超氧化物歧化酶的制备及其临床应用

第25卷第4期　　　　　　　武　汉　化　工　学　院　学　报　　　　　　　　Vol.25　No.42003年12月　　　　　　　　J.　Wuhan　Inst.　Chem.　Tech.　　　　　　　　　Dec.　2003

文章编号:10044736(2003)04001603

超氧化物歧化酶的制备及其临床应用

汪立耀

(武汉化工学院化工与制药学院,湖北武汉430073)

摘　要:目前,超氧化物歧化酶已经从多种生物有机体中提取并纯化.本文介绍了超氧化物歧化酶的分类和活性中心分子结构,阐述了超氧化物歧化酶的制备工艺及其医学应用.关键词:超氧化物歧化酶;SOD的制备工艺;SOD临床应用中图分类号:R931.6　　　文献标识码:A

0　引　言

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)是广泛存在于需氧生物体内一组重要的抗氧化清超氧阴离子的金属酶类.它对急性炎症如水肿、肺气肿、自身免疫性疾病等均有很好的疗效,开发应用前景广阔.

SOD各只含一个亚基,锰离子处在三角双锥的配位环境中,其中一个轴向配体为H2O,另一个轴向位置为蛋白质辅基的配位基;FeSOD的活性中心是由3个HisImN和1个天冬氨酸羧氧基成扭曲四面体配位[10].

[9]

1　SOD的性质

1.1　SOD的分类及其在有机体内的主要分布

根据SOD辅基部分结合金属离子的不同,可以将其分为三种类型,即含铜和锌离子(Cu/ZnSOD)、含锰离子(MnSOD)

[1,2]

SOD)和含铁离子(Fe

图1　铜和锌的配位图

Fig.1　Coordinationofcopperandzinc

.三种SOD在原核和真核生物中的分布

及细胞的定位有所不同.Cu/ZnSOD主要存在于叶绿体、细胞质和过氧化物酶体中[3];MnSOD主要位于线粒体中,当线粒体中的核酸DNA受到氧自由基的攻击后,产生8羟基去氧鸟嘌呤核苷酸,该产物是导致衰老的主要原因,而MnSOD具有阻止其损伤作用;FeSOD则主要存在于植物的叶绿体中.

1.2　SOD活性中心的结构分析

目前,通过X射线衍射分析、光谱分析、核磁共振谱、电子光谱及电镜等多种近代分析方法和研究手段,获得了不少有关SOD活性中心的分子结构信息.Cu/Zn

SOD酶由两个亚基组成,每个

2+

2+

2+

2+

2+

[4,5]

2　SOD的制备工艺

制备SOD的方法较多,工艺也不完全相同,

其基本工艺流程为:原料预处理;除去大部分杂蛋白得到SOD粗品;再经柱色谱分离得到SOD精制品.

2.1　原料预处理

所选原料不同,使用的处理方法也有所不同.对于动物血如牛血、猪血、马血、人血等,SOD主要存在于红细胞中,将动物血通过离心得到红细胞,加入等体积水,溶血后得到SOD的提取液.

从植物中提取SOD,首先将植物组织用高速组织捣碎器或绞肉机破碎后,超速离心,用水或缓冲液提取[12].常用的缓冲液有柠檬酸柠檬酸钠、醋酸醋酸钠、磷酸二氢钾磷酸氢二钾、磷酸二氢铵,也可用较低浓度的盐溶液如氯化钠溶液提取.

从微生物中提取SOD,一般要采用较剧烈的

[11]

亚基各含一个Cu和一个Zn,Zn和Cu都处于四面体配位环境中,Cu位于一扭曲的四方平面中,分别和44位、46位、61位和118位的组氨酸形成配位键,Cu2+和Zn2+之间共连1个组氨酸H61的咪唑基形成含咪唑桥的扩展结构[6～8],铜和锌的配位情况见图1;Mn

收稿日期:20030501

[8]

SOD和Fe

第4期汪立耀:超氧化物歧化酶的制备及其临床综述

17

方法,将微生物细胞破碎后高速离心提取.常用细胞破碎方法有自溶[13]、干燥处理、捣碎、研磨、超声波震荡等,对细胞表面较脆弱的菌体还可采用快速冻融法.2.2　除去杂蛋白

上述方法得到的SOD提取液,用以下除杂方法除去大部分杂蛋白质成份,得到SOD粗产品.2.2.1　盐析法　在动物血的SOD提取液中加入一定量乙醇或氯仿,搅拌,静置,离心除去血红蛋白[14];加入磷酸氢二钾或磷酸氢二铵,离心去沉淀后即得SOD的粗酶液.

