α-淀粉酶系列实验
xxx
（云南大学 生命科学学院 生物学基地班 20101070xxx ）
摘要：α-淀粉酶作用于淀粉时可从分子内部切开α-1,4糖苷键，而生成小分子糊
精和还原糖，产物末端葡萄糖残基C1碳原子为α-构型，故称为α-淀粉酶。α-淀粉酶是一种重要的酶制剂，大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业。α-淀粉酶系列实验包括α-淀粉酶酶活力（碘比色法和DNS 法）的测定、α-淀粉酶产生菌株（细菌）的分离纯化及检测、菌株摇瓶发酵初筛、复筛及酶活力测定、产α-淀粉酶菌株产酶培养基组成优化正交试验、α-淀粉酶酶蛋白的提取和纯化和酶（纯化后）生物学特性的测定七个方面的内容。通过本系列实验，我们不仅掌握了关于酶的基本实验操作技术，而且对酶特别是α-淀粉酶的特性也有了更深刻的理解。
关键词：α-淀粉酶，发酵培养，分离提纯，酶活力测定
1、材料和方法
1.1、α-淀粉酶酶活力测定（碘比色法）
酶促催化反应分解淀粉等底物（反应物）产物为麦芽糖、糊精等。反应式：淀粉→红色糊精。淀粉及糊精检测原理：碘检测，即淀粉（紫蓝色，30分子以上）→红色糊精（红棕色，7-30分子）→无色糊精，7分子以下）→麦芽糖（不显色）→葡萄糖（不显色）。具体方法如下：
预热1mL 标准糊精液＋
2%淀粉液缓冲液
60℃）
对照比色
60℃），反应开始 1滴）比色
代入公式计算酶活力单位
酶活力单位=
6048N
⨯20⨯2%⨯N ÷0. 5=(μ/mL ) t t
1.2、α-淀粉酶产生菌株（细菌）的分离纯化及检测
分离培养基：利用相关含淀粉平板培养基进行分离（其它成分根据实际需要添加）；
分离方法：采用十倍梯度稀释涂布平板，经培养后挑取单菌落；
检测方法：利用淀粉遇碘变蓝的性质，平板加入卢哥氏碘液后，显示淀粉酶扩散水解淀粉而产生的透明圈情况——透明圈直径与菌落直径之比判断；
实验流程：
1.3、α-淀粉酶菌株摇瓶发酵初筛、复筛及酶活力测定
摇瓶培养发酵技术是在抗生素生产的需求条件下发展而来的，浅层培养发酵→深层培养发酵（实验室、工业生产）. 根据用途配制含有适合营养基质的液体培养基. 细胞悬浮于相应液体培养基质中，通过振荡，细胞得到充分溶解氧，接触较为新鲜的营养物质，细胞代谢活性较高。
流程如下：
灭菌
准备发酵培养基 灭菌
冷却后接种环接种
恒温摇瓶培
养
酵液棉花过测定酶活力确定1-2株复发
酵菌株
（1瓶/株）
一级液体活化菌
种
液体菌种接种于发酵培养基（3-5瓶/株） 灭菌
准备发酵培养基
恒温摇瓶培
养
酵液棉花过定酶活力
1.4、产α-淀粉酶菌株产酶培养基组成优化正交试验
利用正交试验所选试验的“均匀分散，齐整可比”特点，通过其中对部分试验结果的分析，从而达到了解全面试验的情况，最终完成用部分试验来代替全面试验的目的和结果。
基本流程如下：
测定发酵液酶活力高的发离心（12000转/分
收集上清液
酶活力 酵液合并 钟，10分钟
加入2倍体积的
-20℃冷
用时提前水量取250m L 放入 0℃预冷无水乙保存 浴溶化 1
醇（500m L ）
再加入100m L 冷冻离心（4000转
去上清乙醇混合液-20℃预冷无水 混匀后 /分钟，10分钟）（统一收集） 乙醇脱水处理
冷冻离心（4000转/
沉淀室温真空干上清乙醇液（统一 轻摇后 分钟，10分钟）
燥（备用） 收集）
1.5、α-淀粉酶酶活力测定（DNS 法）
淀粉酶催化产生的还原糖（麦芽糖等）能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下：
淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位样品（重量或体积）在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。
流程如下：
酶活力测定步骤
酶活力定义：在一定反应条件下（本实验为40 ℃ ，pH5.6或6.0），1分钟反应生成1mg 麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位。
1.6、α-淀粉酶酶蛋白的提取和纯化
