§第六章 谷氨酸的发酵机制
GA发酵作为重点：（1）是代谢控制发酵的重点
（2）是目前代谢控制发酵中，在理论与实践上最成熟的„„
第一节 GA的生物合成途径
一、GA 的生物合成途径 的酵解，EMP
的有氧氧化，HMP
丙酮酸的有氧氧化，TCA循环
乙醛酸循环途径，DCA循环
CO2固定反应
α-酮戊二酸的还原氨基化
这6条途径之间是相互联系和相互制约的，如图所示：
主导反应: GHD
α-KGA+NH4++NADPH2 GA+H2O+NADP
C6H12O6
HMP
3-
乳酸 丙 酮 酸 乙酰辅酶A
CO2 CO2
草酰乙酸 柠 檬 酸
苹果酸
异柠檬酸
延胡索酸
CO2
琥珀酸
α—KGA
NADPH
NH4+ NADP
谷氨酸
第二节 GA生物合成的调节机制
一、优先合成与反馈调节
1、优先合成
1）优先合成（perference synthesis）
D→E
a酶活性远大于b酶活性
GA 比Asp优先合成，GA过量后，阻遏和抑制自身的合成途径，使代谢转向Asp
2、CO2固定反应的酶类受Asp的反馈抑制，GA 和Asp的反馈阻遏
3、α—KGA脱氢酶在GA生产菌中先天丧失或微弱
4、柠檬酸合成酶（TCA关键酶）：受能荷调节和GA的反馈阻遏和乌头酸的反馈抑制
5、GDH（谷氨酸脱氢酶）受GA的反馈抑制和阻遏
6、异柠檬酸脱氢酶：受α—KGA的反馈抑制。
异柠檬酸脱氢酶催化的异柠檬酸脱羧生成α—KGA和谷氨酸脱氢酶催化的α—KGA还原氨基话生成的GA的反应是一对氧化还原共轭反应，细胞内α—KGA和异柠檬酸的量需维持平衡，当α—KGA过量时对异柠檬酸脱氢酶发生抑制作用，停止合成α—KGA
由菌体的代谢可知，在正常情况下，GA并不积累。
二、GA生物合成的内在因素
从上图可以看出，菌体要在葡萄糖含量10%以上的培养基上，合成5%以上的谷氨酸，是一种不正常的现象，显然GA产生菌必须具备以下条件：
1.α—KGA脱氢酶酶活性微弱或丧失
这是菌体生成并积累α—KGA的关键，从上图可以看出，α—KGA是菌体
进行TCA循环的中间性产物，很快在α—KGA脱氢酶的作用下氧化脱羧生成琥珀酸辅酶A，在正常的微生物体内他的浓度很低，也就是说，由α—KGA进行还原氨基化生成GA的可能性很少。只有当体内α—KGA脱氢酶活性很低时，TCA循环才能够停止，α—KGA才得以积累。
例：不要求生物素的一株丧失α—KGA脱氢酶的大肠杆菌突变株，分泌23.3g/LGA
2.GA产生菌体内的NADPH的在氧化能力欠缺或丧失
（1）如上图所示，NADPH是α—KGA还原氨基化生成GA必须物质，而且该还
原氨基化所需要的NADPH是与柠檬酸氧化脱羧相偶联 的。
（2）由于NADPH的在氧化能力欠缺或丧失，使得体内的NADPH有一定的积累，
NADPH对于抑制α—KGA的脱羧氧化有一定的意义。
3.产生菌体内必须有乙醛酸循环（DCA）的关键酶——异柠檬酸裂解酶。
该酶是一种调节酶，或称为别构酶，其活性可以通过某种方式进行调节，通过该酶酶活性的调节来实现DCA循环的封闭，DCA 循环的封闭是实现GA 发酵的首要条件。关于该酶的酶活性的调节后述。
4、.菌体有强烈的L—谷氨酸脱氢酶活性
α—KGA + NH4+
L—谷氨酸脱氢酶，实质上产生菌体内该酶的酶活性都很强
该反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联，反应机制如下：
α—KGA NADPH α—KGA
GA NADP 异柠檬酸
三、GA 生物合成的最理想途径
上述涉及到的GA生物合成途径很多，那GA 生物合成由哪几条途径合成是最为理想的呢？
通过比较来说明这一问题：
1、EMP和HMP途径
生物素充足菌（生长期）：HMP，38% 生物素缺乏菌（产酸期）：HMP，26%
2、CO2固定
在前述GA 合成所必需的条件的基础上（„„，封闭乙醛酸循环）体系不存在CO2固定反应，则有：
3/2丙酮酸 + 丙酮酸 +
丙酮酸
CO2
乙酰辅酶A + 乙酰辅酶A + 乙酰辅酶A
DCA循环封闭）
谷氨酸
则有：
3/2 C6H12O6 + NH4+ == C5H9O4 + 4 CO2 （来自何方？提问）
产率：147 /（180*3/2） == 54.4%
2.在前述GA 合成所必需的条件的基础上（„„，封闭乙醛酸循环）存在CO2固定反应，则有：
+ 丙酮酸
CO2
CO2
草酰乙酸
（草酰乙酸
羧化酶）
乙酰辅酶A + C4二羧酸
苹果酸
（苹果酸激酶）
柠檬酸（DCA循环封闭）
则有： 谷氨酸
C6H12O6 + NH4+ == C5H9O4 + CO2 （来自何方？提问）
产率：147 / 180 == 81.7%
可见，在GA的生物合成过程中，CO2固定反应对于产率的提高有着多么重要的作用。
在许多微生物发酵的过程中，通常需要检测反应器尾气的组成，特别是尾气中CO2的含量，其主要目的就在于分析产物合成期间菌体的代谢途径，有利于指导生产。
在GA产生菌菌体内CO2固定反应有以下两条途径：
（1）磷酸丙酮酸羧化酶的作用下
磷酸丙酮酸 + CO2 + GTP == 草酰乙酸 + GDP
(2) 苹果酸合成酶的作用下
丙酮酸 + CO2 +NADH === 苹果酸 + NAD
需要+做催化剂，所以，在GA发酵过程中需要向培养基中补充Mn+