2.2.2　热变性法　加热使杂蛋白质变性沉淀.即将SOD提取液在不断搅拌下水浴加热(60～70℃)约10min,迅速冷却,滤去沉淀[15],也可在水浴加热前于SOD提取液中加入适量金属盐(金属盐的质量浓度不超过0.5g/mL).

2.2.3　超滤法　当大规模制备SOD时,可先用超滤浓缩后加热变性

[16]

大量有害的O・,损伤细胞及核酸DNA,而SOD

2

可清除O・,保护细胞免受伤害

2

[20]

.当SOD作为

辐照防护剂时,其效果要比对辐射病者的治疗效果要好,因此可对有可能受到电离辐射的人员进行注射SOD预防.

3.2　治疗和预防自身免疫性疾病

SOD对各种自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、甲状腺炎、重肌无力等很有疗效.对类风湿性关节炎患者要在急性期病变未形成之前进行注射SOD治疗效果要好些.3.3　在肿瘤发生发展中的作用

在人体内,Mn

SOD基因表达的增加能抑制

[21]

因辐射引起的肿瘤的形成,并增加成纤维细胞的分化能力,有效地防止肿瘤的恶性发展

.

3.4　对老年性白内障的治疗和预防

在进入老年期前开始经常服用抗氧化剂或注射SOD,可有效地预防老年性白内障的发生.对老年性白内障患者注射SOD治疗也有一定效果.3.5　治疗再灌注综合征

缺血再灌注时会产生大量有害的氧自由基尤其是O・,从而导致组织损伤[22].在再灌注前,先

2

.即将SOD提取液以

10～20L/h流速通过中空纤维超滤器,得到浓缩液,再用热变性法制得SOD粗产品.2.3　分离、纯化

SOD的精制常用柱色谱法,利用固定相和淋洗液(离子交换剂)对溶液不同组份的吸附力和解吸附速度的不同,使SOD同杂质分离开得到SOD精制酶液,也可用水玻璃为主要原料的硅胶柱吸附分离

[17]

.陈浩

[18]

行注射SOD或将SOD混合在灌注液中同时灌

注,可以有效地预防各种自由基引起的损伤.3.6　促进骨折愈合

骨折后内源SOD和注射的外源SOD能促进细胞分裂、增殖,并向成骨细胞转化,促进骨折后骨的生长,缩短骨折愈合时间,可用作促进骨折愈合的辅酶

[23]

等将SOD粗品通过柱色谱纯

化,用磷酸盐缓冲液作淋洗液,以氯化镁溶液作洗脱液,可得到较高纯度的SOD.SOD在溶液状态易丧失活性,经常将所得精制酶液经浓缩后冷冻干燥保藏.

.此外,SOD还可有效地治疗氧中毒、

[24]

3　SOD药用

SOD的药用主要用于治疗因超氧阴离子自由基(O・)伤害引起的疾病,它能催化O・使之

2

2

急性炎症、水肿及肺气肿等疾病,可治疗银屑病、皮炎、湿疹和瘙痒症等多种皮肤病抗衰老药使用,减缓人体衰老.参考文献:

[1]　杜秀敏,殷文璇,赵彦修,等.超氧化物歧化酶(SOD)

研究进展[J].中国生物工程杂志,2003,23(1):4850,74.

[2]　张弘浩,赵晓瑜,静天玉.重组人超氧化物歧化酶的

复性[J].中国生化药物杂志,2003,24(1):3245.

[3]　AsadaK.Productionandactionofactiveoxygenin

photosynthetictissue[M].BocaRatonFL:CRCPress,1994.

[4]　BowlerC,CanpWV,MontguMV,etal.Superoxide

Cr33,

.也可作为

转变为H2O2和O2的歧化反应.