酶的粗提取方法：降低酶蛋白在溶液中的溶解度，使酶蛋白从溶液中沉淀出来，从而达到分离的目的。
测定发酵液酶活力
酶活力高的发酵液合并
离心（12000转/分钟，10分钟
收集上清液 加入2倍体积的
-20℃冷
保存
用时提前水浴溶化 冷冻离心（4000转
混匀后
/分钟，10分钟）量取250m L 放入1 再加入100m L
去上清乙醇混合液（统一收集）
-20℃预冷无水乙醇脱水处理 0℃预冷无水乙醇（500m L ）
冷冻离心（4000转/
轻摇后
分钟，10分钟）
上清乙醇液（统一
收集）
沉淀室温真空干燥（备用）
离子交换层析：
装柱平衡调整 准备梯度洗脱液
0. 5m o l /L N a O H 再生 分别加入梯度洗脱仪中（左
蒸馏水水洗 测定恒流泵的流速并调整至
冲液平衡
柱子
1. 2m L /m L 流速上样12m i n
1. 2m L /m i n
高右低）
更换缓冲液进停泵 连接梯度洗脱器 液10m i n
（注意排管道内空气）
调节泵速至0. 6m L /m i n ，开泵
提前打开所有仪器设备电源，并进行预调节，熟悉仪器 等待10分钟，分部收集器正常转动1管后，离开
启动电脑色谱软件，熟悉软件
12小时以后观察结果，并进行后继
检测
调节紫外检测器，打开1个新的洗
脱色谱图
计时3. 5分钟后，打开部分收
集器
设置分部集器（10
管/10m i n ）
1.7、α-淀粉酶（纯化后）生物学特性测定
1.7.1、最适温度的测定 准备稀释好的酶液（根据DNS 法测定酶活力，40℃、pH6.0反应显色后，OD540=0.4~0.5），确定好稀释倍数后，酶液少稀释10倍（比确定浓度高10倍）——酶用量为0.1mL ，利用反应管中加入的0.9mL 蒸馏水再稀释10倍，从而恢复至反应时的酶浓度。
按下表加入反应底物及进行酶促反应过程（取7支25mL 比色管，其中1支为对照管）：
1.7.2、最适pH 的测定 准备稀释好的酶液（DNS 法测定酶活力，40℃、pH6.0反应显色后，OD540=0.4~0.5）先配制pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 2倍浓度磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液；用蒸馏水配制2%马铃薯淀粉溶液（121.3℃，20min 处理充分溶解）；
按下表配制不同pH 值反应底物及进行酶促反应过程（取7支25mL 比色管，其中1支为对
照管）：
1.7.3、米氏常数的测定 米氏方程是酶学中极为重要的可以描述多种非变异构酶动力学现象，表示一个酶促反应的起始速度V 与底物浓度[S]关系的方程，表示如下：
利用不同底物浓度（[S]），在一定条件下，测定其酶促反应速度（V ）；将米氏方程由双曲线转变为直线方程，再通过相应作图法，求出Km 和Vmax 。
1.7.4、蛋白分子量的测定 单体丙烯酰胺（Acr ）和N ，N ’-亚甲基双丙烯酰胺（Bis ，交联剂）在一定条件下聚合成具有一定孔径聚丙烯酰胺凝胶（二者比例不同孔径也不同）；蛋白质等带电物质（电荷效应）在电泳电场作用下通过聚丙烯酰胺凝胶不同孔径（分子筛效应）从而得到分离。
2、结果及分析
2.1、碘比色法测定α-淀粉酶酶活力结果
反应终点时间为9分20秒，代入公式可得：
酶活力单位 = 48N / t = (48×10) / (28/3) = 51.43 (u / mL) 2.2、α-淀粉酶产生菌株（细菌）的分离纯化及检测结果
表二、点接平板培养后碘液反应结果 菌株编号
9a
9b
9c
9d
9e
9f
9g
9h 9i 9j 9k 9l
透明圈直
14.5
径（D ，mm ） 菌落直径（d ，mm ） D/d比值 排序
22.0 18.2 19.0 13.0 23.0 19.0 22.0 21.5 21.0 19.5 16.5
4.5 8.0 7.0 9.0 4.0 7.0 6.2 9.5 5.0 7.0 8.0 6.0
3.22 4
2.75 8
2.60 9
2.11 12
3.25 3
3.29 2
3.06 5
0.32 11
4.30 1
3.00 6
2.44 10
2.75 7
