造血干细胞的研究进展
常灏
(中央民族大学 生命与环境科学学院 生物科学 北京 100081)∗
摘要 干细胞研究是一门新兴的学科。经过50多年的努力，造血干细胞的研究已经成为当今生物医学领域中发展最快的领域。文章从造血干细胞的生物学特征入手，介绍了造血干细胞的来源、分离纯化和检测方法、以及“可塑性”等方面的研究情况，并详细说明了一些主要的造血干细胞表面标志。最后，着重阐述了造血干细胞在干细胞移植、细胞治疗和基因治疗等方面的临床应用和前景。
关键词 干细胞 造血干细胞 表面标志 造血干细胞移植 基因治疗
引言 造血干细胞是发现最早、研究最深入、应用最广泛的一种成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能。从造血干细胞的生物学特征、来源、分离纯化和检测方法、“可塑性”研究，以及造血干细胞的临床应用等方面，概述了造血干细胞的研究进展，并对造血干细胞的表面标志和造血干细胞移植做了较为详细的阐述。从而使读者对造血干细胞的研究情况有一个整体的了解。
1 造血干细胞的生物学特征
目前，大多数生物学家和医学家认为，干细胞是来自于胚胎、胎儿或成体内具有在一定条件下无限制自我更新与增殖分化能力的一类细胞，能够产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，也能产生组成机体组织、器官的已特化的细胞，同时还能分化为祖细胞。[1]
造血干细胞（Hematopoietic Stem Cell, HSC) 是一小群具有高度的自我复制和多向分化潜能的最原始的造血细胞。[1]这就是说，造血干细胞具有两个重要的特征：其一，高度的自我更新或自我复制能力；其二，可分化生成所有类型的血细胞。[2] 在发生学上，造血干细胞属于成体干细胞的一种。又因其可分化出至少12种血细胞，所以造血干细胞是一种多能的干细胞。
正常情况下，造血干细胞经过不对称性有丝分裂形成两个子代细胞。其中一个仍维持造血干细胞的全部特征，即自我更新(self-renewal )。自我更新使得干细胞池的大小(干细胞数量)和质量维持不变，因而又称为自我维持(self-maintenance )。另一个子细胞可能由于基因表达模式发生改变而使得细胞特征出现变化，从而逐步走上分化的道路。现已知道，造血干细胞不是纯一的细胞群体，而是由不同年龄等级的干细胞组成。这些不同年龄等级的干细胞的表面抗原、免疫表型和粘附分子的表达不一，生物学特性也有一定的差异。[3]
2 造血干细胞的来源
胚胎造血与出生后的较单一、固定的骨髓造血不同，它伴随着生长发育而不断变换造血部位。一般认为，随着胚胎发育过程中造血中心的转移，其造血过程相继分为三个阶段，即胚胎外造血期——卵黄囊造血期（人胚第13~16天）、胎肝造血期（人胚第6周至第5个月）和骨髓造血期（胚胎第四4个月开始至终生）。但有学者认为成体造血干细胞来源于胚胎的背主动脉区，因为能够重建成体各系造血的造血干细胞最早出现在鼠胚第10天的主动脉-性腺-中肾（AGM ）区。而卵黄囊只是一种一过性的造血组织，不是胚胎发育过程中的第一个造血中心。至于骨髓造血干细胞，有人认为其来源于胎肝造血干细胞的迁移，也有人认为其来源于上述的AGM 区，目前尚无定论。[2]
3 研究造血干细胞的技术
3.1 造血干细胞的表面标志
造血干细胞在细胞大小上类似于小淋巴细胞，细胞密度一般小于1. 066g/ml。[4]因此，至今仍不能单纯从形态学上来识别造血干细胞。而要对造血干细胞进行研究，首先必须能把它从造血组织中分离出来。最常用的方法就是利用造血干细胞表面的标志蛋白对其进行分离。
3.1.1 表面标志
－－人的造血干细胞表面标志包括CD34+、CD38、Li n 、Thy-1+、Sca-1+、HLA-DR +、LFA-1+、CD45RA ∗指导教师：王斌
Tutor: Wang Bin
、CD71等。[5]人类造血干细胞还对5-氟脲嘧啶和4-氢过氧环磷酰胺有抗性。[6] CD34分子是一种跨膜的唾液黏蛋白，相对分子质量为115 KD，其编码基因位于第1号染色体长臂，基因长约26—28 kb，含8个外显子，[7]表达在造血干细胞、一部分造血祖细胞、小血管内皮细胞及胚胎成纤维细胞表面，是目前应用最广泛的造血干细胞表面标志。干细胞因子受体(SCF-R，又称c-kit ，CD117) ，广泛分布于造血细胞群中，约60%～75%的人类CD34+造血细胞同时表达c-kit 受体。虽然CD34+细胞不全是造血干细胞，但是造血干细胞应全部表达CD34分子[1]，所以通过筛选CD34+细胞至少可以使造血干细胞得到富集。随着造血干细胞的
[8]分化成熟，CD34表达水平逐渐下降，成熟血细胞（Li n +）不表达CD34。 而最近的一些研究显示，CD34+Li n
———造血细胞又起源于CD34Li n 。CD34表面标志从无到有，又从有到无，充分显示了造血干/祖细胞产生、
—发育、分化和成熟的全过程。实际上，表型CD34+状态可能反映造血干细胞的激活状态。[9]CD34细胞的
发现正有力地支持了CD34+作为造血干/祖细胞的可靠标志需进一步的深入研究，也有助于在体外从胚胎干细胞诱导分化 CD34+细胞的干细胞工程研究的不断深入。 [10]
—依据细胞膜表面有无CD38抗原的表达，还可将CD34+细胞分为两个亚群：①CD34+CD38细胞属于早
期造血干细胞，与移植后的长期造血功能的重建有关。② CD34+CD38+细胞，为祖细胞亚群，与骨髓移植后的短期造血重建有关。