实际上，发酵过程中不可能控制柠檬酸合成所需的C4二羧酸完全来自于CO2固定反应，体系也不可能完全不存在CO2固定反应，因此，GA 发酵的糖酸转化率应在：54.4%——81.7%。目前，国内的GA生产企业的糖酸转化率通常都在50%以内：
（1）企业计算的糖酸转化率是把GA 发酵前期菌体增殖时期消耗的葡萄糖计算在内，而我们所计算的不包括这一部分葡萄糖，通常这一部分糖占总量的20%左右，当然与企业的技术水平有关。
（2）TCA 循环也不可能完全封闭；α—KGA也不可能完全转化为GA；生成的GA也不可能完全分泌的细胞外；发酵液中还存在一定的残糖，通常在0.5%——0.7%之间。
无论如何，提高GA的潜力仍然是很大的，具体表现在：
（1）强化CO2固定反应，具体措施：Mn+，生物素？
（2）控制溶氧浓度是非常重要的
低的溶氧浓度，则丙酮酸向乳酸方向转化„„
高的溶氧浓度，则NADPH 有被氧化的可能，„„
3、TCA循环和DCA循环
四、生物素对GA发酵的影响
GA 产生菌大都是生物素的营养缺陷型，即：VH-，在发酵过程中要严格控制其浓度，主要是生物素对发酵的影响是全面的，分述如下：
1.生物素对糖代谢的影响
一方面，VH对于糖酵解有促进作用，对丙酮酸的有氧氧化——乙酰辅酶A的生成也有促进作用，但两者的促进作用不一样，对前者大一些，这样培养基中如果有较丰富的VH，就会打破糖酵解与丙酮酸氧化之间的平衡，导致丙酮酸的积累，丙酮酸积累则可能导致乳酸的形成，乳酸声称，则使得碳源利用率降低，而且带来的是发酵液的pH值下降。
另一方面，可以通过控制VH的浓度，以实现对于乙醛酸循环的封闭。前述，封闭乙醛酸循环对于GA发酵的重要性，那么，如何封闭乙醛酸循环呢？
DCA循环的关键酶是异柠檬酸裂解酶，研究表明，该酶受以下几个因素的影响： 为醋酸诱导
受琥珀酸的阻遏，其活性受琥珀酸的抑制
（受到Glucose的阻遏？）
这样，当VH缺乏时：
（1）丙酮酸的有氧氧化就会减弱(由于VH对TCA循环的促进作用)，则：乙酰辅酶A
的生成量就会少，醋酸浓度降低，它的诱导作用降低；
（2）VH对TCA循环的促进作用的降低，使得其中间产物琥珀酸的氧化速度降低，
其浓度得到积累，这样它的阻遏和抑制作用加强；
两者综合的作用使得，异柠檬酸裂解酶的活性丧失，DCA循环得到封闭。
2.生物素对氮代谢的影响
由以上分析可知，当VH缺乏时，异柠檬酸裂解酶的活性减弱，那么相反，当VH丰富时，异柠檬酸裂解酶的活性必然加强，则DCA 循环正常进行，DCA循环的进行，一方面提供了大量的“中间性产物”，另一方面，菌体的能和水平得到提高。前者是菌体增殖的物质基础，后者则是菌体增殖的能量的保证。这样的结果是，有利于菌体的增殖和生长，则GA的生物合成就会受到影响，甚至停止，这在生产上，就是通常我们说的“只长菌，不产酸”的现象。
以上分析说明，GA发酵过程中，前期，菌体的增殖期，一定的量的生物素是菌体增殖所必需的；而在产物合成期，则要限制生物素的浓度，以保证产物的正常合成。
第三节 细胞膜通透性的控制
细胞膜通透性的调节对于GA 发酵时非常重要的，正如前述，当菌体进入产物合成期时，开始有GA的产生，这是如果能够大量的把产物及时的排泄到细胞膜外，可以解除GA对L—谷氨酸脱氢酶活性的抑制作用，从而使现由 GA的高效率转化，反之，如果„„。可见，改善细胞膜通透性的
重要性，如何进行呢？
一、控制细胞膜通透性的化学方法：
1、控制磷脂的合成
1）生物素缺陷型
VH对菌体细胞膜通透性的影响
通常谷氨酸发酵采用的菌种都是VH-，而VH又是菌体细胞膜合成的必须物质，因此，可以通过控制VH的浓度，来实现对菌体细胞膜通透性的调节。
VH对细胞膜合成的影响主要是通过对细胞膜的主要成分——磷脂中的脂肪酸的生物合成来实现的，当限制了菌体脂肪酸的合成时，细胞就会形成一个细胞膜不完整的菌体。生物体内脂肪酸的合成途径如下：
葡萄糖 丙酮酸 + 丙酮酸
乙酰辅酶A 乙酰辅酶Ａ
乙酰辅酶A2
2
丙二酰辅酶A
C4 丙二酰辅酶A CO2
C6
其中，将乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A的酶是乙酰辅酶A羧化酶，该酶的辅酶是VH，VH在此反应过程中起到传递CO2的作用。当培养基中VH的浓度较低时，细胞膜的合成就会受影响。
培养基中生物素限量时，胞内胞外
培养基中生物素丰富时，胞内胞外 控制关键：生物素亚适量（5-10μg/L）,因此用糖蜜作原料必须处理
2）添加表面活性剂
如吐温60或饱和脂肪酸
作用机制：在不饱和脂肪酸的合成中，作为代谢拮抗物对生物素具有拮抗作用，通过拮抗脂肪酸的生物合成，导致磷脂合成不足，形成磷脂不足的细胞膜。
控制关键：添加的时间和浓度，以完成从GA非积累型细胞向GA积累型细胞转变
3）油酸缺陷型
作用机制：切断了油酸后期合成，丧失了自身合成油酸的能力，即丧失了脂肪酸生物合成能力，必须由外界供给油酸，才能生长。油酸的含量直接影响磷脂合成的多少和细胞膜通透性。
控制关键：油酸亚适量
4）甘油缺陷型
作用机制：是丧失了α-磷酸甘油脱氢酶，不能合成α-磷酸甘油和磷脂，必须由外界供给甘油才能生长。
控制关键：甘油亚适量。
2、阻碍GA产生菌细胞壁合成
1）添加青霉素等
作用机制：添加青霉素抑制GA生产菌细胞壁后期合成，形成不完整的细胞壁，进而导致形成不完全的细胞膜。