由表一、表二可知，样品中的菌落数为5. 7×10^7CFU/g。其中，产淀粉酶菌数为1.3×10^7，占总菌落数的22.8%。从选择平板中挑出的12株菌中，9i 、9f 、9e 和9a 号菌的D/d值较大，分别是4.30、3.29、3.25、3.22，故选择它们作为后面实验的样品。
2.3、α-淀粉酶菌株摇瓶发酵初筛、复筛及酶活力测定结果 由上表可知，9h 菌株所产酶的活力最大，故用9h 菌株完成复筛实验。
相比，活力有所下降。
2.4、产α-淀粉酶菌株产酶培养基组成优化正交试验结果
表二、正交实验结果记录及极差分析表
A2B1C2。下面的实验继续验证此结果。
表三、重复试验结果
根据上表可以计算得理论组合平均酶活力为62.83 U/mL，而实际组的数据皆不可用，
这与正交的结果差异很大，说明实验过程中出现了一些人为的错误。
表四、方差检验结果
主体间效应的检验
因变量: 实验数据 源 校正模型 截距 A B C 误差 总计 校正的总计
III 型平方和
42152.122a
df
均方 F Sig.
a. R 方 = .978（调整 R 方 = .913）
结果表明，因素主次关系为B > C > A ，这与极差检验结果相符合。
2.5、α-淀粉酶酶活力测定（DNS 法）结果 2.5.1标准曲线和回归方程
2.5.2、酶活力测定
样酶反应液在540nm 的OD 值y = 0.332，故带入回归方程y = 0.4996x - 0.0149，就可求的麦芽糖生成量x = 0.7mg。因此，
α-淀粉酶酶活力（U/ml）= 麦芽糖含量(mg) ×稀释倍数/10
= 0.7×10000/10 =7×10^2
2.5.3、蛋白质含量测定
以100倍稀释酶液进行实验，测得280nm 处OD 值为0.599，260nm 处OD 值为0.661，所以，
蛋白质含量（mg/ml）= （1.45×A 280 – 0.74×A 260）× 100
= （1.45×0.599 – 0.74×0.661）×100 = 37.941mg
2.5.4、比酶活力的计算
比酶活力 = 酶活力单位 （U ）/ 蛋白质含量（mg ） = 7×10^2 U / 37.941 mg = 18.45U/mg
U ，比酶活力为355.9 U/mg。
2.7、α-淀粉酶（纯化后）生物学特性测定结果
酶活力变化趋势图：
由上图可知，此次所测酶样品的最适反应温度为60摄氏度。另外，温度为30摄氏度时的酶活力也相对较高，可能是由于操作的失误造成的。总的来说，酶的活力随着温度的升高而呈现出先升高后降低的趋势。当温度相对较低时，酶活力也相对较低；温度达到最适温度时，酶活力最高；温度超过最适温度后，酶由于高温变性而失活。
由上图可知，酶活力随着pH 的升高先升高后降低，当pH=6.0时，酶活力最高。所以，所测样品的最适pH 值为6.0。
结果说明，pH 较低时，酶活力也相对较低；pH 达到酶的最适pH 时，酶的活力也最高；但是，如果pH 超过最适pH 后，酶会因此变性而失活。
双倒数作图法作图：
由方程y = 6.0249x + 6.1664可知，直线与x 轴和y 轴的交点分别为（-1.0234 ，0）和（0 ，6.1664）。
所以，1/Km = 1.0234，1/Vmax = 6.1664，即求得Vmax = 0.1621mL· min，Km = 0.9771。
2.7.4、酶蛋白分子量的测定结果
电泳检测图片：
从上图看出，经电泳检测后，蛋白质呈单一条带，没有出现多条带，说明了实验中所用的酶蛋白相对来说比较纯。
标准曲线的制作：
低分子量蛋白质标准Marker TaKaRa Code：D530A
蛋白种类 磷酸酶b 牛血清蛋白 卵清蛋白 碳酸苷酶 胰蛋白酶抑制剂
溶菌酶
来 源 兔子肌肉 牛 鸡蛋白 牛 大豆 鸡蛋白
第二条
第三条
MW （Da ） 97,200 66,409 44,287 29,000 20,100 14,300
第四条 4.94
0.58 0.12 97200 4.99
0.88 0.18 66409 4.82
1.50 0.30 44287 4.65
2.09 0.42 29000 4.46
3.01 0.61 20100 4.30
3.62 0.73 14300 4.16
第五条
第六条
标准蛋白带 溴酚蓝迁移距离
距离 相对迁移率 分子量Mr Lg Mr