胸腺抗原-1（Thy-1，CD90）是造血干细胞的又一抗原标志。它比CD34分子出现得更早，表达在早期造血细胞表面。CD34+ Thy-1+细胞约占CD34+细胞群的0.1%—0. 5%，是具有高度自我更新能力和多项分化
[11]潜能的造血干细胞。因Thy-1+是造血干细胞表面的早期标志，故可利用其为标志进行造血干细胞的筛选。
干细胞抗原-1( Sca-1)，是小鼠Ly-6抗原家族的一员，除表达在干细胞表面外，在淋巴细胞特别是激活的淋巴及其他组织如脾脏红髓、胸腺髓质及肾小管区也有表达。[3]
血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor-2, VEGFR-2,又称KDR ），是新发现的一个造血干细胞的表面标志。在新生儿造血组织中，0.1%~0.5%的CD34+细胞表达KDR 。研究发现，
—多能造血干细胞限于CD34+KDR +细胞部分，而CD34+KDR 细胞亚群则主要包括一些系特异的定向祖细胞。
利用有限稀释法研究发现，骨髓中20%的CD34+KDR +细胞为造血干细胞，并且经过VEGF 刺激后，这一比例可增加到50%以上。因此，KDR 是一个可用于定义造血干细胞，并使其区别于造血祖细胞的阳性功能性标志。[12]
AC133分子也是新发现的造血干细胞表面标志之一，它被认为是更早期造血祖细胞和造血干细胞的特异性标记[2]。在2000年6月英国Harrogate 召开的第七届人类白细胞分化抗原大会上正式命名为CD133。它是一相对分子质量为120 KD的糖蛋白，其N 端连接20×103的聚糖，整个分子由一条长为865个氨基酸的
[13]多肽链组成。N 端位于细胞外，C 端位于细胞内。AC133选择性地表达于人胎肝、骨髓和外周血中的CD34+
造血干/祖细胞表面。与CD34抗原表达不同的是，AC133抗原不表达在人脐静脉血管内皮细胞、KGla 细胞(AML细胞系) 或纤维母细胞上，故有人认为AC133可替代CD34作为选择造血干/祖细胞的标志。[3]
总之，有关造血干细胞表面标志的研究仍在进展之中，或许有一天人们会找到真正的造血干细胞的表面标志。
3.1.2 造血干细胞的三维空间结构特征
对于造血干细胞表型的描述，已成为造血干细胞研究领域的当务之急，然而综观国际，对人类CD34+造血细胞的研究均仅局限于其分离富集和生物学功能方面，罕见对其形态、细胞化学、超微结构、三维立体结构特征的研究。我国学者奚永志在国际上首次从体视学上揭示了人类CD34+造血细胞的三维空间结构特征，填补了这一空白。经扫描→模数转换→阴影校正→图像暂存→预处理→统计分析，结果表明，人正常
2骨髓CD34+造血细胞的直径3.490～6.741μm、周长11.776～26.240μm、面积9.565～35.686μm、形状因子
1.048～1.840、核质比0.58～0.72、平均光密度0.17675、积分光密度2717.217～9870.643。[10]
3.2 造血干细胞的分离纯化
近年来，造血干细胞表面标志研究的发展丰富了干细胞分离纯化的手段。根据造血干细胞的表面标志，可通过免疫细胞化学、流式细胞仪、分子杂交和PCR 等多种细胞生物学和分子生物学手段来检测造血干细胞。[1]正如上述所提及的，现大多仍然基于对CD34+细胞的富集来筛选造血干细胞。通常先利用密度梯度－－
离心等方法去除待分离物中的红细胞和成熟粒细胞等成分，获得单个核细胞，从而使CD34+细胞初步富集；然后利用CD34分子特异的抗体标记单个核细胞，通过荧光激活细胞分选(fluorescence activated cell sorting, FACS )、流式细胞仪分离、免疫吸附系统（包括淘洗技术、免疫吸附柱层析、免疫磁珠等）等方法将被标
—记的CD34+细胞与未被标记的CD34细胞分离开来，即获得纯化的CD34+细胞。[2][13]其中，FACS 系统造血
干细胞（CD34+）分选纯度达到95%，但是，成本较高，仪器也较贵，而免疫磁珠分离系统分离量大，分离纯度和细胞质量也能够满足临床要求，已经被临床工作者接受。[14]
另外，也可以利用造血干细胞大多处于静止期，对活体染料拒染的特性对其进行富集纯化。例如，采用RNA 结合染料Pyronin Y、线粒体结合染料Rhodamine 123或DNA 结合染料Hochest 33342均可用于造血干细胞的纯化。新近，还有人根据造血干细胞移植后迅速向骨髓归巢的特性，建立了一种体内分离造血干细胞的方法，这是利用造血干细胞的功能特性来对其进行分离的。[2]
3.3 造血干细胞的检测方法
确认小鼠造血干细胞的唯一标准仍然是多年来一直沿用的长期体内重建造血能力（Long-term repopulation , LTR）检测。即：将细胞移植给经致死剂量照射的受者，如果能够使受者恢复长期各系造血，并且移植第二受者仍可重建其造血系统，那么就证明植入的细胞中确实含有造血干细胞。[2]
但是，由于异体移植存在免疫排斥的问题，多年来对人骨髓细胞造血活力的检测一直依赖于体外实验。近年来，随着动物模型的不断发展，使研究人造血干细胞体内重建造血活力成为可能。在这些动物模型中，最为可靠的是绵羊子宫内胎羊移植系统。该系统是在胎羊免疫系统发育前于子宫内将人的造血细胞移植给胚胎羊，在小羊出生后，通过追踪其体内人不同血细胞系的分布和比例来判断移植的人造血干细胞是否具有长期重建多系造血的能力。该系统的主要缺点是可操作性差，但可进行长达数年的观察，而且可以进行二次移植研究。最近，研究者又对该系统进行了改进：给移植人造血细胞后形成的嵌合体羊施用人晚期作用细胞因子，如GM-CSF 、IL-3等。应用这些细胞因子后，嵌合体羊骨髓中人血细胞的比例由5%增加到15%。这可能是由于细胞因子刺激人特异的定向祖细胞增殖分化的缘故，因此通过这种方法有可能使定向祖细胞逐渐耗竭，而相反，真正的干细胞并不受这些细胞因子的影响。[2]