青霉素的结构和革兰氏阳性菌的糖肽末端的结构相似，取代糖肽和酶活性中心结合，抑制糖肽转肽酶，使五肽末端丙氨酸不能被转肽酶移去，交联不能形成，网状结构连接不起来，糖肽合成不能完成，形成不完全的细胞壁，使细胞膜处于无保护状态，又由于膜内外的渗透压差，进而导致细胞膜的物理损伤，增大了GA向胞外漏出的渗透性。
控制关键：添加的添加的时间和浓度。
在增殖过程的适当时期添加，并且必须在添加后再进行一定的增殖。一般在对数生长早期添加。添加的浓度时间因菌种，接种量，培养基的组成及发酵条件而异。
2）选育二氨基庚二酸缺陷型
二氨基庚二酸是细菌细胞壁的组成成分
控制关键：限量添加二氨基庚二酸
一、控制细胞膜通透性的物理方法：
温度敏感突变株：细胞膜结构基因突变，导致酶在高温失活，细胞膜某些结构改变。
控制关键：转换温度的时机，并且温度转换之后进行适度的剩余生长。因菌种，接种量，培养基的组成及发酵条件而异。
第四节 谷氨酸生产菌的育种策略
一、选育耐高糖、高渗透压、高GA的菌株
二、切断或减弱代谢支路
1、减弱α—KGA脱氢酶活性，防止进一步氧化
E．Coli α—KGA脱氢酶渗漏突变株进行GA发酵和PEP羧化酶增强
2、选育HMP途径后段酶活性减弱突变株
3、 1）选育莽草酸缺陷型
2）抗嘌呤，嘧啶类似物突变株
3）抗核苷酸，抗生素突变株
3、选育不分解利用GA的突变株
以GA为唯一C源时菌体不生长或生长微弱
4、选育减弱DCA循环的突变株
1）选育琥珀酸敏感型突变株；琥珀酸是异柠檬酸裂解酶的阻遏物
2）选育不分解利用乙酸的突变株：必须走DCA途径
3）基因工程使异柠檬酸裂解酶活性降低
5、阻止GA进一步代谢
谷氨酰胺缺陷型或α—KGA脱氢酶缺陷
三、解除自身的反馈调节
1、选育耐高渗透压的菌株
4、选育解除GA对GDH反馈调节突变株
1）选育GA结构类似物突变株：如谷氨酸氧肟酸
2）选育耐GA突变株
3）选育抗谷氨酰胺突变株
四、增加前体物的合成
1、强化TCA循环中从Cit到α—KGA代谢突变株
1）选育柠檬酸合成酶活力强的
2）选育抗氟乙酸，氟化钠，氟柠檬酸（乌头酸酶的抑制剂）等突变株
2、选育强化CO2固定反应突变株
1）选育在琥珀酸或苹果酸为唯一C源生长快，大的菌株
以琥珀酸或苹果酸为唯一C源必须走四碳二羧酸脱羧反应，脱羧反应与CO2固定反应是相同酶催化的，脱羧反应强，CO2固定反应强。
2）选育氟丙酮酸敏感突变株
氟丙酮酸敏是丙酮酸脱氢酶系的抑制剂，及向乙酰CoA转化相对弱，CO2固定反应强。
3）选育丙氨酸，天冬氨酸缺陷型
4）克隆丙酮酸羧化酶
五、提高细胞膜通透性
1、选育溶菌酶敏感的（细胞壁网状结构疏松）
其他见第三节
六、强化能量代谢突变株
GA高产菌的特点：α—KGA继续向下氧化能力缺陷和DCA途径减弱，使能量代谢受阻，TCA循环前一段代谢减慢。强化能量代谢，可补救以上两点不足，使TCA循环代谢加强，GA合成速率加快
1、抗呼吸链抑制剂突变株：如丙二酸，氰化钾等
2、抗ADP磷酸化抑制剂突变株：如2、4二硝基酚，羟胺等
3、抗抑制能量代谢抗生素的抗性突变株：如缬氨霉素，寡霉素等
七、基因工程法
第五节 谷氨酸的发酵条件
一、原料（糖蜜）的处理
1.糖蜜的主要成分
（1） 糖，49—50%，因不同的原料和生产方法不同而异，主要是蔗糖
（2） 胶体物质，5—10%，来自于原料
（3） 灰分，10—12%
（4） 生物素，1—10mg/Kg(甘蔗)，0.04—0.06 mg/Kg(甜菜)
（5） pH值6.2(甘蔗)，7.4（甜菜）
对于发酵工业可以利用得的主要成分是：糖和生物素
2.用途
（1） 发酵工业用原料，国内发酵生产的有：味精、酵母
目前，国内酵母工业使用进口糖蜜为原料，带来了较大的工业污染，„„
（2） 使用糖蜜生产酒精
（3） 使用糖蜜生产蒸馏酒——姥姆酒，世界名酒，牙买加的国酒，在西方国家
主要用于鸡尾酒的勾兑上。
（4） 作为添加剂使用，柠檬酸发酵，作为添加剂使用。
（5） 使用糖蜜发酵生产黄源胶，已有研究报道。
3.处理方法
处理目的：
a.除去胶体性物质，降低糖蜜的粘度，提高发酵液的流动性， 有
利于改善发酵过程中氧的传递。
b.脱色，除去有色物质（有色物质的来源？），对产品的质量有影响，对微生物的生
长和代谢有影响。
c.中和过量的酸碱性物质，除去部分对pH值有影响的缓冲性物质。
方法：a.冷酸通风沉淀法，即加酸后，通风，使之沉淀
糖蜜经酸化后主要是除去糖蜜中胶体性物质，通风的目的是除去一些挥
发性物质。（教材中提到的通风是为了提高KLa是错误的）
b.加絮凝剂（PAM）
聚丙烯酰胺（ PAM）作为絮凝剂，可以促进大分子物质的沉降，有利于
糖蜜的澄清。
工艺过程：
调pH值(3—絮凝静置
絮凝剂的用量：8mg/L，静置时间：1小时
加热到90℃
C.活性炭吸附法
可以除去糖蜜中的有色物质，明显的降低糖蜜的色泽，对发酵的产品的提出和
产品质量有益。
缺点：活性炭的使用量较大，处理成本较高。
二、GA发酵条件的控制
GA发酵的外在因素：
GA发酵是一个典型的代谢控制发酵，固然有其内在的菌体特性，诸如：？（提问），但是正如任何事物发展的基本规律一样，外在因素仍然有重要的作用，对于GA的发酵也是一样。
1、供氧含量
通气不足 适中 通气过量（如转速过快）
乳酸或琥珀酸 GA α-KGA