第一条
相对迁移率mR =样品迁移距离（cm ）/染料（溴酚蓝）迁移距离（cm ） 以标准蛋白质分子量的对数值（Lg ）对相对迁移率作图（计算出回归方程），得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上查出其分子量。
回归曲线为y=5.072-1.294x，待测样品相对迁移率为0.21，从标准曲线上查出其分子量为63096。
3、讨论
α-淀粉酶系列实验包括α-淀粉酶酶活力（碘比色法和DNS 法）的测定、α-淀粉酶产生菌株（细菌）的分离纯化及检测、菌株摇瓶发酵初筛、复筛及酶活力测定、产α-淀粉酶菌株产酶培养基组成优化正交试验、α-淀粉酶酶蛋白的提取和纯化和酶（纯化后）生物学特性的测定七个方面的内容，每个内容与前后的内容都是相互联系的，它们共同构成了一个完善的系统实验，这就对实验者提出了更高的要求。实验者必须严格按照实验流程，一步步进行实验，其中任何一个内容的实验出错都有可能影响到后面实验的进行。
通过本次实验，我们初步掌握了α-淀粉酶的相关实验操作方法和技术，对α-淀粉酶的相关特性也有了更加深入的了解，同时，实验还提高了我们利用软件分析实验结果的能力。
当然，实验中也出现了许多失误的地方，例如实验温度过高而使酶失活、加入了错误试剂以及剂量等等，使实验变得重复繁琐，这让我们认识到认真严谨的实验态度和熟练的实验操作是实验获得成功的重要条件。
致谢：感谢程老师的认真讲解和耐心指导以及全班同学的无私帮助！
参考文献：
[1]、云南大学生命科学学院微生物实验中心程立忠实验讲义
α-amylase series of experiments
Abstract: α-amylase on starch molecule within the incision from the α-1, 4 glycosidic bond, and the resulting low molecular dextrin and sugar, glucose residues C1 end products carbon atom α-configuration, so that the the α-amylase. α-amylase is an important enzyme preparation, widely used in food processing, food industry, brewing, fermentation, textile industry and the pharmaceutical industry. α-amylase series of experiments, including α-amylase enzyme activity (iodine colorimetry and DNS method) determination, α-amylase producing strain (bacteria) Purification and detection of strain fermentation screening, rescreening and enzyme activity assay, strains producing α-amylase enzyme production medium composition optimization orthogonal, α-amylase enzyme protein extraction and purification and enzyme (purified) Determination of Biological Characteristics seven aspects. Through this series of experiments, we have not only mastered the basic experimental operation on enzyme technology, but especially on the enzyme α-amylase characteristics have a more profound understanding.