3.4 技术难题有待攻破
细胞的分辨、检测和分离纯化都有赖于专一性的形态和表型标志，这是造血干细胞生物学研究中最大
——的难题，也是目前造血干细胞基因治疗和干细胞工程中的一大难题。对CD34Li n 细胞的分离，目前只能
——采用负性分选的方法，即把样品中的CD34+细胞和Li n +细胞用流式细胞术分选出来，剩下的便是CD34Li n
—细胞。[10]而这样分离所得到的CD34细胞中仍含有相当数量的CD34+细胞。
由于造血干细胞有明显的多样性以及体外（至今为止）不能用生物学分析方法确定造血干细胞，因此制约了对造血干细胞进行直接的分子性质分析。为了推进造血干细胞的生物学研究需求，技术上要求能使造血干细胞在体外培养扩增，或使造血干细胞得以永生，同时保留其多分化潜能的特性。[9]
关于造血干细胞是如何自我更新并分化为各系血细胞的机制至今仍然不清楚，但是可以肯定地说，造血因子在影响造血干细胞存活、增殖、分化、成熟、以及程序性死亡中起了至关重要的作用。目前，美国、加拿大和其他国家的研究小组正在努力地寻找促进造血干细胞增殖的关键因子。[15]
4 造血干细胞的可塑性
一种成体干细胞可以生成另一个组织的特化细胞的能力，[15]即成体干细胞具有一定跨系、甚至跨胚层分化的特性，称其为干细胞的可塑性，[1] 又被称为成体干细胞的横向分化。横向分化的发现在干细胞研究中具有革命性意义。它打破了用于临床治疗的干细胞只能来源于胚胎或受精卵的限制，为干细胞治疗疾病提供了新途径。[16]
造血干细胞的可塑性是指除可以分化为各系血细胞外，还可以分化为多种非造血组织的细胞，如神经细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肝脏细胞、血管内皮细胞以及多种组织的上皮细胞等。目前对造血干细胞多向分化的机制仍不清楚，对这一机制的探讨以及对造血干细胞定向分化的调控将大大扩展其在临床上的应用。因为这不仅可以绕过用人的胚胎干细胞作为移植治疗的细胞来源，而且可以减轻异基因移植带来的免疫排斥问题。[2]
然而自2002年4月开始，在《Nature 》和《Science 》上连续刊登了一系列针对成体干细胞“可塑性”这一重大理论问题的最新质疑性研究。其结论是：所谓的成体干细胞“可塑性”缺乏科学依据，“横向分化”是成年组织中存余的胚胎干细胞所为，抑或与自发融合相关。胚胎干细胞在体外与神经或造血干细胞共同培养时能自发地发生神经或造血干细胞与胚胎干细胞之间的融合，诱导神经干细胞或造血干细胞进行“横向分化”为胚胎样干细胞，然后展现出胚胎细胞的表型与相应功能，由此使所谓的成体干细胞具有了“可塑性”潜能。[10]这提醒我们应本着科学、严谨、求实的态度去做科学研究。相信随着对干细胞“可塑性”研究的不断深入，会逐步澄清业已存在的模糊认识，使“可塑性”研究沿着正确的方向发展。 5 造血干细胞的临床应用
造血干细胞的应用主要包括造血干细胞移植和作为基因治疗的靶细胞等。
5.1 造血干细胞移植
造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation）技术已经逐渐成熟并且得到广泛的应用，已经成为治愈恶性血液病和实体瘤等疾病的可靠选择，成为干细胞研究和应用的成功范例。[1]
CD34+细胞群体中90%以上为造血祖细胞，干细胞只占极小的一部分，而大量基础和临床研究表明，经动员的外周血中CD34+细胞数量是骨髓中的两倍。因此目前用GM-CSF 、IL-3、IL-6等细胞因子动员的外周血干细胞移植已取代了最初采用的骨髓来源干细胞的移植。这不仅因为从外周血收集细胞比骨髓中收集更容易，痛苦小、无需麻醉，不需留院便能采集到更好的细胞，[12]而且外周血干细胞移植具有重建造血功能快、免疫功能恢复早、存活率更高、并发症轻等骨髓干细胞移植所不具备的几个显著优点。一般来讲，造血干细胞移植后骨髓功能的全面重建主要包括两个方面，即骨髓细胞数量和细胞功能的恢复及细胞之间相互作用功能的完善，后者主要指免疫功能。[16]外周血干细胞更容易归巢可能是外周血移植时造血和免疫重建比骨髓移植快的原因之一。[1]
继1988年第一例应用人类脐带血移植治疗贫血症成功后，脐带血因其免疫抗原性较弱的特点，被认为是极具潜力的自骨髓来源和外周血来源后，第三种造血干细胞移植的来源。值得一提的是，输入的造血干细胞的数量多少，是影响造血干细胞移植成功率的因素之一。临床应用表明输入的量越大，成功移植率越高。成人输用造血干细胞一般要求（1～4）×106/ kg体重，而每份脐血的含量仅在1×107左右，因此目前一般只用于儿童。[12]
有了造血干细胞移植的支持，临床医生就可以使用超大剂量的放疗、化疗，最大限度地清除患者体内的癌细胞，然后植入造血干细胞重建被破坏的造血和免疫系统。[2]随着临床和基础研究的发展，为其他器官的移植奠定基础，又是造血干细胞移植作为支持治疗的另一个方面。异基因造血干细胞移植后，可在受者体内诱导形成供者-受者嵌合体，使受者产生对供者特异的、终生的耐受。这样，在进行组织或器官移植，就可以降低免疫排斥发生的强度，从而提高移植物的存活率。