GA形成期比菌体增殖期需要量高
过量：NADPH的再氧化能力会加强，使α—KGA的还原氨基化受到影响，不利于GA
的生成。
供氧不足：积累大量的乳酸，使发酵液的pH值下降，不利于GA的产生，同时，一部分葡萄糖转成了乳酸，影响了糖酸转化率，降低了产物的提出率。
氨基酸合成中有关供氧的问题：
1）经过好气性的能量代谢可以有效的获得菌体生长和氨基酸生物合成所需的ATP
2）氨基酸生物合成中产生的NAD（P）H2在需氧下被氧化成NAD（P）
因此氨基酸生物合成过程中所消耗的ATPmol数和生成的NAD（P）H2mol数不同，所需的氧就不同。
例 DCA循环 CO2固定
GA NAD（P）H2 ( .FAD.2H ) ATP NAD（P）H2 (.FAD.2H ) ATP
5-1/3 2 3 1
GA生物合成，不管是经过DCA循环还是经过PEP羧化生成草酰乙酸，生成的NAD（P）H2都多，因此氧化NAD（P）H2的需氧量也多。
当供氧不足时转入厌氧发酵，丙酮酸被NADH还原成大量乳酸，氧不足，使TCA各步脱氢酶受阻，DCA循环主导，积累琥珀酸。
供氧过大，NADPH2更多进入呼吸链氧化，α-KGA不可能被氨基还原
补充
1.影响了菌系的酶活性
在微生物的代谢过程中，有许多的催化脱氢氧化反应的酶都是以NAD(P)为辅酶的，NAD(P)的浓度是保证酶活力的基础。NAD(P)作为H的受体，脱氢后成为还原兴的NAD(P)H，NAD(P)H只有在有氧的的条件下可以及时地通过呼吸链被氧化（个别情况，NAD(P)H可以参入还原反应，比如：α—KGA的还原氨基化„„），生成氧化性的NAD(P)，NAD(P)作为辅酶重新参入脱氢反应，一旦，发酵液中的氧的浓度不够，则与NAD(P)相关的酶促反应停止，那么，NAD(P)的浓度„„。
2.氧的存在影响了代谢途径
氧存在是TCA循环能够进行的基础，缺氧必然导致丙酮酸的积累（丙酮酸的氧化脱羧强烈徐扬），丙酮酸的积累，导致乳酸的形成；其结果是发酵液的PH值不降；通常，当Broth的溶氧急剧下降时，意味着菌体进入了对数生长期或产物合成期，这时，往往伴随的是发酵液的PH值下降。
虽然，大多是情况下，氧可能成为发酵的限制性因子，但是，在有的情况下，也并不是溶氧越高越好。
例如：
1在GA发酵的GA合成期（中后期）○，过量的供氧会使NADPH进入呼吸链被氧化，减少
了NADPH的浓度，而NADPH与а-KGA的还原氨基
化是相偶联的，这必然会影响а-KGA GA
2、NH4+浓度
GA的氨基来自NH4+，产酸期需氮量比菌体生长期高
NH4+缺乏 NH4+适量 NH4+过量
α-KGA GA 谷氨酰氨
（1）影响到发酵液的pH值
（2）与产物的形成有关：
过低，不利于α—KGA的还原氨基化
过高，产生固安酰胺（？，缺点？）
NH4+的供给方式：
（1）液氨
（2）流加尿素，条件和优缺点？
副反应：
3、磷酸盐（＜0.2%）
过量：（1）促进EMP途径，打破EMP与TCA之间的平衡，积累丙酮酸，产生乳
酸等„„
（2）产生并积累Val，
途径如下：
丙酮酸 + 丙酮酸
（焦磷酸硫胺素，TPP）
α
Val
Val（1）可以抑制葡萄糖 丙酮酸，使GA的生物合成受到阻止
（2）消耗了丙酮酸，降低了糖酸转化率
（3）发酵液中的Val存在，严重的影响GA 的结晶、提出。
4、温度的影响
37℃ 30℃
乳酸 GA
高温时，葡萄糖酵解（氧化）速度比丙酮酸快2-3倍，丙酮酸积累被NADH还原乳酸
5、生物素的影响
生物素缺乏 生物素亚适量 生物素过量
GA合成下降，菌体生长不好 GA 乳酸
原理同温度
6、PH的影响
酸性，PH5-5.8，NH4+过多 中性或微碱性（7.0-8.0）
Gln,N-乙酰谷氨酰胺 GA
GHD最适PH是7.0-7.2，生长期PH偏低
控制谷氨酸发酵的关键在于：
(1)完全氧化能力降低 控制生物素亚适量，丙酮酸氧化力减弱，CO2固定反应增
加，乙醛酸循环减弱，产酸期间几乎没有异柠檬酸裂解酶，加之琥珀酸氧化力微弱，脱镇反应停溉在铁离子适宜条件下，大坦生成积累谷氨酸。反之，倾向于完全氧化。
(2)蛋白质合成能力降低 在生物素贫乏条件F，“—酮戊二酸、谷氨酸分解力微弱，完全氧化减少，三磷酸腺苷 (ATP)的生成量减少，能荷降低，致使蛋白质合成活动停滞。
(3)增加细胞膜对谷昆酸的渗透性 这是最关键的控制机制。以糖质为原料发酵生产谷氨酸时，控制生物素亚适量；若生物素过量时，应添加表面活性剂、饱和脂肪破或青霉素等；如果使用泊酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，就控制有油酸亚适量；倘若 使用甘油缺陷型菌株发酵生产谷氨酸，那么不管是用醋酸、正石蜡或榴质原料，也不管是添加或不加生物索、油酸、硫胺索等牧质，只要控制添加限量的甘油或甘油伤生物，都能高产谷氨酸。这是因为通过限制甘油，控制了磷脂合成，使磷脂合成量减少朗 结果(见表3—3、表3—4、表3—5)。所以作用机制都是直接或间接地控制磷脂的生物
合成，降低细胞内的磷脂含量，以致影响细胞膜的组成，使细胞膜对谷氨酸的渗透性增大，从而引起谷氨酸由向细胞膜外渗透。由于谷氨酸向外渗透，胞内浓度降低，又有本 子反应向合成谷氨酸的方向进行，不断地合成，又不断地向外渗透，使谷氨酸得以大量积累。