2O・+2H

2

SOD

2O2+O2

所产生的H2O2可通过生物机体内的过氧化氢或谷胱甘肽过氧化物酶体系清除.这些使SOD具有良好的抗辐射、抗炎、抗肿瘤、抗衰老等作用.可作为保健食品、治疗药物和化工产品的原料

[19]

.

3.1　辐射与辐射预防

18

199.

[5]　吕　星,孙志贤,吴祖泽,等.人Mn

武汉化工学院学报第25卷

[15]　张尔贤,李建喜,肖　湘,等.鲨鱼肝超氧化物歧化

SOD基因结构

酶的纯化与部分性质研究[J].中国药学杂志.1999,34(4):231233.

[16]　谭天伟,戚以政,莫锡荣.用中空纤维超滤膜从猪血

中纯化超氧化物酶[J].中国医药工业杂志,1995,26(9):386389.

[17]　赵　辉,沈孟长,钱　雯,等.铜锌超氧化物歧化酶

的硅胶吸附法[J].中国生化药物杂志,1995,16(4):151154.

[18]　陈　浩,张炳然,黄瀛寰,等.亲和色谱法纯化Cu,

ZnSOD[J].中国医药工业杂志,1993:24(3):97100.

[19]　崔慧斐,张天民.超氧化物歧化酶在食品和化妆品

中的应用及其发酵法生产进展[J].药物生物技术,2000,7(3):187189.

[20]　张艳红,寥晓全,袁勤生.人锰超氧化物歧化酶

(hMn

SOD)的研究进展[J].药物生物技术,

2001,8(6):352356.

[21]　张艳红,寥晓全,袁勤生,等.重组人锰超氧化物歧

化酶工程菌高效表达培养工艺的研究[J].中国药学杂志,2002,37(1):5962.

[22]　魏文树,曾昭全,刘锡钧.超氧化物歧化酶的研究进

展[J].药物生物技术,2003,10(4):256260.

[23]　马　王景,徐　燕,邓廉夫.应用SOD后实验性骨痂

超微结构观察及体视学分析[J].中国生化药物杂志,1998,19(6):365368.

[24]　袁勤生.SOD在医药、食品和日化工业上的应用

[J].中国生化药物杂志,1994,15(4):289293.

[J].生命的化学,1998,18(2):2022.

[6]　ZhangBorun,TanHuarong.Studyprogressand

applicationprospectofsuperoxidedismutase[J].

MicrobiolBull,1992,19(6):352357.

[7]　张龙泽,马书林.SOD模拟化合物的研究进展[J].药

学学报,2002,37(3):235240.

[8]　蔡敬杰,樊　志.超氧化物歧化酶的研究进展[J].天

津化工,1997,(2):24.

[9]　FangYunzhong,LiWenjie.FreeRadicalandEnzyme

-BasicTheoriesandAppicationinBiologyandMedicine[M].Beijing:SciencePress,1994.

[10]　StoddardBL,HowellPL,RingeD,etal.The2.1

resolutionstructureofironsuperoxidedismutasefrompseudomonasovalis[J].Biochem,1990,29:88518891.

[11]　刘　栋,张秀珍,张天民,等.动物血来源超氧化物

歧化酶的制备及其制剂[J].中国药学杂志,1998,33(12):708710.

[12]　何　俊,李毓琦,白小清,等.新疆葡萄干超氧化物

歧化酶的分离提纯[J].中国生化药物杂志,1994,15(1):1518.

[13]　曲爱琴,姬胜利,尚雪原,等.酵母SOD的研究[J].

药物生物技术.1997,4(2):98101.

[14]　刘声远,刁爱坡.牛血Cu,ZnSOD提取中除血红

蛋白不同方法的比较研究[J].中国生化药物杂志,1996,17(5):203205.

Preparationandclinicaluseofsuperoxidedismutase

WANGLiyao

(SchoolofChemicalEngineeringandPharmacy,WuhanInstitueofChemicalTechnology,Wuhan430073,China)

Abstract:Superoxidedismutasewasisolatedandpurifiedfrommanyorganisms.Theclassificationandactivesitestructureofmolecularofsuperoxidedismutasewereintroduced,andpreparationtechnologyandapplicationofsuperoxidedismutasesinmedicinewereelucidated.