此外，通过对自体造血干细胞进行遗传修饰后，使其缺陷基因的功能得到补充，也可以用于再生障碍性贫血、β地中海贫血等骨髓造血功能衰竭和某些先天遗传性疾病或代谢系统疾病的移植治疗，而且绕过了免疫排斥的问题。通过基因修饰，还可以赋予干细胞及其子代细胞新的特性，如转入多药耐药基因MDR 可使其抵抗化疗带来的清髓效应；导入某种基因使其可抵抗HIV 的感染等。[1]
—随着造血干细胞及其细胞工程的飞速发展，造血干细胞已不再是传统意义上的CD34+ CD38细胞或更
早发育的细胞，胚胎干细胞或体内其他组织来源的干细胞，如肌肉干细胞、神经干细胞等也可能作为造血细胞工程的种子细胞。造血干细胞和非造血干细胞联合移植将有可能用于器官再生。[1]
5.2 造血干细胞与细胞治疗
细胞治疗，即给患者输注治疗细胞，通过这些细胞在体内发挥功能以达到治病的目的，如抗肿瘤等。目前，已建立了体外诱导扩增树突状细胞DC （体内抗原提呈功能最强的APC ）方法，可以从脐带血或自体的外周血干细胞诱导扩增出大量的DC ，进一步使其装载肿瘤特异性抗原后，诱导抗原特异性CTL 杀伤肿瘤细胞。DC 回输疗法已成功地试用于非何杰金淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌和多发性骨髓瘤等恶性肿瘤晚期患者的治疗。[2]
5.3 造血干细胞与基因治疗
自人类首例基因治疗临床实验实施以来，基因治疗的基础与临床应用研究在世界各地蓬勃发展起来。基因治疗是将外源基因转入靶细胞，通过在患者体内表达，纠正或治疗疾病的过程，在单基因遗传病、恶性肿瘤、严重免疫缺陷及感染性疾病的治疗中具有广阔的前景。造血干细胞由于取材容易、易于体外培养、易于植回患者体内并存活以及自我更新能力强等优点，是基因治疗理想的靶细胞之一。将外源基因转入从
[12]患者体内采集的造血干细胞，回输给患者后，通过在体内表达而治疗疾病。然而造血干细胞是静止的，
而且很少分裂，因此探寻能够携带治疗性基因并且具有良好转染效果的载体是需要研究者迫切解决的难题。现在的造血干细胞基因治疗中，最常使用的是逆转录病毒载体和腺相关病毒载体。
一旦这种干细胞基因治疗的技术获得突破性进展，必将对人类疾病的体细胞治疗产生极为深远的影响。到目前为止，造血干细胞已经用于腺苷脱氨酶（ADA ）缺乏症、戈谢病（Gaucher desease）、HIV 感染及癌症的基因治疗。[2]
5.4 造血干细胞的其他用途
Jackson 等利用小鼠心肌梗塞模型所作的实验表明，小鼠造血干细胞可以通过骨髓移植后移行至心脏，并在心脏的受损区分化成修复所需的心肌细胞和内皮细胞等各种组织。这为再生病损的心肌组织提供了一个新的治疗方案。[15]
6 干细胞疗法的前景
研究干细胞增殖和分化机制最终目的是应用于细胞治疗疾病。应用干细胞治疗疾病比传统方法具有很多优点：低毒性（或无毒性），一次有效；不需要完全了解疾病发病的确切机理；应用自身干细胞移植，还可以避免产生免疫排斥反应。[16]
虽然干细胞研究及其临床应用取得了一定的进展，但是用干细胞技术治疗疾病仍然存在许多的困难。
[14]主要体现在胚胎干细胞的来源有限；体细胞克隆的人类胚胎操作过程繁琐，成本太高，且伦理学上未得到人们的普遍认同；体外对干细胞进行诱导、增殖和定向分化，在体外制造和移植人体器官等，在技术上尚存在一定的困难，还有待进一步突破和解决。[17]无法在体外培养造血干细胞也会延缓和阻碍这一新疗法的发展进程。然而我们相信，随着科学家们的不懈努力，一定能够逐渐解决这其中的一些难题。因此研究人员应当以谨慎乐观的态度不断开创干细胞治疗的广阔前景。
参考文献
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Progress in research of Hematopoietic Stem Cell
ChangHao
(College of Life and Environmental Science, Central University for Nationalities, Beijing, 100081)
Abstract ： Stem cell research is a new subject. With more than 50 years of experience studying, research on HSC is developing greater than any other field in bio-medical areas today. Beginning with the biological characteristics of HSC, this review introduces the origin, isolation and purification, and the method of identification of HSC as well as the current research on “plasticity”. Some key surface markers of HSC have been elaborated in some paragraphs. After emphasized applies the theory of HSC to stem cell transplantation, cellular therapy and genetic therapy, this article summarized the clinical application prospective of HSC in the end.