§第六章 谷氨酸的发酵机制
GA发酵作为重点：（1）是代谢控制发酵的重点
（2）是目前代谢控制发酵中，在理论与实践上最成熟的„„
第一节 GA的生物合成途径
一、GA 的生物合成途径 的酵解，EMP
的有氧氧化，HMP
丙酮酸的有氧氧化，TCA循环
乙醛酸循环途径，DCA循环
CO2固定反应
α-酮戊二酸的还原氨基化
这6条途径之间是相互联系和相互制约的，如图所示：
主导反应: GHD
α-KGA+NH4++NADPH2 GA+H2O+NADP
C6H12O6
HMP
3-
乳酸 丙 酮 酸 乙酰辅酶A
CO2 CO2
草酰乙酸 柠 檬 酸
苹果酸
异柠檬酸
延胡索酸
CO2
琥珀酸
α—KGA
NADPH
NH4+ NADP
谷氨酸
第二节 GA生物合成的调节机制
一、优先合成与反馈调节
1、优先合成
1）优先合成（perference synthesis）
D→E
a酶活性远大于b酶活性
GA 比Asp优先合成，GA过量后，阻遏和抑制自身的合成途径，使代谢转向Asp
2、CO2固定反应的酶类受Asp的反馈抑制，GA 和Asp的反馈阻遏
3、α—KGA脱氢酶在GA生产菌中先天丧失或微弱
4、柠檬酸合成酶（TCA关键酶）：受能荷调节和GA的反馈阻遏和乌头酸的反馈抑制
5、GDH（谷氨酸脱氢酶）受GA的反馈抑制和阻遏
6、异柠檬酸脱氢酶：受α—KGA的反馈抑制。
异柠檬酸脱氢酶催化的异柠檬酸脱羧生成α—KGA和谷氨酸脱氢酶催化的α—KGA还原氨基话生成的GA的反应是一对氧化还原共轭反应，细胞内α—KGA和异柠檬酸的量需维持平衡，当α—KGA过量时对异柠檬酸脱氢酶发生抑制作用，停止合成α—KGA
由菌体的代谢可知，在正常情况下，GA并不积累。
二、GA生物合成的内在因素
从上图可以看出，菌体要在葡萄糖含量10%以上的培养基上，合成5%以上的谷氨酸，是一种不正常的现象，显然GA产生菌必须具备以下条件：
1.α—KGA脱氢酶酶活性微弱或丧失
这是菌体生成并积累α—KGA的关键，从上图可以看出，α—KGA是菌体
进行TCA循环的中间性产物，很快在α—KGA脱氢酶的作用下氧化脱羧生成琥珀酸辅酶A，在正常的微生物体内他的浓度很低，也就是说，由α—KGA进行还原氨基化生成GA的可能性很少。只有当体内α—KGA脱氢酶活性很低时，TCA循环才能够停止，α—KGA才得以积累。
例：不要求生物素的一株丧失α—KGA脱氢酶的大肠杆菌突变株，分泌23.3g/LGA
2.GA产生菌体内的NADPH的在氧化能力欠缺或丧失
（1）如上图所示，NADPH是α—KGA还原氨基化生成GA必须物质，而且该还
原氨基化所需要的NADPH是与柠檬酸氧化脱羧相偶联 的。
（2）由于NADPH的在氧化能力欠缺或丧失，使得体内的NADPH有一定的积累，
NADPH对于抑制α—KGA的脱羧氧化有一定的意义。
3.产生菌体内必须有乙醛酸循环（DCA）的关键酶——异柠檬酸裂解酶。
该酶是一种调节酶，或称为别构酶，其活性可以通过某种方式进行调节，通过该酶酶活性的调节来实现DCA循环的封闭，DCA 循环的封闭是实现GA 发酵的首要条件。关于该酶的酶活性的调节后述。
4、.菌体有强烈的L—谷氨酸脱氢酶活性
α—KGA + NH4+
L—谷氨酸脱氢酶，实质上产生菌体内该酶的酶活性都很强
该反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联，反应机制如下：
α—KGA NADPH α—KGA
GA NADP 异柠檬酸
三、GA 生物合成的最理想途径
上述涉及到的GA生物合成途径很多，那GA 生物合成由哪几条途径合成是最为理想的呢？
通过比较来说明这一问题：
1、EMP和HMP途径
生物素充足菌（生长期）：HMP，38% 生物素缺乏菌（产酸期）：HMP，26%
2、CO2固定
在前述GA 合成所必需的条件的基础上（„„，封闭乙醛酸循环）体系不存在CO2固定反应，则有：
3/2丙酮酸 + 丙酮酸 +
丙酮酸
CO2
乙酰辅酶A + 乙酰辅酶A + 乙酰辅酶A
DCA循环封闭）
谷氨酸
则有：
3/2 C6H12O6 + NH4+ == C5H9O4 + 4 CO2 （来自何方？提问）
产率：147 /（180*3/2） == 54.4%
2.在前述GA 合成所必需的条件的基础上（„„，封闭乙醛酸循环）存在CO2固定反应，则有：
+ 丙酮酸
CO2
CO2
草酰乙酸
（草酰乙酸
羧化酶）
乙酰辅酶A + C4二羧酸
苹果酸
（苹果酸激酶）
柠檬酸（DCA循环封闭）
则有： 谷氨酸
C6H12O6 + NH4+ == C5H9O4 + CO2 （来自何方？提问）
产率：147 / 180 == 81.7%
可见，在GA的生物合成过程中，CO2固定反应对于产率的提高有着多么重要的作用。
在许多微生物发酵的过程中，通常需要检测反应器尾气的组成，特别是尾气中CO2的含量，其主要目的就在于分析产物合成期间菌体的代谢途径，有利于指导生产。
在GA产生菌菌体内CO2固定反应有以下两条途径：
（1）磷酸丙酮酸羧化酶的作用下
磷酸丙酮酸 + CO2 + GTP == 草酰乙酸 + GDP
(2) 苹果酸合成酶的作用下
丙酮酸 + CO2 +NADH === 苹果酸 + NAD
需要+做催化剂，所以，在GA发酵过程中需要向培养基中补充Mn+
