萃取蛋白质具有较为广阔的前景.
经过30多年的发展, 液膜萃取在机理探讨和应用研究方面都有很大的进展. 但是液膜萃取过程中的不同相之间的可能存在的相互渗透, 大面积支撑液膜的形成与支撑液体的流失等问题难以解决. 到目前为止, 液膜稳定性和破乳技术仍然是制约液膜技术工业化的关键因素, 因而, 液膜萃取技术的应用研究大多仍停留在实验室阶段, 要达到大规模工业应用水平还需作大量工作. 而且选择好的表面活性剂、提高液膜稳定性、减少液膜的破损也是研究的热点.
216 超临界萃取
.
报道了用膜从水溶液中萃取分离
醚类有机物的研究, 其萃取效率大于95%.Lauritsen 等
[21]
将MI MS 技术用于生物反应监测的研究, 结果
-12
表明, 该项技术可实现10级水平的在线监测生物
反应, 这不但开辟了膜萃取应用的新领域, 还为人们在痕量水平监测生物反应提供了新的手段.
膜萃取技术是80年代初发展起来的一种新型的高效分离技术, 在生物活性物质分离、生物及食品工业、环境保护、石油化工等方面得到广泛的应用. 但注意的是, 在膜萃取中, 由于有机溶剂的作用, 常使膜发生溶胀, 从而严重影响其传质效率, 因此, 开发能耐溶胀的膜材料及强化膜的传质是实现膜萃取工业化的关键, 也是膜萃取研究的热点. 215 液膜萃取
超临界流体萃取(supercritical fluid extraction , SFE ) 是新型的提取技术, 它以超临界条件下的气体
作为萃取剂, 从液体或固体中萃取出某些成分并进行分离的技术. 近十几年来,SFE 技术在食品、医药、生物化工等领域的应用研究取得了长足的进步, 已逐步地从实验室走出了工业化规模阶段.
与一般液体萃取相比,SFE 的萃取速率和范围更为扩大. 萃取过程是通过温度(T ) 和压力(P ) 的调节来控制与溶质的亲和性而实现分离的. 通过调节
T 、P 可提取纯度较高的有效成分或脱出有害成分;
液膜萃取法(liquid membrance extraction ) 是一种
选择适宜的溶剂如C O 2可在较低温度或无氧环境下操作, 分离、精制热敏性物质和易氧化物质; SFE 还具有良好的渗透性利溶解性, 能从固体或粘稠的原料中快速提取有效成分; 降低超临界流体的密度, 容易使溶剂从产品中分离, 无溶剂污染, 且回收溶剂无相变过程, 能耗低; 兼有萃取和蒸馏的双重功效, 可用于有机物的分离、精制; 同类物质, 如有机同系物, 按沸点升高顺序进入超临界相.
A12Jabari 等
[25]
溶剂(60%乙醇) , 以5min 作为一个循环, 萃取率可达83%, 经5个循环后大部分营养成分被萃取.
与传统的萃取技术、样品制备技术相比较, 微波萃取技术具有以下特点:质量高、产量大、对萃取物料具有较高的选择性, 反应或萃取快, 能耗低, 安全, 无污染. 但到目前为止, 它主要还是作为一种分析试样预处理的手段和一种提取精油等有用物质的方法, 其研究处于初期阶段. 萃取机理论上还有待于深一步地研究. 鉴于微波能对萃取过程中传质传热的促进作用, 将其应用于生物成分的提取和浓缩必会产生很好的效果. 同时, 如果能在仪器设计上实现突破, 使微波萃取象超临界流体萃取那样与检测仪器实现在线联机, 则该方法将会得到进一步发展. 218 固相微萃取
1989年,Belardi 与Pawliszyn 提出固相微萃取(s olid phase microextraction ,SPME ) 技术以来, 固相萃
, 通过试验建立了超临界萃取的
动力学模型, 并指出了传递过程随温度、压力的变化规律, 为萃取参数的确定提供基本的理论依据. G e 等E.
SFE 技术已走出实验室进入规模化生产阶段,
[26]
利用C O 2超临界萃取分离了小麦中的维生素
工业生产不断扩大, 萃取产品种类不断涌现. SFE 作为一种新型萃取技术大规模应用于工业生产, 还需研究SFE 的热力学特性和传质规律, 建立萃取系统的动态传质模型, 以预测并且要进一步探讨萃取机理, 开发萃取工艺, 特别是探讨溶剂、物料性质对萃取过程及对食品物料大分子以提高萃取率和产品纯度
[27]
取作为化学分离和纯化的一个强有力工具出现了. 从痕量样品的前处理到工业规模的化学分离, 吸附剂萃取在制药、精细化工、生物医学、食品分析、有机合成、环境和其他领域起着越来越重要的作用.
固相微萃取技术的主要优点是:不用或少用溶剂; 操作简便; 易于自动化和与其他技术在线联用. 与其他常用的富集技术相比, 克服了传统的液2液萃取法需使用大量溶剂和样品、处理时间长、操作步骤多的缺点. SPME 与近年来新发展的样品前处理技术相比也具有独到之处, 如:超临界流体萃取装置价格昂贵, 不适于水样分析; 以溶剂脱附的固相萃取法回收率低; 热脱附的固相萃取法需要专用的加热装置, 且固体吸附剂的孔隙易被堵塞.