Key words： Stem Cell; Hematopoietic Stem Cell; Surface marker; HSC transplantation; Genetic therapy
造血干细胞的研究进展
常灏
(中央民族大学 生命与环境科学学院 生物科学 北京 100081)∗
摘要 干细胞研究是一门新兴的学科。经过50多年的努力，造血干细胞的研究已经成为当今生物医学领域中发展最快的领域。文章从造血干细胞的生物学特征入手，介绍了造血干细胞的来源、分离纯化和检测方法、以及“可塑性”等方面的研究情况，并详细说明了一些主要的造血干细胞表面标志。最后，着重阐述了造血干细胞在干细胞移植、细胞治疗和基因治疗等方面的临床应用和前景。
关键词 干细胞 造血干细胞 表面标志 造血干细胞移植 基因治疗
引言 造血干细胞是发现最早、研究最深入、应用最广泛的一种成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能。从造血干细胞的生物学特征、来源、分离纯化和检测方法、“可塑性”研究，以及造血干细胞的临床应用等方面，概述了造血干细胞的研究进展，并对造血干细胞的表面标志和造血干细胞移植做了较为详细的阐述。从而使读者对造血干细胞的研究情况有一个整体的了解。
1 造血干细胞的生物学特征
目前，大多数生物学家和医学家认为，干细胞是来自于胚胎、胎儿或成体内具有在一定条件下无限制自我更新与增殖分化能力的一类细胞，能够产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，也能产生组成机体组织、器官的已特化的细胞，同时还能分化为祖细胞。[1]
造血干细胞（Hematopoietic Stem Cell, HSC) 是一小群具有高度的自我复制和多向分化潜能的最原始的造血细胞。[1]这就是说，造血干细胞具有两个重要的特征：其一，高度的自我更新或自我复制能力；其二，可分化生成所有类型的血细胞。[2] 在发生学上，造血干细胞属于成体干细胞的一种。又因其可分化出至少12种血细胞，所以造血干细胞是一种多能的干细胞。
正常情况下，造血干细胞经过不对称性有丝分裂形成两个子代细胞。其中一个仍维持造血干细胞的全部特征，即自我更新(self-renewal )。自我更新使得干细胞池的大小(干细胞数量)和质量维持不变，因而又称为自我维持(self-maintenance )。另一个子细胞可能由于基因表达模式发生改变而使得细胞特征出现变化，从而逐步走上分化的道路。现已知道，造血干细胞不是纯一的细胞群体，而是由不同年龄等级的干细胞组成。这些不同年龄等级的干细胞的表面抗原、免疫表型和粘附分子的表达不一，生物学特性也有一定的差异。[3]
2 造血干细胞的来源
胚胎造血与出生后的较单一、固定的骨髓造血不同，它伴随着生长发育而不断变换造血部位。一般认为，随着胚胎发育过程中造血中心的转移，其造血过程相继分为三个阶段，即胚胎外造血期——卵黄囊造血期（人胚第13~16天）、胎肝造血期（人胚第6周至第5个月）和骨髓造血期（胚胎第四4个月开始至终生）。但有学者认为成体造血干细胞来源于胚胎的背主动脉区，因为能够重建成体各系造血的造血干细胞最早出现在鼠胚第10天的主动脉-性腺-中肾（AGM ）区。而卵黄囊只是一种一过性的造血组织，不是胚胎发育过程中的第一个造血中心。至于骨髓造血干细胞，有人认为其来源于胎肝造血干细胞的迁移，也有人认为其来源于上述的AGM 区，目前尚无定论。[2]
3 研究造血干细胞的技术
3.1 造血干细胞的表面标志
造血干细胞在细胞大小上类似于小淋巴细胞，细胞密度一般小于1. 066g/ml。[4]因此，至今仍不能单纯从形态学上来识别造血干细胞。而要对造血干细胞进行研究，首先必须能把它从造血组织中分离出来。最常用的方法就是利用造血干细胞表面的标志蛋白对其进行分离。
3.1.1 表面标志
－－人的造血干细胞表面标志包括CD34+、CD38、Li n 、Thy-1+、Sca-1+、HLA-DR +、LFA-1+、CD45RA ∗指导教师：王斌
Tutor: Wang Bin
、CD71等。[5]人类造血干细胞还对5-氟脲嘧啶和4-氢过氧环磷酰胺有抗性。[6] CD34分子是一种跨膜的唾液黏蛋白，相对分子质量为115 KD，其编码基因位于第1号染色体长臂，基因长约26—28 kb，含8个外显子，[7]表达在造血干细胞、一部分造血祖细胞、小血管内皮细胞及胚胎成纤维细胞表面，是目前应用最广泛的造血干细胞表面标志。干细胞因子受体(SCF-R，又称c-kit ，CD117) ，广泛分布于造血细胞群中，约60%～75%的人类CD34+造血细胞同时表达c-kit 受体。虽然CD34+细胞不全是造血干细胞，但是造血干细胞应全部表达CD34分子[1]，所以通过筛选CD34+细胞至少可以使造血干细胞得到富集。随着造血干细胞的
[8]分化成熟，CD34表达水平逐渐下降，成熟血细胞（Li n +）不表达CD34。 而最近的一些研究显示，CD34+Li n
———造血细胞又起源于CD34Li n 。CD34表面标志从无到有，又从有到无，充分显示了造血干/祖细胞产生、
—发育、分化和成熟的全过程。实际上，表型CD34+状态可能反映造血干细胞的激活状态。[9]CD34细胞的
发现正有力地支持了CD34+作为造血干/祖细胞的可靠标志需进一步的深入研究，也有助于在体外从胚胎干细胞诱导分化 CD34+细胞的干细胞工程研究的不断深入。 [10]
—依据细胞膜表面有无CD38抗原的表达，还可将CD34+细胞分为两个亚群：①CD34+CD38细胞属于早