Keywords:superoxidedismutase;preparationtechnologyofSOD;SODclinicaluse

本文编辑:传一点

第25卷第4期　　　　　　　武　汉　化　工　学　院　学　报　　　　　　　　Vol.25　No.42003年12月　　　　　　　　J.　Wuhan　Inst.　Chem.　Tech.　　　　　　　　　Dec.　2003

文章编号:10044736(2003)04001603

超氧化物歧化酶的制备及其临床应用

汪立耀

(武汉化工学院化工与制药学院,湖北武汉430073)

摘　要:目前,超氧化物歧化酶已经从多种生物有机体中提取并纯化.本文介绍了超氧化物歧化酶的分类和活性中心分子结构,阐述了超氧化物歧化酶的制备工艺及其医学应用.关键词:超氧化物歧化酶;SOD的制备工艺;SOD临床应用中图分类号:R931.6　　　文献标识码:A

0　引　言

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)是广泛存在于需氧生物体内一组重要的抗氧化清超氧阴离子的金属酶类.它对急性炎症如水肿、肺气肿、自身免疫性疾病等均有很好的疗效,开发应用前景广阔.

SOD各只含一个亚基,锰离子处在三角双锥的配位环境中,其中一个轴向配体为H2O,另一个轴向位置为蛋白质辅基的配位基;FeSOD的活性中心是由3个HisImN和1个天冬氨酸羧氧基成扭曲四面体配位[10].

[9]

1　SOD的性质

1.1　SOD的分类及其在有机体内的主要分布

根据SOD辅基部分结合金属离子的不同,可以将其分为三种类型,即含铜和锌离子(Cu/ZnSOD)、含锰离子(MnSOD)

[1,2]

SOD)和含铁离子(Fe

图1　铜和锌的配位图

Fig.1　Coordinationofcopperandzinc

.三种SOD在原核和真核生物中的分布

及细胞的定位有所不同.Cu/ZnSOD主要存在于叶绿体、细胞质和过氧化物酶体中[3];MnSOD主要位于线粒体中,当线粒体中的核酸DNA受到氧自由基的攻击后,产生8羟基去氧鸟嘌呤核苷酸,该产物是导致衰老的主要原因,而MnSOD具有阻止其损伤作用;FeSOD则主要存在于植物的叶绿体中.

1.2　SOD活性中心的结构分析

目前,通过X射线衍射分析、光谱分析、核磁共振谱、电子光谱及电镜等多种近代分析方法和研究手段,获得了不少有关SOD活性中心的分子结构信息.Cu/Zn

SOD酶由两个亚基组成,每个

2+

2+

2+

2+

2+

[4,5]

2　SOD的制备工艺

制备SOD的方法较多,工艺也不完全相同,

其基本工艺流程为:原料预处理;除去大部分杂蛋白得到SOD粗品;再经柱色谱分离得到SOD精制品.

2.1　原料预处理

所选原料不同,使用的处理方法也有所不同.对于动物血如牛血、猪血、马血、人血等,SOD主要存在于红细胞中,将动物血通过离心得到红细胞,加入等体积水,溶血后得到SOD的提取液.

从植物中提取SOD,首先将植物组织用高速组织捣碎器或绞肉机破碎后,超速离心,用水或缓冲液提取[12].常用的缓冲液有柠檬酸柠檬酸钠、醋酸醋酸钠、磷酸二氢钾磷酸氢二钾、磷酸二氢铵,也可用较低浓度的盐溶液如氯化钠溶液提取.

从微生物中提取SOD,一般要采用较剧烈的

[11]

亚基各含一个Cu和一个Zn,Zn和Cu都处于四面体配位环境中,Cu位于一扭曲的四方平面中,分别和44位、46位、61位和118位的组氨酸形成配位键,Cu2+和Zn2+之间共连1个组氨酸H61的咪唑基形成含咪唑桥的扩展结构[6～8],铜和锌的配位情况见图1;Mn

收稿日期:20030501

[8]

SOD和Fe

第4期汪立耀:超氧化物歧化酶的制备及其临床综述

17

方法,将微生物细胞破碎后高速离心提取.常用细胞破碎方法有自溶[13]、干燥处理、捣碎、研磨、超声波震荡等,对细胞表面较脆弱的菌体还可采用快速冻融法.2.2　除去杂蛋白

上述方法得到的SOD提取液,用以下除杂方法除去大部分杂蛋白质成份,得到SOD粗产品.2.2.1　盐析法　在动物血的SOD提取液中加入一定量乙醇或氯仿,搅拌,静置,离心除去血红蛋白[14];加入磷酸氢二钾或磷酸氢二铵,离心去沉淀后即得SOD的粗酶液.