实际上，发酵过程中不可能控制柠檬酸合成所需的C4二羧酸完全来自于CO2固定反应，体系也不可能完全不存在CO2固定反应，因此，GA 发酵的糖酸转化率应在：54.4%——81.7%。目前，国内的GA生产企业的糖酸转化率通常都在50%以内：
（1）企业计算的糖酸转化率是把GA 发酵前期菌体增殖时期消耗的葡萄糖计算在内，而我们所计算的不包括这一部分葡萄糖，通常这一部分糖占总量的20%左右，当然与企业的技术水平有关。
（2）TCA 循环也不可能完全封闭；α—KGA也不可能完全转化为GA；生成的GA也不可能完全分泌的细胞外；发酵液中还存在一定的残糖，通常在0.5%——0.7%之间。
无论如何，提高GA的潜力仍然是很大的，具体表现在：
（1）强化CO2固定反应，具体措施：Mn+，生物素？
（2）控制溶氧浓度是非常重要的
低的溶氧浓度，则丙酮酸向乳酸方向转化„„
高的溶氧浓度，则NADPH 有被氧化的可能，„„
3、TCA循环和DCA循环
四、生物素对GA发酵的影响
GA 产生菌大都是生物素的营养缺陷型，即：VH-，在发酵过程中要严格控制其浓度，主要是生物素对发酵的影响是全面的，分述如下：
1.生物素对糖代谢的影响
一方面，VH对于糖酵解有促进作用，对丙酮酸的有氧氧化——乙酰辅酶A的生成也有促进作用，但两者的促进作用不一样，对前者大一些，这样培养基中如果有较丰富的VH，就会打破糖酵解与丙酮酸氧化之间的平衡，导致丙酮酸的积累，丙酮酸积累则可能导致乳酸的形成，乳酸声称，则使得碳源利用率降低，而且带来的是发酵液的pH值下降。
另一方面，可以通过控制VH的浓度，以实现对于乙醛酸循环的封闭。前述，封闭乙醛酸循环对于GA发酵的重要性，那么，如何封闭乙醛酸循环呢？
DCA循环的关键酶是异柠檬酸裂解酶，研究表明，该酶受以下几个因素的影响： 为醋酸诱导
受琥珀酸的阻遏，其活性受琥珀酸的抑制
（受到Glucose的阻遏？）
这样，当VH缺乏时：
（1）丙酮酸的有氧氧化就会减弱(由于VH对TCA循环的促进作用)，则：乙酰辅酶A
的生成量就会少，醋酸浓度降低，它的诱导作用降低；
（2）VH对TCA循环的促进作用的降低，使得其中间产物琥珀酸的氧化速度降低，
其浓度得到积累，这样它的阻遏和抑制作用加强；
两者综合的作用使得，异柠檬酸裂解酶的活性丧失，DCA循环得到封闭。
2.生物素对氮代谢的影响
由以上分析可知，当VH缺乏时，异柠檬酸裂解酶的活性减弱，那么相反，当VH丰富时，异柠檬酸裂解酶的活性必然加强，则DCA 循环正常进行，DCA循环的进行，一方面提供了大量的“中间性产物”，另一方面，菌体的能和水平得到提高。前者是菌体增殖的物质基础，后者则是菌体增殖的能量的保证。这样的结果是，有利于菌体的增殖和生长，则GA的生物合成就会受到影响，甚至停止，这在生产上，就是通常我们说的“只长菌，不产酸”的现象。
以上分析说明，GA发酵过程中，前期，菌体的增殖期，一定的量的生物素是菌体增殖所必需的；而在产物合成期，则要限制生物素的浓度，以保证产物的正常合成。
第三节 细胞膜通透性的控制
细胞膜通透性的调节对于GA 发酵时非常重要的，正如前述，当菌体进入产物合成期时，开始有GA的产生，这是如果能够大量的把产物及时的排泄到细胞膜外，可以解除GA对L—谷氨酸脱氢酶活性的抑制作用，从而使现由 GA的高效率转化，反之，如果„„。可见，改善细胞膜通透性的
重要性，如何进行呢？
一、控制细胞膜通透性的化学方法：
1、控制磷脂的合成
1）生物素缺陷型
VH对菌体细胞膜通透性的影响
通常谷氨酸发酵采用的菌种都是VH-，而VH又是菌体细胞膜合成的必须物质，因此，可以通过控制VH的浓度，来实现对菌体细胞膜通透性的调节。
VH对细胞膜合成的影响主要是通过对细胞膜的主要成分——磷脂中的脂肪酸的生物合成来实现的，当限制了菌体脂肪酸的合成时，细胞就会形成一个细胞膜不完整的菌体。生物体内脂肪酸的合成途径如下：
葡萄糖 丙酮酸 + 丙酮酸
乙酰辅酶A 乙酰辅酶Ａ
乙酰辅酶A2
2
丙二酰辅酶A
C4 丙二酰辅酶A CO2
C6
其中，将乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A的酶是乙酰辅酶A羧化酶，该酶的辅酶是VH，VH在此反应过程中起到传递CO2的作用。当培养基中VH的浓度较低时，细胞膜的合成就会受影响。
培养基中生物素限量时，胞内胞外
培养基中生物素丰富时，胞内胞外 控制关键：生物素亚适量（5-10μg/L）,因此用糖蜜作原料必须处理
2）添加表面活性剂
如吐温60或饱和脂肪酸
作用机制：在不饱和脂肪酸的合成中，作为代谢拮抗物对生物素具有拮抗作用，通过拮抗脂肪酸的生物合成，导致磷脂合成不足，形成磷脂不足的细胞膜。
控制关键：添加的时间和浓度，以完成从GA非积累型细胞向GA积累型细胞转变
3）油酸缺陷型
作用机制：切断了油酸后期合成，丧失了自身合成油酸的能力，即丧失了脂肪酸生物合成能力，必须由外界供给油酸，才能生长。油酸的含量直接影响磷脂合成的多少和细胞膜通透性。
控制关键：油酸亚适量
4）甘油缺陷型
作用机制：是丧失了α-磷酸甘油脱氢酶，不能合成α-磷酸甘油和磷脂，必须由外界供给甘油才能生长。
控制关键：甘油亚适量。
2、阻碍GA产生菌细胞壁合成
1）添加青霉素等
作用机制：添加青霉素抑制GA生产菌细胞壁后期合成，形成不完整的细胞壁，进而导致形成不完全的细胞膜。