期造血干细胞，与移植后的长期造血功能的重建有关。② CD34+CD38+细胞，为祖细胞亚群，与骨髓移植后的短期造血重建有关。
胸腺抗原-1（Thy-1，CD90）是造血干细胞的又一抗原标志。它比CD34分子出现得更早，表达在早期造血细胞表面。CD34+ Thy-1+细胞约占CD34+细胞群的0.1%—0. 5%，是具有高度自我更新能力和多项分化
[11]潜能的造血干细胞。因Thy-1+是造血干细胞表面的早期标志，故可利用其为标志进行造血干细胞的筛选。
干细胞抗原-1( Sca-1)，是小鼠Ly-6抗原家族的一员，除表达在干细胞表面外，在淋巴细胞特别是激活的淋巴及其他组织如脾脏红髓、胸腺髓质及肾小管区也有表达。[3]
血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor-2, VEGFR-2,又称KDR ），是新发现的一个造血干细胞的表面标志。在新生儿造血组织中，0.1%~0.5%的CD34+细胞表达KDR 。研究发现，
—多能造血干细胞限于CD34+KDR +细胞部分，而CD34+KDR 细胞亚群则主要包括一些系特异的定向祖细胞。
利用有限稀释法研究发现，骨髓中20%的CD34+KDR +细胞为造血干细胞，并且经过VEGF 刺激后，这一比例可增加到50%以上。因此，KDR 是一个可用于定义造血干细胞，并使其区别于造血祖细胞的阳性功能性标志。[12]
AC133分子也是新发现的造血干细胞表面标志之一，它被认为是更早期造血祖细胞和造血干细胞的特异性标记[2]。在2000年6月英国Harrogate 召开的第七届人类白细胞分化抗原大会上正式命名为CD133。它是一相对分子质量为120 KD的糖蛋白，其N 端连接20×103的聚糖，整个分子由一条长为865个氨基酸的
[13]多肽链组成。N 端位于细胞外，C 端位于细胞内。AC133选择性地表达于人胎肝、骨髓和外周血中的CD34+
造血干/祖细胞表面。与CD34抗原表达不同的是，AC133抗原不表达在人脐静脉血管内皮细胞、KGla 细胞(AML细胞系) 或纤维母细胞上，故有人认为AC133可替代CD34作为选择造血干/祖细胞的标志。[3]
总之，有关造血干细胞表面标志的研究仍在进展之中，或许有一天人们会找到真正的造血干细胞的表面标志。
3.1.2 造血干细胞的三维空间结构特征
对于造血干细胞表型的描述，已成为造血干细胞研究领域的当务之急，然而综观国际，对人类CD34+造血细胞的研究均仅局限于其分离富集和生物学功能方面，罕见对其形态、细胞化学、超微结构、三维立体结构特征的研究。我国学者奚永志在国际上首次从体视学上揭示了人类CD34+造血细胞的三维空间结构特征，填补了这一空白。经扫描→模数转换→阴影校正→图像暂存→预处理→统计分析，结果表明，人正常
2骨髓CD34+造血细胞的直径3.490～6.741μm、周长11.776～26.240μm、面积9.565～35.686μm、形状因子
1.048～1.840、核质比0.58～0.72、平均光密度0.17675、积分光密度2717.217～9870.643。[10]
3.2 造血干细胞的分离纯化
近年来，造血干细胞表面标志研究的发展丰富了干细胞分离纯化的手段。根据造血干细胞的表面标志，可通过免疫细胞化学、流式细胞仪、分子杂交和PCR 等多种细胞生物学和分子生物学手段来检测造血干细胞。[1]正如上述所提及的，现大多仍然基于对CD34+细胞的富集来筛选造血干细胞。通常先利用密度梯度－－
离心等方法去除待分离物中的红细胞和成熟粒细胞等成分，获得单个核细胞，从而使CD34+细胞初步富集；然后利用CD34分子特异的抗体标记单个核细胞，通过荧光激活细胞分选(fluorescence activated cell sorting, FACS )、流式细胞仪分离、免疫吸附系统（包括淘洗技术、免疫吸附柱层析、免疫磁珠等）等方法将被标
—记的CD34+细胞与未被标记的CD34细胞分离开来，即获得纯化的CD34+细胞。[2][13]其中，FACS 系统造血
干细胞（CD34+）分选纯度达到95%，但是，成本较高，仪器也较贵，而免疫磁珠分离系统分离量大，分离纯度和细胞质量也能够满足临床要求，已经被临床工作者接受。[14]
另外，也可以利用造血干细胞大多处于静止期，对活体染料拒染的特性对其进行富集纯化。例如，采用RNA 结合染料Pyronin Y、线粒体结合染料Rhodamine 123或DNA 结合染料Hochest 33342均可用于造血干细胞的纯化。新近，还有人根据造血干细胞移植后迅速向骨髓归巢的特性，建立了一种体内分离造血干细胞的方法，这是利用造血干细胞的功能特性来对其进行分离的。[2]
3.3 造血干细胞的检测方法
确认小鼠造血干细胞的唯一标准仍然是多年来一直沿用的长期体内重建造血能力（Long-term repopulation , LTR）检测。即：将细胞移植给经致死剂量照射的受者，如果能够使受者恢复长期各系造血，并且移植第二受者仍可重建其造血系统，那么就证明植入的细胞中确实含有造血干细胞。[2]
但是，由于异体移植存在免疫排斥的问题，多年来对人骨髓细胞造血活力的检测一直依赖于体外实验。近年来，随着动物模型的不断发展，使研究人造血干细胞体内重建造血活力成为可能。在这些动物模型中，最为可靠的是绵羊子宫内胎羊移植系统。该系统是在胎羊免疫系统发育前于子宫内将人的造血细胞移植给胚胎羊，在小羊出生后，通过追踪其体内人不同血细胞系的分布和比例来判断移植的人造血干细胞是否具有长期重建多系造血的能力。该系统的主要缺点是可操作性差，但可进行长达数年的观察，而且可以进行二次移植研究。最近，研究者又对该系统进行了改进：给移植人造血细胞后形成的嵌合体羊施用人晚期作用细胞因子，如GM-CSF 、IL-3等。应用这些细胞因子后，嵌合体羊骨髓中人血细胞的比例由5%增加到15%。这可能是由于细胞因子刺激人特异的定向祖细胞增殖分化的缘故，因此通过这种方法有可能使定向祖细胞逐渐耗竭，而相反，真正的干细胞并不受这些细胞因子的影响。[2]