Keywords: α-amylase, fermentation, separation and purification, enzyme activity assay
α-淀粉酶系列实验
xxx
（云南大学 生命科学学院 生物学基地班 20101070xxx ）
摘要：α-淀粉酶作用于淀粉时可从分子内部切开α-1,4糖苷键，而生成小分子糊
精和还原糖，产物末端葡萄糖残基C1碳原子为α-构型，故称为α-淀粉酶。α-淀粉酶是一种重要的酶制剂，大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业。α-淀粉酶系列实验包括α-淀粉酶酶活力（碘比色法和DNS 法）的测定、α-淀粉酶产生菌株（细菌）的分离纯化及检测、菌株摇瓶发酵初筛、复筛及酶活力测定、产α-淀粉酶菌株产酶培养基组成优化正交试验、α-淀粉酶酶蛋白的提取和纯化和酶（纯化后）生物学特性的测定七个方面的内容。通过本系列实验，我们不仅掌握了关于酶的基本实验操作技术，而且对酶特别是α-淀粉酶的特性也有了更深刻的理解。
关键词：α-淀粉酶，发酵培养，分离提纯，酶活力测定
1、材料和方法
1.1、α-淀粉酶酶活力测定（碘比色法）
酶促催化反应分解淀粉等底物（反应物）产物为麦芽糖、糊精等。反应式：淀粉→红色糊精。淀粉及糊精检测原理：碘检测，即淀粉（紫蓝色，30分子以上）→红色糊精（红棕色，7-30分子）→无色糊精，7分子以下）→麦芽糖（不显色）→葡萄糖（不显色）。具体方法如下：
预热1mL 标准糊精液＋
2%淀粉液缓冲液
60℃）
对照比色
60℃），反应开始 1滴）比色
代入公式计算酶活力单位
酶活力单位=
6048N
⨯20⨯2%⨯N ÷0. 5=(μ/mL ) t t
1.2、α-淀粉酶产生菌株（细菌）的分离纯化及检测
分离培养基：利用相关含淀粉平板培养基进行分离（其它成分根据实际需要添加）；
分离方法：采用十倍梯度稀释涂布平板，经培养后挑取单菌落；
检测方法：利用淀粉遇碘变蓝的性质，平板加入卢哥氏碘液后，显示淀粉酶扩散水解淀粉而产生的透明圈情况——透明圈直径与菌落直径之比判断；
实验流程：
1.3、α-淀粉酶菌株摇瓶发酵初筛、复筛及酶活力测定
摇瓶培养发酵技术是在抗生素生产的需求条件下发展而来的，浅层培养发酵→深层培养发酵（实验室、工业生产）. 根据用途配制含有适合营养基质的液体培养基. 细胞悬浮于相应液体培养基质中，通过振荡，细胞得到充分溶解氧，接触较为新鲜的营养物质，细胞代谢活性较高。
流程如下：
灭菌
准备发酵培养基 灭菌
冷却后接种环接种
恒温摇瓶培
养
酵液棉花过测定酶活力确定1-2株复发
酵菌株
（1瓶/株）
一级液体活化菌
种
液体菌种接种于发酵培养基（3-5瓶/株） 灭菌
准备发酵培养基
恒温摇瓶培
养
酵液棉花过定酶活力
1.4、产α-淀粉酶菌株产酶培养基组成优化正交试验
利用正交试验所选试验的“均匀分散，齐整可比”特点，通过其中对部分试验结果的分析，从而达到了解全面试验的情况，最终完成用部分试验来代替全面试验的目的和结果。
基本流程如下：
测定发酵液酶活力高的发离心（12000转/分
收集上清液
酶活力 酵液合并 钟，10分钟
加入2倍体积的
-20℃冷
用时提前水量取250m L 放入 0℃预冷无水乙保存 浴溶化 1
醇（500m L ）
再加入100m L 冷冻离心（4000转
去上清乙醇混合液-20℃预冷无水 混匀后 /分钟，10分钟）（统一收集） 乙醇脱水处理
冷冻离心（4000转/
沉淀室温真空干上清乙醇液（统一 轻摇后 分钟，10分钟）
燥（备用） 收集）
1.5、α-淀粉酶酶活力测定（DNS 法）
淀粉酶催化产生的还原糖（麦芽糖等）能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下：
淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位样品（重量或体积）在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。
流程如下：
酶活力测定步骤
酶活力定义：在一定反应条件下（本实验为40 ℃ ，pH5.6或6.0），1分钟反应生成1mg 麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位。