青霉素的结构和革兰氏阳性菌的糖肽末端的结构相似，取代糖肽和酶活性中心结合，抑制糖肽转肽酶，使五肽末端丙氨酸不能被转肽酶移去，交联不能形成，网状结构连接不起来，糖肽合成不能完成，形成不完全的细胞壁，使细胞膜处于无保护状态，又由于膜内外的渗透压差，进而导致细胞膜的物理损伤，增大了GA向胞外漏出的渗透性。
控制关键：添加的添加的时间和浓度。
在增殖过程的适当时期添加，并且必须在添加后再进行一定的增殖。一般在对数生长早期添加。添加的浓度时间因菌种，接种量，培养基的组成及发酵条件而异。
2）选育二氨基庚二酸缺陷型
二氨基庚二酸是细菌细胞壁的组成成分
控制关键：限量添加二氨基庚二酸
一、控制细胞膜通透性的物理方法：
温度敏感突变株：细胞膜结构基因突变，导致酶在高温失活，细胞膜某些结构改变。
控制关键：转换温度的时机，并且温度转换之后进行适度的剩余生长。因菌种，接种量，培养基的组成及发酵条件而异。
第四节 谷氨酸生产菌的育种策略
一、选育耐高糖、高渗透压、高GA的菌株
二、切断或减弱代谢支路
1、减弱α—KGA脱氢酶活性，防止进一步氧化
E．Coli α—KGA脱氢酶渗漏突变株进行GA发酵和PEP羧化酶增强
2、选育HMP途径后段酶活性减弱突变株
3、 1）选育莽草酸缺陷型
2）抗嘌呤，嘧啶类似物突变株
3）抗核苷酸，抗生素突变株
3、选育不分解利用GA的突变株
以GA为唯一C源时菌体不生长或生长微弱
4、选育减弱DCA循环的突变株
1）选育琥珀酸敏感型突变株；琥珀酸是异柠檬酸裂解酶的阻遏物
2）选育不分解利用乙酸的突变株：必须走DCA途径
3）基因工程使异柠檬酸裂解酶活性降低
5、阻止GA进一步代谢
谷氨酰胺缺陷型或α—KGA脱氢酶缺陷
三、解除自身的反馈调节
1、选育耐高渗透压的菌株
4、选育解除GA对GDH反馈调节突变株
1）选育GA结构类似物突变株：如谷氨酸氧肟酸
2）选育耐GA突变株
3）选育抗谷氨酰胺突变株
四、增加前体物的合成
1、强化TCA循环中从Cit到α—KGA代谢突变株
1）选育柠檬酸合成酶活力强的
2）选育抗氟乙酸，氟化钠，氟柠檬酸（乌头酸酶的抑制剂）等突变株
2、选育强化CO2固定反应突变株
1）选育在琥珀酸或苹果酸为唯一C源生长快，大的菌株
以琥珀酸或苹果酸为唯一C源必须走四碳二羧酸脱羧反应，脱羧反应与CO2固定反应是相同酶催化的，脱羧反应强，CO2固定反应强。
2）选育氟丙酮酸敏感突变株
氟丙酮酸敏是丙酮酸脱氢酶系的抑制剂，及向乙酰CoA转化相对弱，CO2固定反应强。
3）选育丙氨酸，天冬氨酸缺陷型
4）克隆丙酮酸羧化酶
五、提高细胞膜通透性
1、选育溶菌酶敏感的（细胞壁网状结构疏松）
其他见第三节
六、强化能量代谢突变株
GA高产菌的特点：α—KGA继续向下氧化能力缺陷和DCA途径减弱，使能量代谢受阻，TCA循环前一段代谢减慢。强化能量代谢，可补救以上两点不足，使TCA循环代谢加强，GA合成速率加快
1、抗呼吸链抑制剂突变株：如丙二酸，氰化钾等
2、抗ADP磷酸化抑制剂突变株：如2、4二硝基酚，羟胺等
3、抗抑制能量代谢抗生素的抗性突变株：如缬氨霉素，寡霉素等
七、基因工程法
第五节 谷氨酸的发酵条件
一、原料（糖蜜）的处理
1.糖蜜的主要成分
（1） 糖，49—50%，因不同的原料和生产方法不同而异，主要是蔗糖
（2） 胶体物质，5—10%，来自于原料
（3） 灰分，10—12%
（4） 生物素，1—10mg/Kg(甘蔗)，0.04—0.06 mg/Kg(甜菜)
（5） pH值6.2(甘蔗)，7.4（甜菜）
对于发酵工业可以利用得的主要成分是：糖和生物素
2.用途
（1） 发酵工业用原料，国内发酵生产的有：味精、酵母
目前，国内酵母工业使用进口糖蜜为原料，带来了较大的工业污染，„„
（2） 使用糖蜜生产酒精
（3） 使用糖蜜生产蒸馏酒——姥姆酒，世界名酒，牙买加的国酒，在西方国家
主要用于鸡尾酒的勾兑上。
（4） 作为添加剂使用，柠檬酸发酵，作为添加剂使用。
（5） 使用糖蜜发酵生产黄源胶，已有研究报道。
3.处理方法
处理目的：
a.除去胶体性物质，降低糖蜜的粘度，提高发酵液的流动性， 有
利于改善发酵过程中氧的传递。
b.脱色，除去有色物质（有色物质的来源？），对产品的质量有影响，对微生物的生
长和代谢有影响。
c.中和过量的酸碱性物质，除去部分对pH值有影响的缓冲性物质。
方法：a.冷酸通风沉淀法，即加酸后，通风，使之沉淀
糖蜜经酸化后主要是除去糖蜜中胶体性物质，通风的目的是除去一些挥
发性物质。（教材中提到的通风是为了提高KLa是错误的）
b.加絮凝剂（PAM）
聚丙烯酰胺（ PAM）作为絮凝剂，可以促进大分子物质的沉降，有利于
糖蜜的澄清。
工艺过程：
调pH值(3—絮凝静置
絮凝剂的用量：8mg/L，静置时间：1小时
加热到90℃
C.活性炭吸附法
可以除去糖蜜中的有色物质，明显的降低糖蜜的色泽，对发酵的产品的提出和
产品质量有益。
缺点：活性炭的使用量较大，处理成本较高。
二、GA发酵条件的控制
GA发酵的外在因素：
GA发酵是一个典型的代谢控制发酵，固然有其内在的菌体特性，诸如：？（提问），但是正如任何事物发展的基本规律一样，外在因素仍然有重要的作用，对于GA的发酵也是一样。
1、供氧含量
通气不足 适中 通气过量（如转速过快）
乳酸或琥珀酸 GA α-KGA