3.4 技术难题有待攻破
细胞的分辨、检测和分离纯化都有赖于专一性的形态和表型标志，这是造血干细胞生物学研究中最大
——的难题，也是目前造血干细胞基因治疗和干细胞工程中的一大难题。对CD34Li n 细胞的分离，目前只能
——采用负性分选的方法，即把样品中的CD34+细胞和Li n +细胞用流式细胞术分选出来，剩下的便是CD34Li n
—细胞。[10]而这样分离所得到的CD34细胞中仍含有相当数量的CD34+细胞。
由于造血干细胞有明显的多样性以及体外（至今为止）不能用生物学分析方法确定造血干细胞，因此制约了对造血干细胞进行直接的分子性质分析。为了推进造血干细胞的生物学研究需求，技术上要求能使造血干细胞在体外培养扩增，或使造血干细胞得以永生，同时保留其多分化潜能的特性。[9]
关于造血干细胞是如何自我更新并分化为各系血细胞的机制至今仍然不清楚，但是可以肯定地说，造血因子在影响造血干细胞存活、增殖、分化、成熟、以及程序性死亡中起了至关重要的作用。目前，美国、加拿大和其他国家的研究小组正在努力地寻找促进造血干细胞增殖的关键因子。[15]
4 造血干细胞的可塑性
一种成体干细胞可以生成另一个组织的特化细胞的能力，[15]即成体干细胞具有一定跨系、甚至跨胚层分化的特性，称其为干细胞的可塑性，[1] 又被称为成体干细胞的横向分化。横向分化的发现在干细胞研究中具有革命性意义。它打破了用于临床治疗的干细胞只能来源于胚胎或受精卵的限制，为干细胞治疗疾病提供了新途径。[16]
造血干细胞的可塑性是指除可以分化为各系血细胞外，还可以分化为多种非造血组织的细胞，如神经细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肝脏细胞、血管内皮细胞以及多种组织的上皮细胞等。目前对造血干细胞多向分化的机制仍不清楚，对这一机制的探讨以及对造血干细胞定向分化的调控将大大扩展其在临床上的应用。因为这不仅可以绕过用人的胚胎干细胞作为移植治疗的细胞来源，而且可以减轻异基因移植带来的免疫排斥问题。[2]
然而自2002年4月开始，在《Nature 》和《Science 》上连续刊登了一系列针对成体干细胞“可塑性”这一重大理论问题的最新质疑性研究。其结论是：所谓的成体干细胞“可塑性”缺乏科学依据，“横向分化”是成年组织中存余的胚胎干细胞所为，抑或与自发融合相关。胚胎干细胞在体外与神经或造血干细胞共同培养时能自发地发生神经或造血干细胞与胚胎干细胞之间的融合，诱导神经干细胞或造血干细胞进行“横向分化”为胚胎样干细胞，然后展现出胚胎细胞的表型与相应功能，由此使所谓的成体干细胞具有了“可塑性”潜能。[10]这提醒我们应本着科学、严谨、求实的态度去做科学研究。相信随着对干细胞“可塑性”研究的不断深入，会逐步澄清业已存在的模糊认识，使“可塑性”研究沿着正确的方向发展。 5 造血干细胞的临床应用
造血干细胞的应用主要包括造血干细胞移植和作为基因治疗的靶细胞等。
5.1 造血干细胞移植
造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation）技术已经逐渐成熟并且得到广泛的应用，已经成为治愈恶性血液病和实体瘤等疾病的可靠选择，成为干细胞研究和应用的成功范例。[1]
CD34+细胞群体中90%以上为造血祖细胞，干细胞只占极小的一部分，而大量基础和临床研究表明，经动员的外周血中CD34+细胞数量是骨髓中的两倍。因此目前用GM-CSF 、IL-3、IL-6等细胞因子动员的外周血干细胞移植已取代了最初采用的骨髓来源干细胞的移植。这不仅因为从外周血收集细胞比骨髓中收集更容易，痛苦小、无需麻醉，不需留院便能采集到更好的细胞，[12]而且外周血干细胞移植具有重建造血功能快、免疫功能恢复早、存活率更高、并发症轻等骨髓干细胞移植所不具备的几个显著优点。一般来讲，造血干细胞移植后骨髓功能的全面重建主要包括两个方面，即骨髓细胞数量和细胞功能的恢复及细胞之间相互作用功能的完善，后者主要指免疫功能。[16]外周血干细胞更容易归巢可能是外周血移植时造血和免疫重建比骨髓移植快的原因之一。[1]
继1988年第一例应用人类脐带血移植治疗贫血症成功后，脐带血因其免疫抗原性较弱的特点，被认为是极具潜力的自骨髓来源和外周血来源后，第三种造血干细胞移植的来源。值得一提的是，输入的造血干细胞的数量多少，是影响造血干细胞移植成功率的因素之一。临床应用表明输入的量越大，成功移植率越高。成人输用造血干细胞一般要求（1～4）×106/ kg体重，而每份脐血的含量仅在1×107左右，因此目前一般只用于儿童。[12]
有了造血干细胞移植的支持，临床医生就可以使用超大剂量的放疗、化疗，最大限度地清除患者体内的癌细胞，然后植入造血干细胞重建被破坏的造血和免疫系统。[2]随着临床和基础研究的发展，为其他器官的移植奠定基础，又是造血干细胞移植作为支持治疗的另一个方面。异基因造血干细胞移植后，可在受者体内诱导形成供者-受者嵌合体，使受者产生对供者特异的、终生的耐受。这样，在进行组织或器官移植，就可以降低免疫排斥发生的强度，从而提高移植物的存活率。
此外，通过对自体造血干细胞进行遗传修饰后，使其缺陷基因的功能得到补充，也可以用于再生障碍性贫血、β地中海贫血等骨髓造血功能衰竭和某些先天遗传性疾病或代谢系统疾病的移植治疗，而且绕过了免疫排斥的问题。通过基因修饰，还可以赋予干细胞及其子代细胞新的特性，如转入多药耐药基因MDR 可使其抵抗化疗带来的清髓效应；导入某种基因使其可抵抗HIV 的感染等。[1]