1.6、α-淀粉酶酶蛋白的提取和纯化
酶的粗提取方法：降低酶蛋白在溶液中的溶解度，使酶蛋白从溶液中沉淀出来，从而达到分离的目的。
测定发酵液酶活力
酶活力高的发酵液合并
离心（12000转/分钟，10分钟
收集上清液 加入2倍体积的
-20℃冷
保存
用时提前水浴溶化 冷冻离心（4000转
混匀后
/分钟，10分钟）量取250m L 放入1 再加入100m L
去上清乙醇混合液（统一收集）
-20℃预冷无水乙醇脱水处理 0℃预冷无水乙醇（500m L ）
冷冻离心（4000转/
轻摇后
分钟，10分钟）
上清乙醇液（统一
收集）
沉淀室温真空干燥（备用）
离子交换层析：
装柱平衡调整 准备梯度洗脱液
0. 5m o l /L N a O H 再生 分别加入梯度洗脱仪中（左
蒸馏水水洗 测定恒流泵的流速并调整至
冲液平衡
柱子
1. 2m L /m L 流速上样12m i n
1. 2m L /m i n
高右低）
更换缓冲液进停泵 连接梯度洗脱器 液10m i n
（注意排管道内空气）
调节泵速至0. 6m L /m i n ，开泵
提前打开所有仪器设备电源，并进行预调节，熟悉仪器 等待10分钟，分部收集器正常转动1管后，离开
启动电脑色谱软件，熟悉软件
12小时以后观察结果，并进行后继
检测
调节紫外检测器，打开1个新的洗
脱色谱图
计时3. 5分钟后，打开部分收
集器
设置分部集器（10
管/10m i n ）
1.7、α-淀粉酶（纯化后）生物学特性测定
1.7.1、最适温度的测定 准备稀释好的酶液（根据DNS 法测定酶活力，40℃、pH6.0反应显色后，OD540=0.4~0.5），确定好稀释倍数后，酶液少稀释10倍（比确定浓度高10倍）——酶用量为0.1mL ，利用反应管中加入的0.9mL 蒸馏水再稀释10倍，从而恢复至反应时的酶浓度。
按下表加入反应底物及进行酶促反应过程（取7支25mL 比色管，其中1支为对照管）：
1.7.2、最适pH 的测定 准备稀释好的酶液（DNS 法测定酶活力，40℃、pH6.0反应显色后，OD540=0.4~0.5）先配制pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 2倍浓度磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液；用蒸馏水配制2%马铃薯淀粉溶液（121.3℃，20min 处理充分溶解）；
按下表配制不同pH 值反应底物及进行酶促反应过程（取7支25mL 比色管，其中1支为对
照管）：
1.7.3、米氏常数的测定 米氏方程是酶学中极为重要的可以描述多种非变异构酶动力学现象，表示一个酶促反应的起始速度V 与底物浓度[S]关系的方程，表示如下：
利用不同底物浓度（[S]），在一定条件下，测定其酶促反应速度（V ）；将米氏方程由双曲线转变为直线方程，再通过相应作图法，求出Km 和Vmax 。
1.7.4、蛋白分子量的测定 单体丙烯酰胺（Acr ）和N ，N ’-亚甲基双丙烯酰胺（Bis ，交联剂）在一定条件下聚合成具有一定孔径聚丙烯酰胺凝胶（二者比例不同孔径也不同）；蛋白质等带电物质（电荷效应）在电泳电场作用下通过聚丙烯酰胺凝胶不同孔径（分子筛效应）从而得到分离。
2、结果及分析
2.1、碘比色法测定α-淀粉酶酶活力结果
反应终点时间为9分20秒，代入公式可得：
酶活力单位 = 48N / t = (48×10) / (28/3) = 51.43 (u / mL) 2.2、α-淀粉酶产生菌株（细菌）的分离纯化及检测结果
表二、点接平板培养后碘液反应结果 菌株编号
9a
9b
9c
9d
9e
9f
9g
9h 9i 9j 9k 9l
透明圈直
14.5
径（D ，mm ） 菌落直径（d ，mm ） D/d比值 排序
22.0 18.2 19.0 13.0 23.0 19.0 22.0 21.5 21.0 19.5 16.5
4.5 8.0 7.0 9.0 4.0 7.0 6.2 9.5 5.0 7.0 8.0 6.0
3.22 4
2.75 8
2.60 9
2.11 12
3.25 3
3.29 2
3.06 5
0.32 11
4.30 1
3.00 6
2.44 10
2.75 7