2.2.2　热变性法　加热使杂蛋白质变性沉淀.即将SOD提取液在不断搅拌下水浴加热(60～70℃)约10min,迅速冷却,滤去沉淀[15],也可在水浴加热前于SOD提取液中加入适量金属盐(金属盐的质量浓度不超过0.5g/mL).

2.2.3　超滤法　当大规模制备SOD时,可先用超滤浓缩后加热变性

[16]

大量有害的O・,损伤细胞及核酸DNA,而SOD

2

可清除O・,保护细胞免受伤害

2

[20]

.当SOD作为

辐照防护剂时,其效果要比对辐射病者的治疗效果要好,因此可对有可能受到电离辐射的人员进行注射SOD预防.

3.2　治疗和预防自身免疫性疾病

SOD对各种自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、甲状腺炎、重肌无力等很有疗效.对类风湿性关节炎患者要在急性期病变未形成之前进行注射SOD治疗效果要好些.3.3　在肿瘤发生发展中的作用

在人体内,Mn

SOD基因表达的增加能抑制

[21]

因辐射引起的肿瘤的形成,并增加成纤维细胞的分化能力,有效地防止肿瘤的恶性发展

.

3.4　对老年性白内障的治疗和预防

在进入老年期前开始经常服用抗氧化剂或注射SOD,可有效地预防老年性白内障的发生.对老年性白内障患者注射SOD治疗也有一定效果.3.5　治疗再灌注综合征

缺血再灌注时会产生大量有害的氧自由基尤其是O・,从而导致组织损伤[22].在再灌注前,先

2

.即将SOD提取液以

10～20L/h流速通过中空纤维超滤器,得到浓缩液,再用热变性法制得SOD粗产品.2.3　分离、纯化

SOD的精制常用柱色谱法,利用固定相和淋洗液(离子交换剂)对溶液不同组份的吸附力和解吸附速度的不同,使SOD同杂质分离开得到SOD精制酶液,也可用水玻璃为主要原料的硅胶柱吸附分离

[17]

.陈浩

[18]

行注射SOD或将SOD混合在灌注液中同时灌

注,可以有效地预防各种自由基引起的损伤.3.6　促进骨折愈合

骨折后内源SOD和注射的外源SOD能促进细胞分裂、增殖,并向成骨细胞转化,促进骨折后骨的生长,缩短骨折愈合时间,可用作促进骨折愈合的辅酶

[23]

等将SOD粗品通过柱色谱纯

化,用磷酸盐缓冲液作淋洗液,以氯化镁溶液作洗脱液,可得到较高纯度的SOD.SOD在溶液状态易丧失活性,经常将所得精制酶液经浓缩后冷冻干燥保藏.

.此外,SOD还可有效地治疗氧中毒、

[24]

3　SOD药用

SOD的药用主要用于治疗因超氧阴离子自由基(O・)伤害引起的疾病,它能催化O・使之

2

2

急性炎症、水肿及肺气肿等疾病,可治疗银屑病、皮炎、湿疹和瘙痒症等多种皮肤病抗衰老药使用,减缓人体衰老.参考文献:

[1]　杜秀敏,殷文璇,赵彦修,等.超氧化物歧化酶(SOD)

研究进展[J].中国生物工程杂志,2003,23(1):4850,74.

[2]　张弘浩,赵晓瑜,静天玉.重组人超氧化物歧化酶的

复性[J].中国生化药物杂志,2003,24(1):3245.

[3]　AsadaK.Productionandactionofactiveoxygenin

photosynthetictissue[M].BocaRatonFL:CRCPress,1994.

[4]　BowlerC,CanpWV,MontguMV,etal.Superoxide

Cr33,

.也可作为

转变为H2O2和O2的歧化反应.