GA形成期比菌体增殖期需要量高
过量：NADPH的再氧化能力会加强，使α—KGA的还原氨基化受到影响，不利于GA
的生成。
供氧不足：积累大量的乳酸，使发酵液的pH值下降，不利于GA的产生，同时，一部分葡萄糖转成了乳酸，影响了糖酸转化率，降低了产物的提出率。
氨基酸合成中有关供氧的问题：
1）经过好气性的能量代谢可以有效的获得菌体生长和氨基酸生物合成所需的ATP
2）氨基酸生物合成中产生的NAD（P）H2在需氧下被氧化成NAD（P）
因此氨基酸生物合成过程中所消耗的ATPmol数和生成的NAD（P）H2mol数不同，所需的氧就不同。
例 DCA循环 CO2固定
GA NAD（P）H2 ( .FAD.2H ) ATP NAD（P）H2 (.FAD.2H ) ATP
5-1/3 2 3 1
GA生物合成，不管是经过DCA循环还是经过PEP羧化生成草酰乙酸，生成的NAD（P）H2都多，因此氧化NAD（P）H2的需氧量也多。
当供氧不足时转入厌氧发酵，丙酮酸被NADH还原成大量乳酸，氧不足，使TCA各步脱氢酶受阻，DCA循环主导，积累琥珀酸。
供氧过大，NADPH2更多进入呼吸链氧化，α-KGA不可能被氨基还原
补充
1.影响了菌系的酶活性
在微生物的代谢过程中，有许多的催化脱氢氧化反应的酶都是以NAD(P)为辅酶的，NAD(P)的浓度是保证酶活力的基础。NAD(P)作为H的受体，脱氢后成为还原兴的NAD(P)H，NAD(P)H只有在有氧的的条件下可以及时地通过呼吸链被氧化（个别情况，NAD(P)H可以参入还原反应，比如：α—KGA的还原氨基化„„），生成氧化性的NAD(P)，NAD(P)作为辅酶重新参入脱氢反应，一旦，发酵液中的氧的浓度不够，则与NAD(P)相关的酶促反应停止，那么，NAD(P)的浓度„„。
2.氧的存在影响了代谢途径
氧存在是TCA循环能够进行的基础，缺氧必然导致丙酮酸的积累（丙酮酸的氧化脱羧强烈徐扬），丙酮酸的积累，导致乳酸的形成；其结果是发酵液的PH值不降；通常，当Broth的溶氧急剧下降时，意味着菌体进入了对数生长期或产物合成期，这时，往往伴随的是发酵液的PH值下降。
虽然，大多是情况下，氧可能成为发酵的限制性因子，但是，在有的情况下，也并不是溶氧越高越好。
例如：
1在GA发酵的GA合成期（中后期）○，过量的供氧会使NADPH进入呼吸链被氧化，减少
了NADPH的浓度，而NADPH与а-KGA的还原氨基
化是相偶联的，这必然会影响а-KGA GA
2、NH4+浓度
GA的氨基来自NH4+，产酸期需氮量比菌体生长期高
NH4+缺乏 NH4+适量 NH4+过量
α-KGA GA 谷氨酰氨
（1）影响到发酵液的pH值
（2）与产物的形成有关：
过低，不利于α—KGA的还原氨基化
过高，产生固安酰胺（？，缺点？）
NH4+的供给方式：
（1）液氨
（2）流加尿素，条件和优缺点？
副反应：
3、磷酸盐（＜0.2%）
过量：（1）促进EMP途径，打破EMP与TCA之间的平衡，积累丙酮酸，产生乳
酸等„„
（2）产生并积累Val，
途径如下：
丙酮酸 + 丙酮酸
（焦磷酸硫胺素，TPP）
α
Val
Val（1）可以抑制葡萄糖 丙酮酸，使GA的生物合成受到阻止
（2）消耗了丙酮酸，降低了糖酸转化率
（3）发酵液中的Val存在，严重的影响GA 的结晶、提出。
4、温度的影响
37℃ 30℃
乳酸 GA
高温时，葡萄糖酵解（氧化）速度比丙酮酸快2-3倍，丙酮酸积累被NADH还原乳酸
5、生物素的影响
生物素缺乏 生物素亚适量 生物素过量
GA合成下降，菌体生长不好 GA 乳酸
原理同温度
6、PH的影响
酸性，PH5-5.8，NH4+过多 中性或微碱性（7.0-8.0）
Gln,N-乙酰谷氨酰胺 GA
GHD最适PH是7.0-7.2，生长期PH偏低
控制谷氨酸发酵的关键在于：
(1)完全氧化能力降低 控制生物素亚适量，丙酮酸氧化力减弱，CO2固定反应增
加，乙醛酸循环减弱，产酸期间几乎没有异柠檬酸裂解酶，加之琥珀酸氧化力微弱，脱镇反应停溉在铁离子适宜条件下，大坦生成积累谷氨酸。反之，倾向于完全氧化。
(2)蛋白质合成能力降低 在生物素贫乏条件F，“—酮戊二酸、谷氨酸分解力微弱，完全氧化减少，三磷酸腺苷 (ATP)的生成量减少，能荷降低，致使蛋白质合成活动停滞。
(3)增加细胞膜对谷昆酸的渗透性 这是最关键的控制机制。以糖质为原料发酵生产谷氨酸时，控制生物素亚适量；若生物素过量时，应添加表面活性剂、饱和脂肪破或青霉素等；如果使用泊酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，就控制有油酸亚适量；倘若 使用甘油缺陷型菌株发酵生产谷氨酸，那么不管是用醋酸、正石蜡或榴质原料，也不管是添加或不加生物索、油酸、硫胺索等牧质，只要控制添加限量的甘油或甘油伤生物，都能高产谷氨酸。这是因为通过限制甘油，控制了磷脂合成，使磷脂合成量减少朗 结果(见表3—3、表3—4、表3—5)。所以作用机制都是直接或间接地控制磷脂的生物
合成，降低细胞内的磷脂含量，以致影响细胞膜的组成，使细胞膜对谷氨酸的渗透性增大，从而引起谷氨酸由向细胞膜外渗透。由于谷氨酸向外渗透，胞内浓度降低，又有本 子反应向合成谷氨酸的方向进行，不断地合成，又不断地向外渗透，使谷氨酸得以大量积累。