SPME 最初与G C 联用主要用于生物样品的分
. 目前, 应用于工业生产的萃取设备还未实现
规范化, 配套性也不尽合理, 对此, 应以传递模型为基础, 建立设备放大的数学模型, 以便工业设计. 同时还应降低设备成本、以便利于推广. 217 微波萃取
微波萃取技术(microwave 2assisted Extraction T echnique ) 是指使用微波及合适的溶剂在微波反应器中从各种物质中提取各种化学成分的技术和方法. 1986年, 美国科学家首先利用微波进行微波萃取以来, 微波萃取技术在食品化学领域飞速发展, 现阶段主要包括食品分析的样品制备(包括土壤、水分、水质和空气过滤物的污染物, 食品中的营养成分, 动植物组织中的药物和农药残留物) , 植物天然成分的提取. 以及和新兴的分离技术的配合如超临界流体萃取技术的配合解决溶剂残留问题等.
K av ocs 等
[28]
析. 李朴等
[31]
应用酶解2气质联用法测定生物检材
中安定的含量, 应用糜蛋白酶, 固萃取法提取后, 提高了生物检材中安定的提取率.
近些年来,SPME 研究成为一个热点,SPME 技术正在进一步的完善. SPME 发展与其他仪器, 如傅里叶变换红外光谱(FTIR ) 、电感耦合等离子体质谱仪(ICP 2M5) 及拉曼光谱仪联用的情况也有报道. SPME 正朝着多样化、仪器化、标准化的方向发展.
用奶酪等四种食品在不同温度、不
同时间下微波萃取, 以考察微波萃取氨基酸的萃取效率以及可重现性, 结果表明与传统萃取方法相比, 微波萃取法萃取率高10%, 而时间减少66%, 是一种有效的氨基酸萃取技术.
陈翠莲等
[29]
3 展 望
随着生物技术的不断发展, 由于生物技术产品的特殊性, 传统的萃取分离技术已经远远不能满足生物产品的分离需要. 生物技术在科研和生产过程
从预混合饮料中使用微波成功萃
[30]
取维生素A 、维生素D 、维生素E. K yungeun 将人
参粉碎至60目左右的粗细度后以1g Πm L 的量加入
中, 存在着大量的蛋白质、多肽和核工业酸等到生物
大分子的分离和纯化工作. 迫切需要高效快速成的分离和制备方法. 特别是基因工程及细胞工程的蛋白质类大分子的回收, 既要考虑使用高选择性的分离、纯化方法, 又要考虑不影响产品的生物活性的因素, 近20年来, 人们进行了大量的研究, 开发了许多新技术、新材料和新设备. 但是仍有几个待改进的方面:(1) 这些技术的大多数还没有工业化, 解决这些技术在工业化过程中的障碍是当今萃取分离技术发展的一个方向, 如膜的溶胀及带来的寿命问题等.
(2) 技术的联用, 如固相微萃取与气相、液相联用等. (3) 萃取方法的影响因素和分离机理的探索, 一些萃
取方法的机理如反胶束萃取还没有完全研究明白, 有待于进一步的探索.
总之, 随着生化产品的广泛应用, 新型萃取技术将在生化技术产品的分离过程起着越来越重要的作用. 因此, 更应加强对新型萃取技术的研究以期缩短与国外的差距, 使这些高新技术在国内得到广泛应用.
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Application of N e w Extraction T echnique to Biotechnology
Liu Bo Wang Y ing feng G uo Xueqing
(The Analysis T est Center ,Capital N ormal University ,Beijing 100037)
Abstract
In this paper , the application of new extraction techniques :aqueous tw o phasepartitioning , gel extraction , reversedmicelle , membrane extraction , liquid membrance extraction , supercritical fluid extraction , microwave 2assisted extraction technique and s olid phase microextraction in biotechnology was introduced.
K ey w ords :extraction, separation , biotechology.
(上接第25页)
The Prepartation and Characterization of Surface 2modified N ano 2zirconia
Chen Wen Zhang Cunlin Y ang X iaoyi
(Physics Department of Capital N ormal University 100037)
Abstract
The mechanisms about the aggregation and dispersibility of nano 2zirconia were analyzed in detail. And nano 2zirconia powders which were surface 2m odified with acrylic acid were prepared in order to disperse hom ogeneously in acetone in this investigation. Research and characterization on the structure and surface characteristic of surface 2m odified nano 2zirconia were achieved by TG,TE M and FT 2IR. The results given by FT 2IR showed acrylic acid was jointed on the surface of nano 2ziconia after dehydration reaction between carboxyl and the hydroxy on the surface of nano 2zirconia. The images provided by TE M presented intuitionistic effects of surface m odification on the dispersibility of nano 2zirconia in acetone. And the TG analysis ascertained the am ount of acrylic acid that was jointed on the surface of nano 2zirconia.
K ey w ords :zirconia, surface m odification , acrylic acid , dispersibility.
作者简介 陈文, 首都师范大学物理系02级研究生.