2O・+2H

2

SOD

2O2+O2

所产生的H2O2可通过生物机体内的过氧化氢或谷胱甘肽过氧化物酶体系清除.这些使SOD具有良好的抗辐射、抗炎、抗肿瘤、抗衰老等作用.可作为保健食品、治疗药物和化工产品的原料

[19]

.

3.1　辐射与辐射预防

18

199.

[5]　吕　星,孙志贤,吴祖泽,等.人Mn

武汉化工学院学报第25卷

[15]　张尔贤,李建喜,肖　湘,等.鲨鱼肝超氧化物歧化

SOD基因结构

酶的纯化与部分性质研究[J].中国药学杂志.1999,34(4):231233.

[16]　谭天伟,戚以政,莫锡荣.用中空纤维超滤膜从猪血

中纯化超氧化物酶[J].中国医药工业杂志,1995,26(9):386389.

[17]　赵　辉,沈孟长,钱　雯,等.铜锌超氧化物歧化酶

的硅胶吸附法[J].中国生化药物杂志,1995,16(4):151154.

[18]　陈　浩,张炳然,黄瀛寰,等.亲和色谱法纯化Cu,

ZnSOD[J].中国医药工业杂志,1993:24(3):97100.

[19]　崔慧斐,张天民.超氧化物歧化酶在食品和化妆品

中的应用及其发酵法生产进展[J].药物生物技术,2000,7(3):187189.

[20]　张艳红,寥晓全,袁勤生.人锰超氧化物歧化酶

(hMn

SOD)的研究进展[J].药物生物技术,

2001,8(6):352356.

[21]　张艳红,寥晓全,袁勤生,等.重组人锰超氧化物歧

化酶工程菌高效表达培养工艺的研究[J].中国药学杂志,2002,37(1):5962.

[22]　魏文树,曾昭全,刘锡钧.超氧化物歧化酶的研究进

展[J].药物生物技术,2003,10(4):256260.

[23]　马　王景,徐　燕,邓廉夫.应用SOD后实验性骨痂

超微结构观察及体视学分析[J].中国生化药物杂志,1998,19(6):365368.

[24]　袁勤生.SOD在医药、食品和日化工业上的应用

[J].中国生化药物杂志,1994,15(4):289293.

[J].生命的化学,1998,18(2):2022.

[6]　ZhangBorun,TanHuarong.Studyprogressand

applicationprospectofsuperoxidedismutase[J].

MicrobiolBull,1992,19(6):352357.

[7]　张龙泽,马书林.SOD模拟化合物的研究进展[J].药

学学报,2002,37(3):235240.

[8]　蔡敬杰,樊　志.超氧化物歧化酶的研究进展[J].天

津化工,1997,(2):24.

[9]　FangYunzhong,LiWenjie.FreeRadicalandEnzyme

-BasicTheoriesandAppicationinBiologyandMedicine[M].Beijing:SciencePress,1994.

[10]　StoddardBL,HowellPL,RingeD,etal.The2.1

resolutionstructureofironsuperoxidedismutasefrompseudomonasovalis[J].Biochem,1990,29:88518891.

[11]　刘　栋,张秀珍,张天民,等.动物血来源超氧化物

歧化酶的制备及其制剂[J].中国药学杂志,1998,33(12):708710.

[12]　何　俊,李毓琦,白小清,等.新疆葡萄干超氧化物

歧化酶的分离提纯[J].中国生化药物杂志,1994,15(1):1518.

[13]　曲爱琴,姬胜利,尚雪原,等.酵母SOD的研究[J].

药物生物技术.1997,4(2):98101.

[14]　刘声远,刁爱坡.牛血Cu,ZnSOD提取中除血红

蛋白不同方法的比较研究[J].中国生化药物杂志,1996,17(5):203205.

Preparationandclinicaluseofsuperoxidedismutase

WANGLiyao

(SchoolofChemicalEngineeringandPharmacy,WuhanInstitueofChemicalTechnology,Wuhan430073,China)

Abstract:Superoxidedismutasewasisolatedandpurifiedfrommanyorganisms.Theclassificationandactivesitestructureofmolecularofsuperoxidedismutasewereintroduced,andpreparationtechnologyandapplicationofsuperoxidedismutasesinmedicinewereelucidated.

Keywords:superoxidedismutase;preparationtechnologyofSOD;SODclinicaluse

本文编辑:传一点