—随着造血干细胞及其细胞工程的飞速发展，造血干细胞已不再是传统意义上的CD34+ CD38细胞或更
早发育的细胞，胚胎干细胞或体内其他组织来源的干细胞，如肌肉干细胞、神经干细胞等也可能作为造血细胞工程的种子细胞。造血干细胞和非造血干细胞联合移植将有可能用于器官再生。[1]
5.2 造血干细胞与细胞治疗
细胞治疗，即给患者输注治疗细胞，通过这些细胞在体内发挥功能以达到治病的目的，如抗肿瘤等。目前，已建立了体外诱导扩增树突状细胞DC （体内抗原提呈功能最强的APC ）方法，可以从脐带血或自体的外周血干细胞诱导扩增出大量的DC ，进一步使其装载肿瘤特异性抗原后，诱导抗原特异性CTL 杀伤肿瘤细胞。DC 回输疗法已成功地试用于非何杰金淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌和多发性骨髓瘤等恶性肿瘤晚期患者的治疗。[2]
5.3 造血干细胞与基因治疗
自人类首例基因治疗临床实验实施以来，基因治疗的基础与临床应用研究在世界各地蓬勃发展起来。基因治疗是将外源基因转入靶细胞，通过在患者体内表达，纠正或治疗疾病的过程，在单基因遗传病、恶性肿瘤、严重免疫缺陷及感染性疾病的治疗中具有广阔的前景。造血干细胞由于取材容易、易于体外培养、易于植回患者体内并存活以及自我更新能力强等优点，是基因治疗理想的靶细胞之一。将外源基因转入从
[12]患者体内采集的造血干细胞，回输给患者后，通过在体内表达而治疗疾病。然而造血干细胞是静止的，
而且很少分裂，因此探寻能够携带治疗性基因并且具有良好转染效果的载体是需要研究者迫切解决的难题。现在的造血干细胞基因治疗中，最常使用的是逆转录病毒载体和腺相关病毒载体。
一旦这种干细胞基因治疗的技术获得突破性进展，必将对人类疾病的体细胞治疗产生极为深远的影响。到目前为止，造血干细胞已经用于腺苷脱氨酶（ADA ）缺乏症、戈谢病（Gaucher desease）、HIV 感染及癌症的基因治疗。[2]
5.4 造血干细胞的其他用途
Jackson 等利用小鼠心肌梗塞模型所作的实验表明，小鼠造血干细胞可以通过骨髓移植后移行至心脏，并在心脏的受损区分化成修复所需的心肌细胞和内皮细胞等各种组织。这为再生病损的心肌组织提供了一个新的治疗方案。[15]
6 干细胞疗法的前景
研究干细胞增殖和分化机制最终目的是应用于细胞治疗疾病。应用干细胞治疗疾病比传统方法具有很多优点：低毒性（或无毒性），一次有效；不需要完全了解疾病发病的确切机理；应用自身干细胞移植，还可以避免产生免疫排斥反应。[16]
虽然干细胞研究及其临床应用取得了一定的进展，但是用干细胞技术治疗疾病仍然存在许多的困难。
[14]主要体现在胚胎干细胞的来源有限；体细胞克隆的人类胚胎操作过程繁琐，成本太高，且伦理学上未得到人们的普遍认同；体外对干细胞进行诱导、增殖和定向分化，在体外制造和移植人体器官等，在技术上尚存在一定的困难，还有待进一步突破和解决。[17]无法在体外培养造血干细胞也会延缓和阻碍这一新疗法的发展进程。然而我们相信，随着科学家们的不懈努力，一定能够逐渐解决这其中的一些难题。因此研究人员应当以谨慎乐观的态度不断开创干细胞治疗的广阔前景。
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Progress in research of Hematopoietic Stem Cell
ChangHao
(College of Life and Environmental Science, Central University for Nationalities, Beijing, 100081)
Abstract ： Stem cell research is a new subject. With more than 50 years of experience studying, research on HSC is developing greater than any other field in bio-medical areas today. Beginning with the biological characteristics of HSC, this review introduces the origin, isolation and purification, and the method of identification of HSC as well as the current research on “plasticity”. Some key surface markers of HSC have been elaborated in some paragraphs. After emphasized applies the theory of HSC to stem cell transplantation, cellular therapy and genetic therapy, this article summarized the clinical application prospective of HSC in the end.
Key words： Stem Cell; Hematopoietic Stem Cell; Surface marker; HSC transplantation; Genetic therapy