由表一、表二可知，样品中的菌落数为5. 7×10^7CFU/g。其中，产淀粉酶菌数为1.3×10^7，占总菌落数的22.8%。从选择平板中挑出的12株菌中，9i 、9f 、9e 和9a 号菌的D/d值较大，分别是4.30、3.29、3.25、3.22，故选择它们作为后面实验的样品。
2.3、α-淀粉酶菌株摇瓶发酵初筛、复筛及酶活力测定结果 由上表可知，9h 菌株所产酶的活力最大，故用9h 菌株完成复筛实验。
相比，活力有所下降。
2.4、产α-淀粉酶菌株产酶培养基组成优化正交试验结果
表二、正交实验结果记录及极差分析表
A2B1C2。下面的实验继续验证此结果。
表三、重复试验结果
根据上表可以计算得理论组合平均酶活力为62.83 U/mL，而实际组的数据皆不可用，
这与正交的结果差异很大，说明实验过程中出现了一些人为的错误。
表四、方差检验结果
主体间效应的检验
因变量: 实验数据 源 校正模型 截距 A B C 误差 总计 校正的总计
III 型平方和
42152.122a
df
均方 F Sig.
a. R 方 = .978（调整 R 方 = .913）
结果表明，因素主次关系为B > C > A ，这与极差检验结果相符合。
2.5、α-淀粉酶酶活力测定（DNS 法）结果 2.5.1标准曲线和回归方程
2.5.2、酶活力测定
样酶反应液在540nm 的OD 值y = 0.332，故带入回归方程y = 0.4996x - 0.0149，就可求的麦芽糖生成量x = 0.7mg。因此，
α-淀粉酶酶活力（U/ml）= 麦芽糖含量(mg) ×稀释倍数/10
= 0.7×10000/10 =7×10^2
2.5.3、蛋白质含量测定
以100倍稀释酶液进行实验，测得280nm 处OD 值为0.599，260nm 处OD 值为0.661，所以，
蛋白质含量（mg/ml）= （1.45×A 280 – 0.74×A 260）× 100
= （1.45×0.599 – 0.74×0.661）×100 = 37.941mg
2.5.4、比酶活力的计算
比酶活力 = 酶活力单位 （U ）/ 蛋白质含量（mg ） = 7×10^2 U / 37.941 mg = 18.45U/mg
U ，比酶活力为355.9 U/mg。
2.7、α-淀粉酶（纯化后）生物学特性测定结果
酶活力变化趋势图：
由上图可知，此次所测酶样品的最适反应温度为60摄氏度。另外，温度为30摄氏度时的酶活力也相对较高，可能是由于操作的失误造成的。总的来说，酶的活力随着温度的升高而呈现出先升高后降低的趋势。当温度相对较低时，酶活力也相对较低；温度达到最适温度时，酶活力最高；温度超过最适温度后，酶由于高温变性而失活。
由上图可知，酶活力随着pH 的升高先升高后降低，当pH=6.0时，酶活力最高。所以，所测样品的最适pH 值为6.0。
结果说明，pH 较低时，酶活力也相对较低；pH 达到酶的最适pH 时，酶的活力也最高；但是，如果pH 超过最适pH 后，酶会因此变性而失活。
双倒数作图法作图：
由方程y = 6.0249x + 6.1664可知，直线与x 轴和y 轴的交点分别为（-1.0234 ，0）和（0 ，6.1664）。
所以，1/Km = 1.0234，1/Vmax = 6.1664，即求得Vmax = 0.1621mL· min，Km = 0.9771。
2.7.4、酶蛋白分子量的测定结果
电泳检测图片：
从上图看出，经电泳检测后，蛋白质呈单一条带，没有出现多条带，说明了实验中所用的酶蛋白相对来说比较纯。
标准曲线的制作：
低分子量蛋白质标准Marker TaKaRa Code：D530A
蛋白种类 磷酸酶b 牛血清蛋白 卵清蛋白 碳酸苷酶 胰蛋白酶抑制剂
溶菌酶
来 源 兔子肌肉 牛 鸡蛋白 牛 大豆 鸡蛋白
第二条
第三条
MW （Da ） 97,200 66,409 44,287 29,000 20,100 14,300
第四条 4.94
0.58 0.12 97200 4.99
0.88 0.18 66409 4.82
1.50 0.30 44287 4.65
2.09 0.42 29000 4.46
3.01 0.61 20100 4.30
3.62 0.73 14300 4.16
第五条
第六条
标准蛋白带 溴酚蓝迁移距离
距离 相对迁移率 分子量Mr Lg Mr
第一条
相对迁移率mR =样品迁移距离（cm ）/染料（溴酚蓝）迁移距离（cm ） 以标准蛋白质分子量的对数值（Lg ）对相对迁移率作图（计算出回归方程），得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上查出其分子量。
回归曲线为y=5.072-1.294x，待测样品相对迁移率为0.21，从标准曲线上查出其分子量为63096。
3、讨论
α-淀粉酶系列实验包括α-淀粉酶酶活力（碘比色法和DNS 法）的测定、α-淀粉酶产生菌株（细菌）的分离纯化及检测、菌株摇瓶发酵初筛、复筛及酶活力测定、产α-淀粉酶菌株产酶培养基组成优化正交试验、α-淀粉酶酶蛋白的提取和纯化和酶（纯化后）生物学特性的测定七个方面的内容，每个内容与前后的内容都是相互联系的，它们共同构成了一个完善的系统实验，这就对实验者提出了更高的要求。实验者必须严格按照实验流程，一步步进行实验，其中任何一个内容的实验出错都有可能影响到后面实验的进行。
通过本次实验，我们初步掌握了α-淀粉酶的相关实验操作方法和技术，对α-淀粉酶的相关特性也有了更加深入的了解，同时，实验还提高了我们利用软件分析实验结果的能力。
当然，实验中也出现了许多失误的地方，例如实验温度过高而使酶失活、加入了错误试剂以及剂量等等，使实验变得重复繁琐，这让我们认识到认真严谨的实验态度和熟练的实验操作是实验获得成功的重要条件。
致谢：感谢程老师的认真讲解和耐心指导以及全班同学的无私帮助！
参考文献：
[1]、云南大学生命科学学院微生物实验中心程立忠实验讲义
α-amylase series of experiments
Abstract: α-amylase on starch molecule within the incision from the α-1, 4 glycosidic bond, and the resulting low molecular dextrin and sugar, glucose residues C1 end products carbon atom α-configuration, so that the the α-amylase. α-amylase is an important enzyme preparation, widely used in food processing, food industry, brewing, fermentation, textile industry and the pharmaceutical industry. α-amylase series of experiments, including α-amylase enzyme activity (iodine colorimetry and DNS method) determination, α-amylase producing strain (bacteria) Purification and detection of strain fermentation screening, rescreening and enzyme activity assay, strains producing α-amylase enzyme production medium composition optimization orthogonal, α-amylase enzyme protein extraction and purification and enzyme (purified) Determination of Biological Characteristics seven aspects. Through this series of experiments, we have not only mastered the basic experimental operation on enzyme technology, but especially on the enzyme α-amylase characteristics have a more profound understanding.
Keywords: α-amylase, fermentation, separation and purification, enzyme activity assay